Nous remercions Wendy Chao pour son soutien à un examen critique. Ce travail a été soutenu par Bausch &amp; Lomb Vitreoretinal Fellowship (HM), National Eye Institute subvention EY014104 (JWM), de la recherche visant à prévenir Blindness Foundation (DGV), Fonds de recherche des yeux Lions (DGV), et un don généreux de la famille Yeatts (JWM et DGV).

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec l&#39;Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l&#39;utilisation d&#39;animaux dans ophtalmique et Vision Research, et les directives et les règlements énoncés par le Ear Infirmary Comité de protection des animaux Massachusetts Eye et. Une. Prétraitement <ol><li> Anesthésier à 8 semaines d&#39;âge souris avec une injection intrapéritonéale d&#39;un mélange de 60 mg / kg de kétamine et de 6 mg / kg de xylazine. </li><li> Coupez les moustaches. Cela se fait parce qu&#39;ils interfèrent avec la visualisation et le placement de l&#39;instrument. </li><li> Dilater la pupille avec 5% de phényléphrine et tropicamide 0,5%. </li><li> Couper les cils. Cela se fait aussi parce qu&#39;ils interfèrent avec la visualisation et la mise en place de l&#39;instrument. </li><li> Appliquer une anesthésie topique (solution ophtalmique à 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne). </li></ol> 2. Chirurgie sous le microscope <ol><li> Réglez la souris dans une pos latéraleition avec le nez vers le chirurgien. Une pincée de pointe est effectuée pour confirmer l&#39;anesthésie chirurgicale, et des gants stériles sont enfilé avant de commencer la chirurgie. </li><li> Inciser la conjonctive au limbe temporal postérieur et séparer la conjonctive de la sclérotique. Éviter de pénétrer dans la sclérotique. Après cette étape, saisir la conjonctive au limbe avec une pince pour contrôler l&#39;œil. </li><li> Faire une incision sclérale auto-obturant l&#39;aide de la pointe d&#39;une aiguille G 30 avec le biseau dirigé vers le haut. Ajoutez un tunnel scléral à travers la sclère et de pénétrer dans la sclérotique de la choroïde (Figure 1). Éviter de pénétrer dans la rétine. Si le saignement se produit de la choroïde et sort par la plaie sclérale, effectuer une astriction avec une lance chirurgicale jusqu&#39;à ce que le saignement cesse. Cette blessure scléral sera auto-étanche à une pression intraoculaire. </li><li> Perforer la cornée avec une aiguille 30 G pour réduire la pression intraoculaire. Utilisez l&#39;aiguille parallèle à l&#39;iris pour éviter de blesser les iris et le cristallin pendant entry dans la chambre antérieure. La pression intra-oculaire provoque la blessure à l&#39;auto-joint. </li><li> Insérez une aiguille G 33 relié à une seringue ul dans l&#39;espace sous-rétinien Hamilton 10 avec le biseau dirigé vers le bas (vers l&#39;œil intérieur), et injecter hyaluronate de sodium 3,5 pi doucement pour détacher la rétine neurosensorielle de l&#39;EPR sous-jacent. Éviter de pénétrer dans la rétine avec l&#39;aiguille 33 G parce hyaluronate de sodium ira dans l&#39;espace vitré mais pas l&#39;espace sous-rétinien si la rétine est pénétré. Aussi, éviter l&#39;injection rapide car il va créer une déchirure orale, et hyaluronate de sodium va s&#39;infiltrer dans la chambre antérieure. </li><li> Soit l&#39;humeur aqueuse de s&#39;écouler hors de la perforation de la cornée en pressant la cornée autour de la perforation de la cornée avec une pince pour régler la pression intra-oculaire. </li><li> Confirmer l&#39;absence de fuite de la plaie sclérale aide d&#39;une sonde chirurgicale. </li><li> Pour réduire le risque de fuite de l&#39;hyaluronate de sodium, de placer la colle cyanoacrylate chirurgicale surla plaie sclérale. </li><li> Remettez la conjonctive à sa position initiale à l&#39;aide de la colle cyanoacrylate chirurgicale. Cela permettra de réduire encore davantage le risque de fuite de l&#39;hyaluronate de sodium. </li><li> Vérifiez le fond à l&#39;aide d&#39;un couvercle en verre et confirmer la création d&#39;un RD bulleuse sans hémorragie sous-rétinienne. </li></ol> 3. Après traitement <ol><li> Appliquer une pommade antibiotique bacitracine à l&#39;oeil afin de réduire le risque d&#39;infection. </li><li> Garder la souris sur un tapis de chauffage pour éviter l&#39;anesthésie (mélange de kétamine et de xylazine) de provoquer une basse température corporelle à la suite de la pression artérielle basse. </li><li> Mettez les souris vers la cage de l&#39;animal après ils se réveillent de l&#39;anesthésie. Surveiller les souris quotidiennes de complications. Si des complications surviennent, euthanasier les souris comme décrit ci-dessous. </li></ol> 4. Sacrifice <ol><li> Euthanasier les souris par dislocation cervicale après l&#39;injection intrapéritonéale de 100 mg / kg de pentobarbital de sodium, et enucleaTE yeux à des moments appropriés pour chaque expérience (non représenté). Évitez d&#39;appliquer une pression sur l&#39;œil pendant l&#39;énucléation parce hyaluronate de sodium peut s&#39;échapper. DR bulleuses devraient être persistant pendant au moins 14 jours. </li></ol>

