עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מHHMI 56006760 לJDV, המכונים הלאומי לבריאות (NIH) (2 TL1 RR 24,158-6) לDMAW, ומהרפואי קרן אליסון (AG-SS-2465) ו-NIH (GM45735, GM45735S1 וGM096445) ל-LP. GM45735S1 הוצא מ-NIH תחת Recovery Act האמריקאי מהשקעה של 2009. המיקרוסקופים המשמשים למחקרים אלה נתמכים בחלקו על ידי NIH / NCI מענק (5 P30 CA13696).

1. טרנספורמציה של תאי שמרים עם Biosensors <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את זן השמרים הרצויים עם פלסמיד נושא מיטו-roGFP או mitGO-ATeam2 בשיטה אצטט ליתיום 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את השינוי עם biosensor פלסמיד הנישא ועל מנת למנוע אובדן של פלסמיד, לבחור ולשמור על transformants הבינוני המלאה המתאימה סלקטיבית הסינטטי (SC-Ura למיטו-roGFP, או SC-Leu לmitGo-ATeam2). אם הבדיקה הניאון כבר subcloned בפלסמיד שונה מאלה המתוארים כאן, להשתמש במצע סלקטיבי המתאים. דמיין transformants על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר שהם מביעים biosensor הניאון ולהציג מורפולוגיה המיטוכונדריה נורמלית. </li></ol> 2. צמיחה של תאים והכנה להדמיה תפקוד תא ותגובה לטיפול תרופתי תלויים מאוד בצפיפות תאים ופעילות מטבולית. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר תאיםבאופן פעיל בחלוקה (שלב אמצע יומן, ~ 0.5 - 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל). הדרך אמינה ביותר ליצירת תרבויות שלב אמצע יומן, של צפיפות עולה בקנה אחד היא לחסן ממראש תרבות נייחת שלב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מראש תרבות נייחת שלבים: פיק מושבה אחת של תאים הפכו מצלחת ולחסן תקשורת נוזלית סלקטיבית (5 מ&quot;ל בשפופרת 50 מיליליטר חרוטי התחתון). לגדול ב 30 ° C עם הרועד בסל&quot;ד 225 עד הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) הגיעה לרמה (24-48 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות שלב אמצע יומן לתצפית: להשתמש בנפח המתאים של טרום התרבות לחסן 5 מ&quot;ל של תקשורת סלקטיבית בצינור חרוטי התחתון 50 מ&quot;ל. תקשורת YPD היא autofluorescent ולא אמור לשמש ללימודים אלה. השתמש שלמה, סוכר, המבוסס נשירה (SC-אורה) תקשורת סינטטי. לגדל תאים על 30 מעלות צלזיוס, רועד ב225 סל&quot;ד, 4-16 לשעה, עד שהם מגיעים לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל). ניתן לקבוע צפיפות תאיםעל ידי מדידת קוטר 600; לכייל ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את קריאת OD 600 הנכונה. בקמן DU530 (Beckman Coulter, אינדיאנפוליס, אינדיאנה), שלב אמצע יומן מתאים לOD 600 של 0.1-0.3. </li></ol> מיטו-roGFP1 תנודות חושים באברון בתגובה לשינויים מטבוליים. לדוגמה, בשינויי מצב חיזור המיטוכונדריה assay זה כאשר שמרים גדלים על מקורות פחמן (למשל תסיס גלוקוז, כמו בתקשורת SC) לעומת מקורות פחמן שאינו תסיס גליצרול (למשל, כמו בתקשורת SGlyc), ואפילו בקבוצות של אותו שונים תקשורת. לכן, השתמש באותה הקבוצה של אמצעי תקשורת לכל הניסויים. