MKK remercie d&#39;ingénierie du Royaume-Uni et des sciences physiques Research Council (EPSRC) programme Life Sciences interface pour une bourse personnelle. Nous tenons également à souligner l&#39;aide de la biotechnologie du Royaume-Uni et en sciences biologiques du Conseil de recherches (BBSRC).

Les protocoles de préparation des échantillons FLIM ne diffèrent pas de ceux pour confocale ou à champ large fondé sur l&#39;intensité de microscopie par fluorescence. L&#39;acquisition de données est suivie par la tâche principale de l&#39;analyse des données, soit l&#39;extraction des durées de vie de fluorescence à partir des données brutes. Une fois ceux-ci ont été obtenus, l&#39;interprétation des données permet de vérifier ou de falsifier des hypothèses. 1. Cellules présentant une coloration avec des rotors moléculaires <ol><li> Préparer une solution mère (10 ml) en dissolvant environ 1 mg / ml du colorant dans un solvant approprié (par exemple le méthanol pour BODIPY-C 12) 6,7 en utilisant une balance de précision et d&#39;une pipette. </li><li> Les cellules d&#39;une lignée cellulaire (modèle de cancer, HeLa, dans notre cas) pour être colorés sont cultivées dans une plaque multipuits avec un dessous coverslide pour la microscopie, dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de CO 2 5% jusqu&#39;à ~ 80% de confluence . </li><li> Ajouter 10 à 20 pl de la solution stock à des cellules vivantes en croissance dans un environnement multi-welplaque de l (SmartSlide 50 micro-incubation système, WaferGen) dans 4 ml de milieu Opti-MEM (GIBCO) par puits d&#39;une plaque à 6 puits. Cela donne une concentration de colorant micro-molaire dans le puits. </li><li> Retour de la plaque multi-puits dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de CO 2 5% pour les 10-45 minutes pour la coloration. </li><li> Retirer la plaque multipuits de l&#39;incubateur et laver les cellules 3-4 fois avec 4 ml milieu de culture cellulaire optiquement clair (par exemple Opti-MEM) pour enlever l&#39;excédent de teinture. </li><li> Transférer la plaque multipuits de la platine du microscope et se connecter à un contrôleur de température / 5% d&#39;entrée de gaz CO 2, au besoin, dans la préparation pour l&#39;imagerie. </li></ol> 2. FLIM des fluorescents rotors moléculaires dans les cellules <ol><li> Placer l&#39;échantillon sur la platine du microscope et obtenir une image de fluorescence de transmission et pour identifier des cellules fluorescentes. Un schéma de principe du montage expérimental est représenté sur la figure. 1.Verify que les émane de fluorescence de l&#39;expé endroitsDECT (par exemple la membrane cellulaire, le cytoplasme). Obtenir un spectre d&#39;émission de fluorescence, et de vérifier qu&#39;il est celle du colorant ou de la protéine prévu, dans ce cas le spectre du rotor moléculaire. Comme un contrôle négatif, l&#39;image d&#39;un échantillon non-teinté et vérifier qu&#39;il ne montre aucune fluorescence. Bien que cette étape n&#39;est pas essentielle spécifiquement pour FLIM, il est de bonne pratique en général et ne permettra de vérifier que l&#39;échantillon est ce que vous pensez qu&#39;elle est. </li><li> Passez en mode FLIM - ceci est facilement accompli en déplaçant un miroir sur le trajet du faisceau de détection de fluorescence («externe détecteur&quot; sur &quot;chemin réglage du faisceau&quot; panneau sur le logiciel Leica TCS SP2 de contrôle d&#39;acquisition). Un filtre à l&#39;émission de fluorescence appropriée pour bloquer toute lumière excitatrice d&#39;atteindre le détecteur doit être dans le beampath détection par fluorescence. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> Figure 1. Dispositif expérimental pour le domaine temporel FLIM utilisant du courant alternatiflaser onfocal microscope à balayage. <ol start="3"><li> Numérisation de l&#39;échantillon et de vérifier, sur l&#39;ordinateur de contrôle de l&#39;acquisition FLIM, que le taux de comptage de détecteur (barre noire marquée CFD sur les logiciels de contrôle d&#39;acquisition de l&#39;Becker &amp; Hickl CPS 830 conseil d&#39;administration) n&#39;est pas supérieure à environ 1% du taux de répétition des impulsions laser ( barre verte marquée logiciel de synchronisation de contrôle d&#39;acquisition). Si c&#39;est le cas, de réduire l&#39;intensité d&#39;excitation laser, par exemple en plaçant un filtre de densité neutre dans la trajectoire du faisceau laser, afin d&#39;éviter la collecte de pile-up déformées courbes de décroissance de fluorescence. </li><li> Acquérir une image FLIM, généralement pendant 3-5 min, arrêter le balayage et enregistrer les données brutes (en 3D des données «cube» composé de coordonnées spatiales x et y, et le temps). </li><li> Ouvrez les données brutes dans le progiciel désintégration analyse par fluorescence, par exemple TRI-2 14 ou d&#39;un logiciel commercial, pour afficher l&#39;image d&#39;intensité de fluorescence. C&#39;est tout simplement la désintégration de fluorescence intégré, c&#39;est à dire l&#39;aire sous la courbe de décroissance de la fluorescence, dans chaquepixel. </li><li> Sélectionnez un pixel typique en plaçant le curseur sur elle, et d&#39;inspecter l&#39;décroissance de la fluorescence dans ce pixel. Si le nombre maximum est inférieur à 100, utilisez binning spatiale des pixels. Les chiffres de pixels adjacents (par exemple 3x3 ou 5x5), on ajoute dans le pixel central, de sorte qu&#39;un nombre supérieur de crête est obtenu. Cela donne une plus grande précision statistique pour l&#39;étape suivante. Sinon, la mesure pourrait être répétée pour un plus long temps d&#39;acquisition (étape 5). Pour 30-50min, un décompte d&#39;environ 10 fois plus élevé de pointe (et le compte total) est obtenu, mais cela est loin trop longtemps un temps d&#39;acquisition pour la plupart des échantillons biologiques en raison du danger d&#39;introduire des artefacts dus au mouvement de l&#39;échantillon, la dérive du microscope, la phototoxicité et photoblanchiment. </li><li> Sélectionnez une valeur de pixel mondiale de seuil (au-dessus duquel la désintégration d&#39;un pixel est équipé) et d&#39;appliquer un ajustement décroissance exponentielle simple à l&#39;image. Le résultat donne une durée de vie de fluorescence pour chaque pixel au-dessus du seuil, qui est ensuite codées danscouleur. Chaque pixel est coloré avec le résultat de l&#39;ajustement, et une carte FLIM est obtenu. Vérifiez les réduits du chi-carré des valeurs pour différents pixels - autour de 1 (et jusqu&#39;à 1,3) indique un bon ajustement. Inspectez les résidus correspondants, ce qui devrait être répartis de façon aléatoire autour de zéro. </li><li> Les parcelles de fluorescence histogramme vie combien de fois certains se produisent de vie de fluorescence par rapport à la durée de vie de fluorescence elle-même. Ajuster la gamme de couleurs de telle sorte que la distribution de vie de fluorescence s&#39;insère dans la gamme de couleurs. </li><li> Si un ajustement monoexponentielle ne donne pas une valeur du chi-carré de l&#39;ordre de 1 (et jusqu&#39;à 1.3), et il ya un écart systématique des résidus à partir de zéro, un modèle plus sophistiqué est nécessaire. Par exemple, essayez de monter un modèle à double exponentielle pour les déclins de fluorescence, pour tenir compte de deux environnements différents de la sonde peut être po L&#39;ajustement permettra également d&#39;obtenir des facteurs pré-exponentiels ou amplitudes qui donnent