עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מHHMI 56006760 לJDV, המכונים הלאומי לבריאות (NIH) (2 TL1 RR 24,158-6) לDMAW, ומהרפואי קרן אליסון (AG-SS-2465) ו-NIH (GM45735, GM45735S1 וGM096445) ל-LP. GM45735S1 הוצא מ-NIH תחת Recovery Act האמריקאי מהשקעה של 2009. המיקרוסקופים המשמשים למחקרים אלה נתמכים בחלקו על ידי NIH / NCI מענק (5 P30 CA13696).

1. טרנספורמציה של תאי שמרים עם Biosensors <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את זן השמרים הרצויים עם פלסמיד נושא מיטו-roGFP או mitGO-ATeam2 בשיטה אצטט ליתיום 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את השינוי עם biosensor פלסמיד הנישא ועל מנת למנוע אובדן של פלסמיד, לבחור ולשמור על transformants הבינוני המלאה המתאימה סלקטיבית הסינטטי (SC-Ura למיטו-roGFP, או SC-Leu לmitGo-ATeam2). אם הבדיקה הניאון כבר subcloned בפלסמיד שונה מאלה המתוארים כאן, להשתמש במצע סלקטיבי המתאים. דמיין transformants על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר שהם מביעים biosensor הניאון ולהציג מורפולוגיה המיטוכונדריה נורמלית. </li></ol> 2. צמיחה של תאים והכנה להדמיה תפקוד תא ותגובה לטיפול תרופתי תלויים מאוד בצפיפות תאים ופעילות מטבולית. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר תאיםבאופן פעיל בחלוקה (שלב אמצע יומן, ~ 0.5 - 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל). הדרך אמינה ביותר ליצירת תרבויות שלב אמצע יומן, של צפיפות עולה בקנה אחד היא לחסן ממראש תרבות נייחת שלב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מראש תרבות נייחת שלבים: פיק מושבה אחת של תאים הפכו מצלחת ולחסן תקשורת נוזלית סלקטיבית (5 מ&quot;ל בשפופרת 50 מיליליטר חרוטי התחתון). לגדול ב 30 ° C עם הרועד בסל&quot;ד 225 עד הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) הגיעה לרמה (24-48 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות שלב אמצע יומן לתצפית: להשתמש בנפח המתאים של טרום התרבות לחסן 5 מ&quot;ל של תקשורת סלקטיבית בצינור חרוטי התחתון 50 מ&quot;ל. תקשורת YPD היא autofluorescent ולא אמור לשמש ללימודים אלה. השתמש שלמה, סוכר, המבוסס נשירה (SC-אורה) תקשורת סינטטי. לגדל תאים על 30 מעלות צלזיוס, רועד ב225 סל&quot;ד, 4-16 לשעה, עד שהם מגיעים לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל). ניתן לקבוע צפיפות תאיםעל ידי מדידת קוטר 600; לכייל ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את קריאת OD 600 הנכונה. בקמן DU530 (Beckman Coulter, אינדיאנפוליס, אינדיאנה), שלב אמצע יומן מתאים לOD 600 של 0.1-0.3. </li></ol> מיטו-roGFP1 תנודות חושים באברון בתגובה לשינויים מטבוליים. לדוגמה, בשינויי מצב חיזור המיטוכונדריה assay זה כאשר שמרים גדלים על מקורות פחמן (למשל תסיס גלוקוז, כמו בתקשורת SC) לעומת מקורות פחמן שאינו תסיס גליצרול (למשל, כמו בתקשורת SGlyc), ואפילו בקבוצות של אותו שונים תקשורת. לכן, השתמש באותה הקבוצה של אמצעי תקשורת לכל הניסויים. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מוכנים לריכוז (ראה שלב 2.4) והדמיה אם מתבצע ללא טיפול. אם מטופלי תאים, דגירה תאים עם הטיפול המתאים ולהמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז 1 מ&quot;ל של התרבות על ידי צנטריפוגה XG ב 6000 במשך 15 שניות וresuspension של גלולה התא ב20 μl של תקשורת. תנאים אלה למקסם את מספר התאים להבחנה בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 2 μl של תאי resuspended לשקופית. לכסות עם coverslip (מס &#39;1.5, רצוי בעל ביצועים גבוהים 170 ± עובי 5 מיקרומטר), וסוגר את הקצוות של coverslip עם לק או ברורים valap (ראה ריאגנטים). לאטום עם valap, להמס כמות קטנה במרית מתכת על ידי מחזיק אותו מעל להבת מבער בונזן, ולאחר מכן התפשט בכמות קטנה לאורך הקצוות של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים על 30 מעלות צלזיוס במהלך ההדמיה. דוד אובייקטיבי על עדשת טבילת שמן 100x משמשת להדמיה עובד היטב עבור יישום זה. בתנאים אלה, מורפולוגיה המיטוכונדריה, מדינת חיזור ורמות ה-ATP יישארו ללא שינוי במהלך הדמיה למשך 10-15 דקות. </li></ol> 3. התקנת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה להדמית מיטו-roGFP1 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום השלבים כאן הם מותאמים לAxioObserver.Z1 מיקרוסקופ מצויד במקור Colibri LED עירור, אורקה ER מצלמה רחבת שדה ותוכנת רכישת AxioVision. Photobleaching של שני הערוצים וphotoconversion של חמצון מיטו-roGFP1 מצטמצם משמעותי שימוש בתאורת LED בהשוואה לתאורת כספית קשת מנורה (ראה להלן). על מנת למקסם את האות ורזולוציה, השתמש בצמצם הגבוה ביותר המספרי האפשרי במטרה, וההגדלה הנמוכה ביותר המספקת רזולוציה מרחבית מספיק. בנוסף, למיטו-roGFP הדמיה, ודא שהמטרה מעבירה היטב ב365 ננומטר. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar האובייקטיבי (Zeiss) עובד היטב עבור יישום זה. הגדר את תוכנת הרכישה כדי ללכוד את מיני מיטו-roGFP1 חמצון ומצטמצמים. אנו משתמשים בתנאים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הערוץ לחמצון מיטו-roGFP להשתמש עירור ב 365 ננומטר (100% כוח LED) ומסנן פליטה מתאים לGFP, כגון 38 הם לסנן סט (Zeiss), עם excitatio הכלולהn המסנן הוסר מהקובייה. הסרת מסנן העירור מאפשרת עירור ב 365 ננומטר ושני 470 ננומטר, ללא הצורך לעבור מסננים, וכך להגדיל את הרזולוציה זמן השגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הערוץ למופחת מיטו-roGFP להשתמש עירור ב 470 ננומטר (100% כוח LED), וכפי שהוזכר לעיל, אותה קוביית מסנן הפליטה המשמשת לחמצון מיטו-roGFP. להגדיר את המצלמה ל1x1 binning כדי לייעל את הרזולוציה מרחבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התוכנה לרכישת AZ מחסנית בהיקף של 11 פרוסות עם מרווח 0.5 מיקרומטר, איסוף שני ערוצים בכל עמדת z. מצב זה של רכישה הוא איטי יותר מאשר רכישת כל ערימת z בתורו, אבל הוא מונע חפצים הנובעים מתנועה המיטוכונדריה בין רכישת ערוצי חמצון ומצטמצמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת מספר תאים כדי לקבוע זמן חשיפה מתאים, הפקת אות להרוות חזקה, אבל לא. חשוב לשמור על היחס של זמני חשיפה לחמצון והקטין מיטו-roGFP1 לכל הניסויים. לדוגמה, אם מתחמצנים את זמני החשיפה ולהקטינו מיטו-roGFP1 הם 300 ו -100 אלפיות שני, בהתאמה, ולאחר מכן את זמן החשיפה לחמצון מיטו-roGFP1 צריך להיות 3 פעמים שהקטין למיטו-roGFP לכל הניסויים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה להדמית mitGO-ATeam2 על מיקרוסקופ confocal רפאים כדי לכמת רמות ה-ATP באמצעות mitGO-ATeam2, הקרינה מGFP (ננומטר הפליטה המרבי 510) יש להבחין בין שמOFP (ננומטר הפליטה