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מוכנים לריכוז (ראה שלב 2.4) והדמיה אם מתבצע ללא טיפול. אם מטופלי תאים, דגירה תאים עם הטיפול המתאים ולהמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז 1 מ&quot;ל של התרבות על ידי צנטריפוגה XG ב 6000 במשך 15 שניות וresuspension של גלולה התא ב20 μl של תקשורת. תנאים אלה למקסם את מספר התאים להבחנה בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 2 μl של תאי resuspended לשקופית. לכסות עם coverslip (מס &#39;1.5, רצוי בעל ביצועים גבוהים 170 ± עובי 5 מיקרומטר), וסוגר את הקצוות של coverslip עם לק או ברורים valap (ראה ריאגנטים). לאטום עם valap, להמס כמות קטנה במרית מתכת על ידי מחזיק אותו מעל להבת מבער בונזן, ולאחר מכן התפשט בכמות קטנה לאורך הקצוות של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים על 30 מעלות צלזיוס במהלך ההדמיה. דוד אובייקטיבי על עדשת טבילת שמן 100x משמשת להדמיה עובד היטב עבור יישום זה. בתנאים אלה, מורפולוגיה המיטוכונדריה, מדינת חיזור ורמות ה-ATP יישארו ללא שינוי במהלך הדמיה למשך 10-15 דקות. </li></ol> 3. התקנת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה להדמית מיטו-roGFP1 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום השלבים כאן הם מותאמים לAxioObserver.Z1 מיקרוסקופ מצויד במקור Colibri LED עירור, אורקה ER מצלמה רחבת שדה ותוכנת רכישת AxioVision. Photobleaching של שני הערוצים וphotoconversion של חמצון מיטו-roGFP1 מצטמצם משמעותי שימוש בתאורת LED בהשוואה לתאורת כספית קשת מנורה (ראה להלן). על מנת למקסם את האות ורזולוציה, השתמש בצמצם הגבוה ביותר המספרי האפשרי במטרה, וההגדלה הנמוכה ביותר המספקת רזולוציה מרחבית מספיק. בנוסף, למיטו-roGFP הדמיה, ודא שהמטרה מעבירה היטב ב365 ננומטר. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar האובייקטיבי (Zeiss) עובד היטב עבור יישום זה. הגדר את תוכנת הרכישה כדי ללכוד את מיני מיטו-roGFP1 חמצון ומצטמצמים. אנו משתמשים בתנאים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הערוץ לחמצון מיטו-roGFP להשתמש עירור ב 365 ננומטר (100% כוח LED) ומסנן פליטה מתאים לGFP, כגון 38 הם לסנן סט (Zeiss), עם excitatio הכלולהn המסנן הוסר מהקובייה. הסרת מסנן העירור מאפשרת עירור ב 365 ננומטר ושני 470 ננומטר, ללא הצורך לעבור מסננים, וכך להגדיל את הרזולוציה זמן השגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הערוץ למופחת מיטו-roGFP להשתמש עירור ב 470 ננומטר (100% כוח LED), וכפי שהוזכר לעיל, אותה קוביית מסנן הפליטה המשמשת לחמצון מיטו-roGFP. להגדיר את המצלמה ל1x1 binning כדי לייעל את הרזולוציה מרחבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התוכנה לרכישת AZ מחסנית בהיקף של 11 פרוסות עם מרווח 0.5 מיקרומטר, איסוף שני ערוצים בכל עמדת z. מצב זה של רכישה הוא איטי יותר מאשר רכישת כל ערימת z בתורו, אבל הוא מונע חפצים הנובעים מתנועה המיטוכונדריה בין רכישת ערוצי חמצון ומצטמצמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת מספר תאים כדי לקבוע זמן חשיפה מתאים, הפקת אות להרוות חזקה, אבל לא. חשוב לשמור על היחס של זמני חשיפה לחמצון והקטין מיטו-roGFP1 לכל הניסויים. לדוגמה, אם מתחמצנים את זמני החשיפה ולהקטינו מיטו-roGFP1 הם 300 ו -100 אלפיות שני, בהתאמה, ולאחר מכן את זמן החשיפה לחמצון מיטו-roGFP1 צריך להיות 3 פעמים שהקטין למיטו-roGFP לכל הניסויים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה להדמית