une indication de la quantité relative de colorant dans un environment ou l&#39;autre. Alternativement, une fonction exponentielle étirée peut être approprié de tenir compte d&#39;une répartition des durées de vie de fluorescence. </li><li> Les résultats de la durée de vie de fluorescence, des pré-exponentielles facteurs, et le rapport durée de vie et le rapport facteur de pré-exponentielle pour chaque pixel peut être codé en couleur. Chaque pixel est coloré en fonction de sa valeur, et le contraste en raison de la durée de vie de fluorescence, pré-exponentiels des facteurs et de leurs rapports est obtenu. Encore une fois, vérifiez les réduits du chi-carré des valeurs (qui peuvent également être codées en couleur et affiché comme une image) - autour de 1 (et jusqu&#39;à 1,3) indique un bon ajustement. Inspectez les résidus, ce qui devrait être répartis de façon aléatoire autour de zéro. </li><li> Histogrammes de vie de fluorescence doit accompagner toutes les images pour une visualisation facile des valeurs moyennes de durée de vie de fluorescence, et la distribution de vie de fluorescence. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs Déclins de fluorescence mesurée pourle rotor moléculaire fluorescent à augmenter la viscosité dans le méthanol / glycérol mélanges sont présentés dans la figure. 2. La désintégration de fluorescence sont monoexponentielle, et la durée de vie de fluorescence varie sensiblement en fonction de la viscosité. Elle augmente d&#39;environ 300 ps dans le méthanol (viscosité 0,6 cP) à 3,4 ns dans le glycérol à 95% (viscosité 950 cP). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> Figure 2 profils. Décroissance de la fluorescence pour BODIPY-C 12 dans le méthanol / glycérol mélanges de viscosité variable. 6 La courbe d&#39;étalonnage logarithmique de vie de fluorescence τ par rapport viscosité η pour le rotor moléculaire fluorescent est montré dans la figure. 3. Il s&#39;agit d&#39;une ligne droite comme exigé par l&#39;équation Förster Hoffman 9 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> où k 0 est la radiativTaux constante e, et z et x sont des constantes, avec 0 &lt;x &lt;1. En prenant le logarithme des deux côtés sur les rendements <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="L&#39;équation 2" /> où x est la pente de la ligne droite. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> Figure 3. Une parcelle de journal durée de vie de fluorescence vs log viscosité pour BODIPY-C 12 donne une ligne droite établie conformément à l&#39;équation Förster-Hoffmann. 6 Après incubation des cellules vivantes avec le rotor moléculaire fluorescent une distribution ponctuée de colorant est observé dans les images de fluorescence. Images FLIM de cellules HeLa incubées avec un colorant méso-substituée BODIPY sont montré dans la Fig. 4. Les déclins de fluorescence dans chaque pixel de l&#39;image peut être adéquatement équipés en utilisant un modèle de décroissance exponentielle simple. Figure 4. (A) L&#39;intensité de fluorescence et les images FLIM (b) de cellules HeLa colorées avec BODIPY-C 12. Les régions lumineuses, ponctuées présentent une plus courte durée de vie que les autres régions. Cette plus courte liftime correspond à une viscosité plus faible dans le puncta, probablement gouttelettes lipidiques, conformément à l&#39;équation Förster-Hoffmann. En traçant les durées de vie extraits de chaque pixel, on obtient un histogramme de vie de fluorescence de l&#39;image tout tel que montré dans la figure. 5. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> Figure 5. Histogrammes des durées de vie de fluorescence à partir d&#39;images FLIM de cellules HeLa colorées avec méso-substitués rotors BODIPY moléculaires.