המרבי 560). ישנן מערכות סינון הקרינה שתפתורנה את הקרינה הנפלטת מfluorophores אלה. עם זאת, אנו מוצאים כי גלאי רפאים, נגיש בליזר רבים סריקה מיקרוסקופי confocal, עובד הכי טוב עבור יישום זה. גלאי רפאים מפריד בין פליטת הקרינה למרכיבים רבים (בדרך כלל 32 או יותר) על פי אורך גל. כמה להקות גל סמוכות ניתן לשלב ערוץ תמונה אחת. אורכי הגל שנבחרו באופן אמפירי בשילוב כדי למקסם אות GFP וOFP תוך הימנעות מוצלב של אות שהייתי לבלבל סריג מדידה. השתמש בעדשת הצמצם המספרית הגבוהה ביותר הקיימת. אנו משתמשים ב100x/1.49 או 60x/1.49 עדשת Apo-TIRF. אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal A1R ניקון פועל תוכנת אלמנטי ש&quot;ח. הגדר את תוכנת הרכישה כדי ללכוד את מיני mitGO-ATP ATeam2 בכריכות וATP-מאוגד. אנו משתמשים בתנאים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר חריר ל1.0 יחידות אווריריות (AU), אשר במערכת שלנו תואמות את AZ הרזולוציה של כ 0.42 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר זום סריקה כדי להתקרב לגבול דגימת נייקוויסט, אשר תהיה למקסם את המידע המרחבי בתמונה. במערכת שלנו הוא בגודל פיקסל 0.12 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל המיטוכונדריה עשויה לעבור במהלך הדמיה, זה יכול להיות מועיל כדי להגביר את מהירות הדמיה על ידי חיתוך לשדה 512 x 256 פיקסלים. הזמן הכולל נדרש לתמונת מסגרת אחת במערכת שלנו הוא 1.0 שניות, כולל סריקה ממוצעת פי 2. בהתאם לרזולוציה מרחבית רצויה, השדה יכול להיות קצוץ נוסף לincreasדואר רזולוציה זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקסייט ב 488 ננומטר, ולאסוף פליטה 500-520 ננומטר עבור ה-GFP, ו550-580 ננומטר לOFP. ערכים אופטימליים בפועל עשויים להשתנות עם מאפיינים של מערכת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח לייזר האופטימלי למערכת שלנו הוא בין 6.0 ו 6.4%. כוח לייזר האופטימלי ישתנה עבור כל מערכת מיקרוסקופ, אבל באופן אידיאלי להיות נמוך ככל האפשר, תוך הפקת תמונה לפירוש. השתמש במד כוח פנימי או חיצוני כדי לפקח על שינויים בכוח לייזר, אשר מתרחשים בדרך כלל על פני זמן בכל מערכת אופטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם רווח גלאי ועוצמת אור תאורה על מנת למקסם את הטווח של ערכים המזוהה פיקסל אך להימנע להרוות את האות, כלתאים רבים ככל האפשר. לא לנתח כל תאים המכילים יותר מ 1% פיקסלים רוויים. תמונה כל הדגימות באמצעות אותה מטרה, כוח לייזר, סריקת זום, גודל פיקסל, רווח, ולקזז. </li></ol></li></ol> 4. רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור מוקדי PLA<html> ne של תאים בעלי עניין באמצעות אור מועבר כדי למזער הלבנת הבדיקה הניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איתור תא אחד או יותר של עניין, לאסוף Z-סדרה באמצעות כל עומקו של תא טיפוסי (כ 7 מיקרומטר) באמצעות גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת תאים אחרים בעלי עניין בשקופית, אבל אין תמונה בשקופית אחת למשך זמן ארוך יותר מ -15 דקות. לאחר 15 דקות בשקופית, תאים מאבדים את יכולת קיום. </li></ol> 5. אנליזה רמת ה-ATP מיטוכונדריאלי נקבעת על ידי מדידת היחס בין פליטת mitGO-ATeam2 ב 560 ננומטר כדי שב 510 ננומטר 27 מדינת חיזור של אברון נמדדת כיחס מצטמצם לחמצון (R / O) של מיטו-roGFP;. כלומר פליטה ב 510 ננומטר על עירור ב 470 ננומטר מחולק בפליטה