mitGO-ATeam2 על מיקרוסקופ confocal רפאים כדי לכמת רמות ה-ATP באמצעות mitGO-ATeam2, הקרינה מGFP (ננומטר הפליטה המרבי 510) יש להבחין בין שמOFP (ננומטר הפליטה המרבי 560). ישנן מערכות סינון הקרינה שתפתורנה את הקרינה הנפלטת מfluorophores אלה. עם זאת, אנו מוצאים כי גלאי רפאים, נגיש בליזר רבים סריקה מיקרוסקופי confocal, עובד הכי טוב עבור יישום זה. גלאי רפאים מפריד בין פליטת הקרינה למרכיבים רבים (בדרך כלל 32 או יותר) על פי אורך גל. כמה להקות גל סמוכות ניתן לשלב ערוץ תמונה אחת. אורכי הגל שנבחרו באופן אמפירי בשילוב כדי למקסם אות GFP וOFP תוך הימנעות מוצלב של אות שהייתי לבלבל סריג מדידה. השתמש בעדשת הצמצם המספרית הגבוהה ביותר הקיימת. אנו משתמשים ב100x/1.49 או 60x/1.49 עדשת Apo-TIRF. אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal A1R ניקון פועל תוכנת אלמנטי ש&quot;ח. הגדר את תוכנת הרכישה כדי ללכוד את מיני mitGO-ATP ATeam2 בכריכות וATP-מאוגד. אנו משתמשים בתנאים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר חריר ל1.0 יחידות אווריריות (AU), אשר במערכת שלנו תואמות את AZ הרזולוציה של כ 0.42 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר זום סריקה כדי להתקרב לגבול דגימת נייקוויסט, אשר תהיה למקסם את המידע המרחבי בתמונה. במערכת שלנו הוא בגודל פיקסל 0.12 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל המיטוכונדריה עשויה לעבור במהלך הדמיה, זה יכול להיות מועיל כדי להגביר את מהירות הדמיה על ידי חיתוך לשדה 512 x 256 פיקסלים. הזמן הכולל נדרש לתמונת מסגרת אחת במערכת שלנו הוא 1.0 שניות, כולל סריקה ממוצעת פי 2. בהתאם לרזולוציה מרחבית רצויה, השדה יכול להיות קצוץ נוסף לincreasדואר רזולוציה זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקסייט ב 488 ננומטר, ולאסוף פליטה 500-520 ננומטר עבור ה-GFP, ו550-580 ננומטר לOFP. ערכים אופטימליים בפועל עשויים להשתנות עם מאפיינים של מערכת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח לייזר האופטימלי למערכת שלנו הוא בין 6.0 ו 6.4%. כוח לייזר האופטימלי ישתנה עבור כל מערכת מיקרוסקופ, אבל באופן אידיאלי להיות נמוך ככל האפשר, תוך הפקת תמונה לפירוש. השתמש במד כוח פנימי או חיצוני כדי לפקח על שינויים בכוח לייזר, אשר מתרחשים בדרך כלל על פני זמן בכל מערכת אופטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם רווח גלאי ועוצמת אור תאורה על מנת למקסם את הטווח של ערכים המזוהה פיקסל אך להימנע להרוות את האות, כלתאים רבים ככל האפשר. לא לנתח כל תאים המכילים יותר מ 1% פיקסלים רוויים. תמונה כל הדגימות באמצעות אותה מטרה, כוח לייזר, סריקת זום, גודל פיקסל, רווח, ולקזז. </li></ol></li></ol> 4. רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור מוקדי PLA<html> ne של תאים בעלי עניין באמצעות אור מועבר כדי למזער הלבנת הבדיקה הניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איתור תא אחד או יותר של עניין, לאסוף Z-סדרה באמצעות כל עומקו של תא טיפוסי (כ 7 מיקרומטר) באמצעות גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת תאים אחרים בעלי עניין בשקופית, אבל אין תמונה בשקופית אחת למשך זמן ארוך יותר מ -15 דקות. לאחר 15 דקות בשקופית, תאים מאבדים את יכולת קיום. </li></ol> 5. אנליזה רמת