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C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

FLIM offre certains avantages clés par rapport fondé sur l&#39;intensité d&#39;imagerie de fluorescence. Il peut rendre compte des événements photophysiques qui sont difficiles ou impossibles à observer par l&#39;imagerie d&#39;intensité de fluorescence, car il ne peut les séparer des effets de concentration de fluorophores. Ceci est particulièrement utile pour la cartographie de la viscosité intracellulaire par l&#39;imagerie de fluorescence rotors moléculaires. La durée de vie de fluorescence peut être facilement converti en une viscosité à l&#39;aide d&#39;un diagramme d&#39;étalonnage, comme représenté dans la Fig. 3, indépendante de la concentration de fluorescents rotors moléculaires. En FLIM il peut y avoir des artefacts qui peuvent compliquer l&#39;interprétation des données. 10 artefacts instrumentaux incluent la lumière diffusée, qui sera affiché comme un pic au-dessus du début de la décroissance de la fluorescence et peut être confondu avec un temps de décroissance à court, ou un petit pic après la IRF qui peuvent être causées par les reflets à l&#39;intérieur du microscope. Ces artefacts de lumière diffusés peuvent être identifiés comme telsparce qu&#39;ils peuvent être distingués à la discrimination spectrale - ils sont toujours à la même longueur d&#39;onde que la lumière d&#39;excitation. Se souvenant que dans l&#39;air, la lumière parcourt 30 cm en 1 nanoseconde permet de déterminer l&#39;origine de réflexions. Filtre ou en verre de fluorescence peut aussi causer un artefact, en particulier à la fluorescence de l&#39;échantillon, mais cela peut facilement être identifié en prenant une mesure sans l&#39;échantillon: si une décroissance est obtenu dans ces circonstances, elle est due à l&#39;instrument et n&#39;a rien à voir avec l&#39;échantillon! D&#39;autre part, notons que l&#39;autofluorescence échantillon peut également contribuer à une décroissance de la fluorescence. En temps corrélée comptage de photon unique (TCSPC), time-to-convertisseur d&#39;amplitude (TAC) des non-linéarités peuvent provoquer des crises pauvres, mais peuvent être identifiés par le blocage de l&#39;excitation et brillant de la lumière ambiante, par exemple, à partir de la source de lumière transmise sur l&#39;échantillon et en mesurant la synchronisation. Un bruit de fond constant devrait êtreobtenue dans chaque pixel de l&#39;image. Les régions où les écarts à partir d&#39;un fond constant se produire, ne cédera jamais un bon ajustement et doit être évitée pour la mesure, si elles ne peuvent pas être éliminé en ajustant les paramètres de la carte TCSPC. Un artefact infâme TCSPC est photons empilement qui est provoquée par une vitesse trop élevée de détection de photons. 11,12 ce conduit d&#39;que le premier photon chronométré, sans tenir compte des photons ultérieures du fait que les appareils électroniques sont occupés et de traitement de synchronisation du premier photon. Pile-up conduit à un raccourcissement de la durée de vie de fluorescence, et la meilleure façon d&#39;éviter cela est de garder le taux de comptage de photons à environ 1% du taux de répétition des impulsions laser. Perspective Il existe des implémentations différentes de FLIM, et, en fonction de l&#39;application, chacun a ses avantages et ses inconvénients. 13 Le microscope idéal fluorescence acquerrait la totalité multidimensionnelle de fluorescence emissiocontour n de l&#39;intensité, position, durée de vie, longueur d&#39;onde et la polarisation en une seule mesure, avec sensibilité au photon unique, au maximum la résolution spatiale et le temps d&#39;acquisition minimum. Il n&#39;existe actuellement aucune technologie avec cette combinaison unique de fonctionnalités, et d&#39;en construire une demeure un défi pour les développeurs d&#39;instrumentation. L&#39;application de nouvelles techniques physiques pour des problèmes importants en biologie cellulaire est souvent la voie à des découvertes inattendues, et il ya un long chemin à parcourir avant que nous soyons près de saturer les capacités de l&#39;imagerie de fluorescence pour la biologie cellulaire. En effet, l&#39;imagerie de fluorescence paramètres tels que la durée de vie, le spectre et la polarisation, ainsi que l&#39;imagerie plus rapidement en 3D à haute résolution spatiale, sont certains de révéler de nouveaux aspects de la biologie cellulaire.