ב 510 ננומטר על עירור ב 365 ננומטר. לפני חישוב היחס, אנו לחסר רקע ולקבוע ערך סף לפיקסלים השייכים למיטוכונדריה ניאון. אוהל &quot;&gt; ברשות ציבור (למשל ImageJ 30) או זמינה מסחרי (Volocity למשל, פרקין אלמר) תוכנה יכולה לשמש לניתוח של מיטו-roGFP1 או mitGO-ATeam2. בהתאם לתוכנה המשמשת לרכישת תמונה ולניתוח, את התמונות ייתכן שיצטרך להיות מומר לפורמט אחר, כמו TIFF, לפני פתיחתם בתוכנת הניתוח. אם תמונות מומרות, זה חיוני כדי לוודא שערכי הפיקסלים לא משתנה במהלך ההמרה. ניתוח של נתונים מיטו-roGFP1, באמצעות שתי התוכניות מתוארת להלן. תפריטי תכנית ואפשרויות לבחירה בתוך כל תפריט מודגשים בכתב נטוי מודגש. ניתוח ImageJ 5.1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתיחת תמונות ולשנות את סוג ל32 סיביות: תמונת → → סוג 32 ביט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין (ROI) באזור שבו אין תאים. לחשב את עוצמת הממוצעת בהחזר על השקעה זו: נתח → מדוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הרקע הממוצע מחושב מהמחסנית: תהליך → המתמטיקה → לחסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות Z-המחסנית נגרעה, למצוא את הפרוסה אמצעית ועל סף מיטוכונדריה: תמונת → התאם → הסף ולחץ על החל על סף החלון. אחול על כל הפרוסות בערימה. בדקו הגדרת פיקסלים רקע לנאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור יחס z ערימה: תהליך → מחשבון תמונה מחלקים את הערימה המופחתת על ידי הערימה מתחמצנת z לניתוח מיטו-roGFP1. מחלקים את תמונת 560 ננומטר (ATP המאוגד) על ידי 510 ננומטר (מאוגד ATP) תמונה לניתוח mitGO-ATeam2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את ההחזר על ההשקעה מסביב לאזור של עניין. בחר לנתח → כלים → ROI מנהל, ולחץ על הוסף כדי להקליט את ההחזר על ההשקעה. אזורים מרובים עשויים להיות מאוחסנים במנהל. במנהל החזר על השקעה, בחר את כל ROIs, ואז לבחור Mעפרות → Multi-מדוד למדוד כל פרוסות המחסנית. יצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח. </li></ol> ניתוח Volocity 5.2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבוא תמונות לתוך ספריית Volocity וליצור תמונה ברצף עם 2 ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין (ROI) באזור שבו אין תאים. בחר: כלים → יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Volocity כדי לחשב את הרקע: קבל מהחזר על ההשקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הסף לכלול מבני המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את האפשרות להחיל LUT קשת לערוץ היחס. ערוץ עוצמת-מווסת עשוי להפיק תמונה פחות רועשת לpresenta tion, אבל זה לא צריך להיות בשימוש כדי לכמת את היחס ממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה המדידה, בחר בערוץ יחס החזר על השקעה ולצייר מסביב לאזור של עניין. מדוד את ערוץ היחס, למעט ערכים אפס. אזורים מרובים עשויים להיות נבחרו ונמדדובאותו הזמן. יצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

כאן, אנו מתארים שיטות לשימוש מיטו-roGFP1 וmitGO-ATeam2 כחיישנים ביולוגיים להערכת מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP בתאים חי שמרים. אנו מוצאים את ביטוי שתוצאות פלסמיד שמקורן מיטו-roGFP1 או mitGO-ATeam בכמותית המיקוד למיטוכונדריה, ללא כל השפעה ברורה על מורפולוגיה של המיטוכונדריה או הפ?...