ה-ATP מיטוכונדריאלי נקבעת על ידי מדידת היחס בין פליטת mitGO-ATeam2 ב 560 ננומטר כדי שב 510 ננומטר 27 מדינת חיזור של אברון נמדדת כיחס מצטמצם לחמצון (R / O) של מיטו-roGFP;. כלומר פליטה ב 510 ננומטר על עירור ב 470 ננומטר מחולק בפליטה ב 510 ננומטר על עירור ב 365 ננומטר. לפני חישוב היחס, אנו לחסר רקע ולקבוע ערך סף לפיקסלים השייכים למיטוכונדריה ניאון. אוהל &quot;&gt; ברשות ציבור (למשל ImageJ 30) או זמינה מסחרי (Volocity למשל, פרקין אלמר) תוכנה יכולה לשמש לניתוח של מיטו-roGFP1 או mitGO-ATeam2. בהתאם לתוכנה המשמשת לרכישת תמונה ולניתוח, את התמונות ייתכן שיצטרך להיות מומר לפורמט אחר, כמו TIFF, לפני פתיחתם בתוכנת הניתוח. אם תמונות מומרות, זה חיוני כדי לוודא שערכי הפיקסלים לא משתנה במהלך ההמרה. ניתוח של נתונים מיטו-roGFP1, באמצעות שתי התוכניות מתוארת להלן. תפריטי תכנית ואפשרויות לבחירה בתוך כל תפריט מודגשים בכתב נטוי מודגש. ניתוח ImageJ 5.1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתיחת תמונות ולשנות את סוג ל32 סיביות: תמונת → → סוג 32 ביט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין (ROI) באזור שבו אין תאים. לחשב את עוצמת הממוצעת בהחזר על השקעה זו: נתח → מדוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הרקע הממוצע מחושב מהמחסנית: תהליך → המתמטיקה → לחסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות Z-המחסנית נגרעה, למצוא את הפרוסה אמצעית ועל סף מיטוכונדריה: תמונת → התאם → הסף ולחץ על החל על סף החלון. אחול על כל הפרוסות בערימה. בדקו הגדרת פיקסלים רקע לנאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור יחס z ערימה: תהליך → מחשבון תמונה מחלקים את הערימה המופחתת על ידי הערימה מתחמצנת z לניתוח מיטו-roGFP1. מחלקים את תמונת 560 ננומטר (ATP המאוגד) על ידי 510 ננומטר (מאוגד ATP) תמונה לניתוח mitGO-ATeam2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את ההחזר על ההשקעה מסביב לאזור של עניין. בחר לנתח → כלים → ROI מנהל, ולחץ על הוסף כדי להקליט את ההחזר על ההשקעה. אזורים מרובים עשויים להיות מאוחסנים במנהל. במנהל החזר על השקעה, בחר את כל ROIs, ואז לבחור Mעפרות → Multi-מדוד למדוד כל פרוסות המחסנית. יצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח. </li></ol> ניתוח Volocity 5.2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבוא תמונות לתוך ספריית Volocity וליצור תמונה ברצף עם 2 ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין (ROI) באזור שבו אין תאים. בחר: כלים → יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Volocity כדי לחשב את הרקע: קבל מהחזר על ההשקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הסף לכלול מבני המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את האפשרות להחיל LUT קשת לערוץ היחס. ערוץ עוצמת-מווסת עשוי להפיק תמונה פחות רועשת לpresenta tion, אבל זה לא צריך להיות בשימוש כדי לכמת את היחס ממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה המדידה, בחר בערוץ יחס החזר על השקעה ולצייר מסביב לאזור של עניין. מדוד את ערוץ היחס, למעט ערכים אפס. אזורים מרובים עשויים להיות נבחרו ונמדדובאותו הזמן. יצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