Exemple avec rotors moléculaires fluorescents Matériel: inversé Leica TCS SP2 microscope confocal à balayage Coherent Mira 900 Ti: saphir laser femtoseconde avec un laser Verdi V6 pompe ou Hamamatsu PLP-10 470 picosecondes pulsés sources à diode laser d&#39;excitation Becker &amp; Hickl CPS 830 conseil en 3GHz, Pentium IV, 1 Go de RAM de l&#39;ordinateur avec Windows XP refroidi la tête Becker &amp; Hickl PMC100-01 détecteur basé sur Hamamatsu H5773P-01 photomultiplicateurs, montés sur le port microscope X1 ou des détecteurs hybrides DCC 100 module de commande de détecteur Logiciel: TRI-2 14 ou SPCImage 2,8 par Becker &amp; Hickl

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

La diffusion est souvent une importante étape déterminante de vitesse des réactions chimiques ou des procédés biologiques et joue un rôle dans un large éventail d&#39;événements intracellulaires. La viscosité est l&#39;un des paramètres clés qui influent sur ​​la diffusion des molécules et des protéines, et des variations de viscosité ont été liés à la maladie et les dysfonctionnements au niveau cellulaire 1-3. Bien que les méthodes pour mesurer la viscosité en vrac sont bien développés, microviscosité imagerie reste un défi . Les cartes de viscosité d&#39;objets microscopiques, comme des cellules individuelles, ont jusqu&#39;à récemment été difficile à obtenir. Viscosité de cartographie avec des techniques de fluorescence est avantageux parce que, semblable à d&#39;autres techniques optiques, il est peu invasive, non destructive et peut être appliquée à des cellules vivantes et de tissus. Fluorescentes rotors moléculaires présentent de vie de fluorescence et les rendements quantiques qui sont fonction de la viscosité de leur microenvironnement. 4,5 torsion intramoléculaire ourotation conduit à la non-radiatif désintégration de l&#39;arrière état excité à l&#39;état fondamental. Un environnement visqueuse ralentit cette rotation ou de torsion, de restreindre l&#39;accès à cette voie décroissance non radiative. Cela conduit à une augmentation du rendement quantique de fluorescence et de la durée de vie de fluorescence. Imagerie à vie de fluorescence (FLIM) de Mise colorants BODIPY hydrophobes qui agissent comme des rotors fluorescentes moléculaires montrent que la durée de vie de fluorescence de ces sondes est une fonction de la microviscosité de leur environnement 6-8. Un échelle logarithmique de la durée de vie de fluorescence par rapport aux rendements viscosité solvant une ligne droite qui obéit à l&#39;équation Förster Hoffman. 9 Cette parcelle sert aussi une courbe d&#39;étalonnage pour convertir de vie de fluorescence dans la viscosité. Après incubation des cellules vivantes avec le BODIPY fluorescente rotor moléculaire modifiée, une distribution de colorant ponctuée est observé dans les images de fluorescence. La valeur de viscosité obtenue en ee puncta dans les cellules vivantes est environ 100 fois plus élevé que celui de l&#39;eau et du cytoplasme cellulaire. 6,7 résolues en temps des mesures d&#39;anisotropie de fluorescence donnent temps de corrélation rotationnelle en accord avec ces valeurs microviscosité grandes. Cartographier la durée de vie de fluorescence est indépendante de l&#39;intensité de fluorescence, et permet ainsi la séparation de concentration de la sonde et les effets de viscosité. En résumé, nous avons développé une approche pratique et polyvalent pour cartographier la microviscosité dans les cellules sur la base de FLIM de rotors moléculaires fluorescents.

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Imagerie de vie de fluorescence (FLIM) a émergé comme une technique essentielle pour l&#39;image de l&#39;environnement et l&#39;interaction des protéines spécifiques et des colorants dans les cellules vivantes. FLIM des rotors moléculaires fluorescents permet de cartographier de la viscosité dans les cellules vivantes.

Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

fluorescence-lifetime-imaging-of-molecular-rotors-in-living-cells

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24.8K vues.  King's College London. Imagerie de vie de fluorescence (FLIM) a émergé comme une technique essentielle pour l'image de l'environnement et l'interaction des protéines spécifiques et des colorants dans les cellules vivantes. FLIM des rotors moléculaires fluorescents permet de cartographier de la viscosité dans les cellules vivantes.

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Recherche

Bio-ingénierie

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Protocole d’injection lipidique pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Souche contrôlée d’hydrogels 3D sous imagerie par microscopie dynamique

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...