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים לייצור ה-ATP, סינתזה של חומצות אמינו, חומצות שומן, heme, ברזל וגופרית אשכולות pyrimidines. מיטוכונדריה גם לשחק תפקידים מרכזיים בומאוסטזיס סידן, וברגולציה של אפופטוזיס. 1 קישורי ראיות הגדלת מיטוכונדריה למחלות הזדקנות וקשורות לגיל, כולל מחלת פרקינסון, אלצהיימר, טרשת לרוחב amyotrophic, ומחלת הנטינגטון. 2 בעוד אנשים חיים את כל חייהם עם מוטציות בחלבוני המיטוכונדריה הקשורים למחלות ניווניות, את תסמיני המחלה מתרחשות רק מאוחר יותר בחיים. זה מצביע על כך ששינויים מתרחשים במיטוכונדריה עם גיל שיאפשר מחלת הפתולוגיה לצוץ. ואכן, כושר המיטוכונדריה הוא מתואם עם בריאות כללית תא ותוחלת חיים בשמרים ותאי יונקים. 3,4 כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בחיישנים ביולוגיים גנטי מקודדים, רציומטרי ניאון כדי להעריך שני מאפיינים קריטיים של mitochondria בתאים חי שמרים: מדינת חיזור ורמות ה-ATP. תפקוד המיטוכונדריה בגיוס אנרגיה אירובי הוא מבוסס היטב. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי היא תוצר של הפחתת חמצון ומינים באברון, כולל NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, דיסולפיד גלוטתיון / גלוטתיון (GSH / GSSG) ומיני חמצן תגובתי (ROS). שחרר את סוגר המיטוכונדריה או היפוקסיה משפיע על פעילות נשימה המיטוכונדריה ומשנה את היחס בין NAD + ל NADH באברון. ROS, אשר מיוצרים מהעברת אלקטרון בין קומפלקסים לא יעילה של שרשרת העברת האלקטרונים בקרום המיטוכונדריה הפנימית, כמו גם מdeamination של אמינים באמצעות מונואמין אוקסידאז בקרום החיצוני של המיטוכונדריה 5, שומנים, חלבונים, נזק וחומצות גרעין ויש לי נקשר להזדקנות ומחלות ניווניות גיל הקשורים 6,7,8. ROS גם לשחק תפקיד בהעברת אותות במ &#39;itochondria, באמצעות חמצון של GSH. לדוגמה, NADH דהידרוגנז לא רק תורם לייצור ROS אלא גם מוסדר באמצעות אינטראקציות עם בריכת גלוטתיון 9,10. דהידרוגנז וaconitase α-ketoglutarate, רכיבים של מחזור TCA, מפגינים פעילות מופחתת בחמצון סביבות 11,12. ואכן, תקנת חיזור תלויה של פעילות aconitase נשמרת מחיידקים ליונקים 13,14. לפיכך, ניטור מצב חיזור ורמות ה-ATP של המיטוכונדריה הוא חיוני להבנת תפקודם והתפקיד במחלת פתולוגיה. שיטות ביוכימיות שמשו כדי להעריך את מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים שלמים או מבודד מיטוכונדריה. שיטות המשמשות באופן נרחב כדי להעריך את מצב חיזור של תאים או שלמים מבודדת המיטוכונדריה מבוססות על מדידת הרמות של זוג חמזור GSH / GSSG 15. המערכת נמצאת בשימוש luciferin-לוציפראז נפוץ למדידת המיטוכונדריהרמות ה-ATP בכל תאים שלמים permeabilized או מבודד המיטוכונדריה. 16,17,18,19,20 ב assay זה, לוציפראז נקשר ה-ATP ומזרזת חמצון של וchemiluminescence מluciferin. 21 עוצמת האור הנפלט הוא ביחס ישר לכמות של ה-ATP בתערובת התגובה. 22 שיטות אלה חשפו מידע מהותי בנוגע לתפקוד המיטוכונדריה, כולל מציאת כי בחולים עם מחלות ניווניות, כמו מחלת אלצהיימר, יש רמות נמוכות באופן חריג ה-ATP. 23 עם זאת, הם לא יכולים לשמש למגורים, תמונת תאים שלמים. יתר על כן, שיטות המבוססות על ניתוח כל התא מספקות ממוצעת של מדינת חיזור או רמות ה-ATP בכל התאים של התא. מדידות באברונים מבודדים הן פוטנציאל בעייתיים משום שמדינת חמזור המיטוכונדריה או רמות ה-ATP עשויה להשתנות במהלך חלוקה subcellular. לבסוף, מחקרים