כאן, אנו מתארים שיטות לשימוש מיטו-roGFP1 וmitGO-ATeam2 כחיישנים ביולוגיים להערכת מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP בתאים חי שמרים. אנו מוצאים את ביטוי שתוצאות פלסמיד שמקורן מיטו-roGFP1 או mitGO-ATeam בכמותית המיקוד למיטוכונדריה, ללא כל השפעה ברורה על מורפולוגיה של המיטוכונדריה או הפ?...

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים לייצור ה-ATP, סינתזה של חומצות אמינו, חומצות שומן, heme, ברזל וגופרית אשכולות pyrimidines. מיטוכונדריה גם לשחק תפקידים מרכזיים בומאוסטזיס סידן, וברגולציה של אפופטוזיס. 1 קישורי ראיות הגדלת מיטוכונדריה למחלות הזדקנות וקשורות לגיל, כולל מחלת פרקינסון, אלצהיימר, טרשת לרוחב amyotrophic, ומחלת הנטינגטון. 2 בעוד אנשים חיים את כל חייהם עם מוטציות בחלבוני המיטוכונדריה הקשורים למחלות ניווניות, את תסמיני המחלה מתרחשות רק מאוחר יותר בחיים. זה מצביע על כך ששינויים מתרחשים במיטוכונדריה עם גיל שיאפשר מחלת הפתולוגיה לצוץ. ואכן, כושר המיטוכונדריה הוא מתואם עם בריאות כללית תא ותוחלת חיים בשמרים ותאי יונקים. 3,4 כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בחיישנים ביולוגיים גנטי מקודדים, רציומטרי ניאון כדי להעריך שני מאפיינים קריטיים של mitochondria בתאים חי שמרים: מדינת חיזור ורמות ה-ATP. תפקוד המיטוכונדריה בגיוס אנרגיה אירובי הוא מבוסס היטב. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי היא תוצר של הפחתת חמצון ומינים באברון, כולל NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, דיסולפיד גלוטתיון / גלוטתיון (GSH / GSSG) ומיני חמצן תגובתי (ROS). שחרר את סוגר המיטוכונדריה או היפוקסיה משפיע על פעילות נשימה המיטוכונדריה ומשנה את היחס בין NAD + ל NADH באברון. ROS, אשר מיוצרים מהעברת אלקטרון בין קומפלקסים לא יעילה של שרשרת העברת האלקטרונים בקרום המיטוכונדריה הפנימית, כמו גם מdeamination של אמינים באמצעות מונואמין אוקסידאז בקרום החיצוני של המיטוכונדריה 5, שומנים, חלבונים, נזק וחומצות גרעין ויש לי נקשר להזדקנות ומחלות ניווניות גיל הקשורים 6,7,8. ROS גם לשחק תפקיד בהעברת אותות במ &#39;itochondria, באמצעות חמצון של GSH. לדוגמה, NADH דהידרוגנז לא רק תורם לייצור ROS אלא גם מוסדר באמצעות אינטראקציות עם בריכת גלוטתיון 9,10. דהידרוגנז וaconitase α-ketoglutarate, רכיבים של מחזור TCA, מפגינים פעילות מופחתת בחמצון סביבות 11,12. ואכן, תקנת חיזור תלויה של פעילות aconitase נשמרת מחיידקים ליונקים 13,14. לפיכך, ניטור מצב חיזור ורמות ה-ATP של המיטוכונדריה הוא חיוני להבנת תפקודם והתפקיד במחלת פתולוגיה. שיטות ביוכימיות שמשו כדי להעריך את מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים שלמים או מבודד מיטוכונדריה. שיטות המשמשות באופן נרחב כדי להעריך את מצב חיזור של תאים או שלמים מבודדת המיטוכונדריה מבוססות על מדידת הרמות של זוג חמזור GSH / GSSG 15. המערכת נמצאת בשימוש luciferin-לוציפראז נפוץ למדידת המיטוכונדריהרמות ה-ATP בכל תאים שלמים permeabilized או מבודד המיטוכונדריה. 16,17,18,19,20 ב assay זה, לוציפראז נקשר ה-ATP ומזרזת חמצון של וchemiluminescence מluciferin. 21 עוצמת האור הנפלט הוא ביחס ישר לכמות של ה-ATP בתערובת התגובה. 22 שיטות אלה חשפו מידע מהותי בנוגע לתפקוד המיטוכונדריה, כולל מציאת כי בחולים עם מחלות ניווניות, כמו מחלת אלצהיימר, יש רמות נמוכות באופן חריג ה-ATP. 23 עם זאת, הם לא יכולים לשמש למגורים, תמונת תאים שלמים. יתר על כן, שיטות המבוססות על ניתוח כל התא מספקות ממוצעת של מדינת חיזור או רמות ה-ATP בכל התאים של התא. מדידות באברונים מבודדים הן פוטנציאל בעייתיים משום שמדינת חמזור המיטוכונדריה או רמות ה-ATP עשויה להשתנות במהלך חלוקה subcellular. לבסוף, מחקרים שנעשה לאחרונה מהמעבדה ועוד מצביעים על כךהמיטוכונדריה בתוך תאים בודדים הן הטרוגנית בפונקציה, אשר בתורו משפיעה על תוחלת החיים של תאים אם ובתה. 3 לפיכך, יש צורך למדוד את רמות ה-ATP והמיטוכונדריה מדינת חיזור בתאים חיים עם הרזולוציה subcellular. את biosensors לתפקוד המיטוכונדריה מתואר כאן הם על בסיס ה-GFP. GFP חיזור רגיש (roGFP) 24,25 הוא גרסת ה-GFP שבו מוסף החשוף על פני השטח cysteines למולקולה. roGFP, כמו פראי סוג של GFP, יש שתי פסגות עירור (ב ~ 400 ננומטר ו ~ 480 