שנעשה לאחרונה מהמעבדה ועוד מצביעים על כךהמיטוכונדריה בתוך תאים בודדים הן הטרוגנית בפונקציה, אשר בתורו משפיעה על תוחלת החיים של תאים אם ובתה. 3 לפיכך, יש צורך למדוד את רמות ה-ATP והמיטוכונדריה מדינת חיזור בתאים חיים עם הרזולוציה subcellular. את biosensors לתפקוד המיטוכונדריה מתואר כאן הם על בסיס ה-GFP. GFP חיזור רגיש (roGFP) 24,25 הוא גרסת ה-GFP שבו מוסף החשוף על פני השטח cysteines למולקולה. roGFP, כמו פראי סוג של GFP, יש שתי פסגות עירור (ב ~ 400 ננומטר ו ~ 480 ננומטר) ושיא פליטה אחד ב~ 510 ננומטר. חמצון של שאריות ציסטאין בתוצאות roGFP בעלייה בעירור ב ~ 400 ננומטר. הפחתה של cysteines האלה מעדיפה עירור ב ~ 480 ננומטר. לפיכך, היחס בין פליטת ננומטר 510 על עירור של roGFP ב480 ננומטר ו -400 ננומטר מגלה את הכמות היחסית של חמצון מופחת וroGFP, המשקף את מצב חיזור של הסביבה של fluorophore. שני versיונים של roGFP נמצאים בשימוש נרחב: roGFP1 וroGFP2. שניהם מכילים את אותם הוספות ציסטאין. roGFP1 מבוסס על פראי סוג GFP וroGFP2 מבוסס על S65T GFP, שבו יש עירור יעיל יותר ב480 ננומטר ופחות יעיל בעירור 400 ננומטר לעומת wtGFP 24. roGFP1 הוא פחות רגיש מאשר pH roGFP2 והטווח הדינמי שלה מרחיב עוד יותר לתוך הטווח המופחת. לפיכך, roGFP1 עשויה להיות שימושי יותר לניטור תאים יותר להפחתה כגון המיטוכונדריה או cytosol, ותאים בעלי חומציות משתנה, כגון endosomes. roGFP2 מציע אות בהירה, בחלק מהמחקרים, טווח דינמי גדול יותר מroGFP1 24,26. מחקרים בthaliana ארבידופסיס מצביעים על כך שהזמן הנדרש לתגובה לשינויים במצב חיזור הוא דומה בשני החיישנים (t ½ לחמצון, 65 ו -95 שניות ולא ½ להפחתה, 272 ו 206 שניות, לroGFP1 וroGFP2, בהתאמה). 26 MitGO-ATeam2 הוא פולשנית, אמינהחיישן שמודד את המיטוכונדריה ה-ATP בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים. GO-ATeam הוא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שמורכבת המקטע של ε F o F-ATP synthase 1 דחוקה בין סריג תורם וחלבוני ניאון acceptor (GFP וכתום חלבון פלואורסצנטי (OFP), בהתאמה). 27 כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם בסמיכות לacceptor ולאפשר להעברת אנרגיה מתורם לacceptor. ישנן שתי גרסאות של Go-ATeam, GO-ATeam1 וללכת-ATeam2. יש GO-ATeam2 זיקה גבוהה יותר לMgATP מאשר ללכת-ATeam1, מה שהופך אותו מתאים יותר למדידה בדרך כלל נמוכים יותר [ATP] במיטוכונדריה לעומת cytosol. 27 לחקור מדינת חמזור המיטוכונדריה, אנו נבנו חלבון היתוך (מיטו-roGFP1) בהיקף של roGFP1 התמזג רצף מנהיג ATP9ND הביע מביטוי שמרי centromere מבוסס (מספר עותק נמוך) פלסמיד תחת שליטה של ​​דהידרוגנז glyceraldehyde-3-פוספט החזק (GPD) האמרגן (p416GPD, Addgene). אנחנו השתמשנו roGFP1 לחקור את מצב חיזור של המיטוכונדריה בהקשר של הזדקנות של cerevisiae Saccharomyces פטריית המודל. אנו מוצאים כי roGFP1 יכול לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה המתרחשים במהלך הזדקנות ובתגובה לזמינות חומרי הזנה, אבל אין כל השפעה מזיקה לכאורה על תאי שמרים. כמו כן, אנו רואים השתנות במצב חיזור של המיטוכונדריה בתוך תאי שמרי חיים בודדים, ממצא זה מדגיש את החשיבות של biosensor עם רזולוציה מרחבית subcellular. MitGO-ATeam2 הנו נגזרת של GO-ATeam2, שבו יש רצף של המיטוכונדריה אות VIIIA מקטע מונואמין ג ציטוכרום הוכנס בתחנה הסופית של אמין GO-ATeam2. -27 