ננומטר) ושיא פליטה אחד ב~ 510 ננומטר. חמצון של שאריות ציסטאין בתוצאות roGFP בעלייה בעירור ב ~ 400 ננומטר. הפחתה של cysteines האלה מעדיפה עירור ב ~ 480 ננומטר. לפיכך, היחס בין פליטת ננומטר 510 על עירור של roGFP ב480 ננומטר ו -400 ננומטר מגלה את הכמות היחסית של חמצון מופחת וroGFP, המשקף את מצב חיזור של הסביבה של fluorophore. שני versיונים של roGFP נמצאים בשימוש נרחב: roGFP1 וroGFP2. שניהם מכילים את אותם הוספות ציסטאין. roGFP1 מבוסס על פראי סוג GFP וroGFP2 מבוסס על S65T GFP, שבו יש עירור יעיל יותר ב480 ננומטר ופחות יעיל בעירור 400 ננומטר לעומת wtGFP 24. roGFP1 הוא פחות רגיש מאשר pH roGFP2 והטווח הדינמי שלה מרחיב עוד יותר לתוך הטווח המופחת. לפיכך, roGFP1 עשויה להיות שימושי יותר לניטור תאים יותר להפחתה כגון המיטוכונדריה או cytosol, ותאים בעלי חומציות משתנה, כגון endosomes. roGFP2 מציע אות בהירה, בחלק מהמחקרים, טווח דינמי גדול יותר מroGFP1 24,26. מחקרים בthaliana ארבידופסיס מצביעים על כך שהזמן הנדרש לתגובה לשינויים במצב חיזור הוא דומה בשני החיישנים (t ½ לחמצון, 65 ו -95 שניות ולא ½ להפחתה, 272 ו 206 שניות, לroGFP1 וroGFP2, בהתאמה). 26 MitGO-ATeam2 הוא פולשנית, אמינהחיישן שמודד את המיטוכונדריה ה-ATP בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים. GO-ATeam הוא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שמורכבת המקטע של ε F o F-ATP synthase 1 דחוקה בין סריג תורם וחלבוני ניאון acceptor (GFP וכתום חלבון פלואורסצנטי (OFP), בהתאמה). 27 כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם בסמיכות לacceptor ולאפשר להעברת אנרגיה מתורם לacceptor. ישנן שתי גרסאות של Go-ATeam, GO-ATeam1 וללכת-ATeam2. יש GO-ATeam2 זיקה גבוהה יותר לMgATP מאשר ללכת-ATeam1, מה שהופך אותו מתאים יותר למדידה בדרך כלל נמוכים יותר [ATP] במיטוכונדריה לעומת cytosol. 27 לחקור מדינת חמזור המיטוכונדריה, אנו נבנו חלבון היתוך (מיטו-roGFP1) בהיקף של roGFP1 התמזג רצף מנהיג ATP9ND הביע מביטוי שמרי centromere מבוסס (מספר עותק נמוך) פלסמיד תחת שליטה של ​​דהידרוגנז glyceraldehyde-3-פוספט החזק (GPD) האמרגן (p416GPD, Addgene). אנחנו השתמשנו roGFP1 לחקור את מצב חיזור של המיטוכונדריה בהקשר של הזדקנות של cerevisiae Saccharomyces פטריית המודל. אנו מוצאים כי roGFP1 יכול לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה המתרחשים במהלך הזדקנות ובתגובה לזמינות חומרי הזנה, אבל אין כל השפעה מזיקה לכאורה על תאי שמרים. כמו כן, אנו רואים השתנות במצב חיזור של המיטוכונדריה בתוך תאי שמרי חיים בודדים, ממצא זה מדגיש את החשיבות של biosensor עם רזולוציה מרחבית subcellular. MitGO-ATeam2 הנו נגזרת של GO-ATeam2, שבו יש רצף של המיטוכונדריה אות VIIIA מקטע מונואמין ג ציטוכרום הוכנס בתחנה הסופית של אמין GO-ATeam2. -27 שונה חללית mitGO-ATeam2 (בחביבות על ידי המעבדה של ח Noji, מכון OF מדע ומחקר תעשייתי, אוניברסיטת אוסקה, יפן) לשימוש בשמרים על ידי subcloning, באמצעות Xba1 ואתרי HindIII, לתוך וקטור ביטוי שמרי pAG415GPD-ccdB (Addgene, קיימברידג&#39;, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב), שהוא נמוך עותק פלסמיד המכיל את אמרגן GPD המכונן החזק. אנחנו הביעו mitGO-ATeam2 בשמרי ניצנים, ולמצוא, לפי counterstaining עם הצבע DAPI-DNA המחייב, כי זה localizes באופן בלעדי למיטוכונדריה, שם היא משמשת כבדיקה יעילה למדידת שינויים פיסיולוגיים ברמות ה-ATP המיטוכונדריה. roGFP וללכת-ATeam שניהם מקודדים גנטי. כתוצאה מכך, הם יכולים להיות הציגו ומתוחזק ביציבות בתאים שלמים, ולספק מידע על מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים בודדים, המתגוררים. יתר על כן, שני biosensors לעקוב אחר שינויים במצב חיזור או רמות ה-ATP שמתרחשות בתנאים פיסיולוגיים. 28 שתי הבדיקות גם ratiometric. כתוצאה מכך, מדידות שנעשו עם בדיקות אלה אינן מושפעות על ידי צ&#39;הnges בריכוז biosensor או תאורת מדגם או עובי. לבסוף, שני biosensors לספק רזולוציה מרחבית subcellular. ואכן, roGFP כבר ממוקד למיטוכונדריה, ER, endosomes וperoxisomes 24, ויכול לזהות שינויים במצב חיזור של כל אחד מהאברונים האלה, בלתי תלויים ברמת החומציות.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