שונה חללית mitGO-ATeam2 (בחביבות על ידי המעבדה של ח Noji, מכון OF מדע ומחקר תעשייתי, אוניברסיטת אוסקה, יפן) לשימוש בשמרים על ידי subcloning, באמצעות Xba1 ואתרי HindIII, לתוך וקטור ביטוי שמרי pAG415GPD-ccdB (Addgene, קיימברידג&#39;, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב), שהוא נמוך עותק פלסמיד המכיל את אמרגן GPD המכונן החזק. אנחנו הביעו mitGO-ATeam2 בשמרי ניצנים, ולמצוא, לפי counterstaining עם הצבע DAPI-DNA המחייב, כי זה localizes באופן בלעדי למיטוכונדריה, שם היא משמשת כבדיקה יעילה למדידת שינויים פיסיולוגיים ברמות ה-ATP המיטוכונדריה. roGFP וללכת-ATeam שניהם מקודדים גנטי. כתוצאה מכך, הם יכולים להיות הציגו ומתוחזק ביציבות בתאים שלמים, ולספק מידע על מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים בודדים, המתגוררים. יתר על כן, שני biosensors לעקוב אחר שינויים במצב חיזור או רמות ה-ATP שמתרחשות בתנאים פיסיולוגיים. 28 שתי הבדיקות גם ratiometric. כתוצאה מכך, מדידות שנעשו עם בדיקות אלה אינן מושפעות על ידי צ&#39;הnges בריכוז biosensor או תאורת מדגם או עובי. לבסוף, שני biosensors לספק רזולוציה מרחבית subcellular. ואכן, roGFP כבר ממוקד למיטוכונדריה, ER, endosomes וperoxisomes 24, ויכול לזהות שינויים במצב חיזור של כל אחד מהאברונים האלה, בלתי תלויים ברמת החומציות.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

יש לי המיטוכונדריה תפקידים בתהליכים תאיים רבים, מחילוף חומרים של אנרגיה והומאוסטזיס סידן לשלוט של הסלולר תוחלת חיים ומות תאים מתוכנת. תהליכים אלה משפיעים ומושפעים מהמצב של חיזור וייצור ATP במיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים ratiometric, מקודדים גנטי שיכול לזהות מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאים חי שמרים. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי נמדדת באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק חיזור רגיש (roGFP) כי הוא ממוקד למטריקס המיטוכונדריה. מיטו-roGFP מכיל cysteines בעמדות 147 ו -204 של ה-GFP, אשר עוברות חמצון הפיך ותלוי בסביבה וצמצום, אשר בתורו משנה את ספקטרום העירור של החלבון. MitGO-ATeam היא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שבמקטע של ε o F F-ATP synthase 1 הוא דחוקה בין סריג תורם acceptor fluoחלבוני rescent. כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם acceptor בסמיכות ומאפשרת העברת אנרגיה תהודה הקרינה מהתורם לacceptor.

מדידת מדינת חמזור המיטוכונדריה עם מיטו-roGFP כאן, אנו מראים שיש לו מיטו-roGFP1 הטווח הדינמי כדי לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה מחמצון מופחת באופן מלא לחיים בתאי שמרים, מבלי להשפיע על צמיחת תאי שמרים או במורפולוגיה של המיטוכונדרי...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים, מקודדים גנטי ratiometric, המבוססים על ה-GFP, כדי לפקח על מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאי שמרי חיים.

Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.9K Views.  Columbia University. אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים, מקודדים גנטי ratiometric, המבוססים על ה-GFP, כדי לפקח על מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאי שמרי חיים.

Video: Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...