יש לי המיטוכונדריה תפקידים בתהליכים תאיים רבים, מחילוף חומרים של אנרגיה והומאוסטזיס סידן לשלוט של הסלולר תוחלת חיים ומות תאים מתוכנת. תהליכים אלה משפיעים ומושפעים מהמצב של חיזור וייצור ATP במיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים ratiometric, מקודדים גנטי שיכול לזהות מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאים חי שמרים. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי נמדדת באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק חיזור רגיש (roGFP) כי הוא ממוקד למטריקס המיטוכונדריה. מיטו-roGFP מכיל cysteines בעמדות 147 ו -204 של ה-GFP, אשר עוברות חמצון הפיך ותלוי בסביבה וצמצום, אשר בתורו משנה את ספקטרום העירור של החלבון. MitGO-ATeam היא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שבמקטע של ε o F F-ATP synthase 1 הוא דחוקה בין סריג תורם acceptor fluoחלבוני rescent. כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם acceptor בסמיכות ומאפשרת העברת אנרגיה תהודה הקרינה מהתורם לacceptor.

מדידת מדינת חמזור המיטוכונדריה עם מיטו-roGFP כאן, אנו מראים שיש לו מיטו-roGFP1 הטווח הדינמי כדי לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה מחמצון מופחת באופן מלא לחיים בתאי שמרים, מבלי להשפיע על צמיחת תאי שמרים או במורפולוגיה של המיטוכונדרי...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים, מקודדים גנטי ratiometric, המבוססים על ה-GFP, כדי לפקח על מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאי שמרי חיים.

Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.0K Views.  Columbia University. אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים, מקודדים גנטי ratiometric, המבוססים על ה-GFP, כדי לפקח על מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאי שמרי חיים.

Video: Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Measuring Yeast Mitochondrial Respiration While Maintaining Cellular Context

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to different nutritional and environmental conditions give valuable information to elucidate molecular mechanisms. Oxidative phosphorylation is the primary source of ATP in most cells, and mitochondrial respiration activity is a key component of oxidative phosphorylation, maintaining mitochondrial membrane potential for ATP synthesis. Mitochondrial respiration is often studied in isolated mitochondria that are missing the cellular context. Here, we present a method for quantifying mitochondrial respiration in yeast-intact cells. This method applies to any yeast species, although it has been generally used for Saccharomyces cerevisiae cells. First, the yeast growth in specific conditions is tested. Then, cells are washed and resuspended in deionized water with a 1:1 ratio (w/v). Cells are then placed in an oximeter chamber with constant stirring, and a Clark electrode is used to quantify oxygen consumption. Some molecules are sequentially placed into the chamber and selected according to this effect on the electron transport chain or ATP synthesis. ATPase inhibitor oligomycin is first added to measure respiration coupled to ATP synthesis. Afterward, an uncoupler is used to measure the maximal respiratory capacity. Finally, a mix of electron transport chain inhibitors is added to discard oxygen consumption unrelated to mitochondrial respiration. Data are analyzed using a linear regression to obtain the slope, representing the oxygen consumption rate. The advantage of this method is that it is specific for yeast mitochondrial respiration, maintaining the cellular context. It is essential to highlight that inhibitors used in mitochondrial respiration quantification could vary between yeast species.

Author Spotlight: Assessing Mitochondrial Respiration in Intact Yeast Cells Using an Oximeter Chamber Method

Mitochondrial respiration in yeast whole cells is a valuable indicator of cell bioenergetics. Here, we present a protocol to quantify this phenotype applicable to different yeast species.

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

Biochemistry

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

מדידה של pH vacuolar וCytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; בהשעיות תא שמרים

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Biology

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Neuroscience

Measurement of Mitochondrial Membrane Potential In Vivo using a Genetically Encoded Voltage Indicator

Mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is critical for mitochondrial functions, including ATP synthesis, ion transport, reactive oxygen species (ROS) generation, and the import of proteins encoded by the nucleus. Existing methods for measuring &#916;&#936;m typically use lipophilic cation dyes, such as Rhodamine 800 and tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), but these are limited by low specificity and are not well-suited for in vivo applications. To address these limitations, we have developed a novel protocol utilizing genetically encoded voltage indicators (GEVIs). Genetically encoded voltage indicators (GEVIs), which generate fluorescent signals in response to membrane potential changes, have demonstrated significant potential for monitoring plasma membrane and neuronal potentials. However, their application to mitochondrial membranes remains unexplored. Here, we developed protein-based mitochondrial-targeted GEVIs capable of detecting &#916;&#936;m fluctuations in cells and the motor cortex of living animals. The mitochondrial potential indicator (MPI)offers a non-invasive approach to study &#916;&#936;m dynamics in real-time, providing a method to investigate mitochondrial function under both normal and pathological conditions.

This protocol describes the application of mitochondria-targeted genetically encoded voltage indicators (GEVIs). These GEVIs offer a significant advantage over traditional mitochondrial membrane potential dyes by enabling specific, in vivo, and real-time monitoring of mitochondrial membrane potential.

מדידת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית in vivo באמצעות מחוון מתח מקודד גנטית

Mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is critical for mitochondrial functions, including ATP synthesis, ion transport, reactive oxygen ...

הדמיה של מי חמצן מיטוכונדריאליים בתאי שמרים חיים באמצעות mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

מחבר זרקור: קידום מחקר מיטוכונדריאלי - mtHyper7 Biosensor לאנליזה תת-תאית 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

הדמיה של mtHyPer7, ביוסנסור רציומטרי למי חמצן מיטוכונדריאליים, בתאי שמרים חיים

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...