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Le Ear Infirmary Massachusetts Eye et possède une participation dans trois brevets américains dirigés à l&#39;utilisation de la vertéporfine. En outre, l&#39;Ear Infirmary Massachusetts Eye et a droit de propriété sur certaines demandes de brevet visant à la destruction sélective de néovascularisation choroïdienne sous-rétinien pour le traitement de la dégénérescence maculaire et d&#39;autres troubles. Le Ear Infirmary Massachusetts Eye et reçoit des redevances à la suite de ces brevets et demandes de brevets et le Dr Miller reçoit une part de la même conformément à la institutionnel brevet des politiques et procédures de Ear Infirmary, qui comprend des dispositions sur le partage des droits Massachusetts Eye et. L&#39;auteur, le Dr Joan W. Miller, est un ancien membre du conseil et ancien actionnaire d&#39;Alcon, Inc., et est actuellement consultant pour Alcon; Imagen Biotech, Inc., ISIS Pharmaceuticals; Kalvista Pharmaceuticals; Regeneron Pharmaceuticals, Inc et ONL Therapeutics, LLC. Dr Demetrios G. Vavvas serten tant que consultant pour Roche, Genentech, Kala Pharmaceuticals.

Plusieurs méthodes pour établir un modèle de RD dans les yeux de rongeurs ont été signalés 3-15, 22. La plupart d&#39;entre eux utilisent l&#39;injection sous-rétinienne d&#39;hyaluronate de sodium, car c&#39;est une matière visqueuse utilisée au cours de la chirurgie intra-oculaire chez l&#39;homme, et elle n&#39;est pas associée à une quelconque toxicité oculaire connu 1-15. Le hyaluronate de sodium, au lieu de la solution saline normale ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), augmente la durée de la RD. Les méthodes d&#39;injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium utilisent l&#39;une des deux approches: une approche de transvitreal 3-6 ou une approche de transsclérale 7-15. Les deux méthodes sont effectuées avec l&#39;observation du fond d&#39;oeil. Dans l&#39;approche de transvitreal, d&#39;un injecteur sous-rétinien est introduit dans la cavité vitréenne, un rétinotomie est créé dans la rétine périphérique, et le hyaluronate de sodium est injecté dans l&#39;espace sous-rétinien. Dans ce procédé, deux déchirures rétiniennes sont publiés, ce qui augmente le risque de rétinel hémorragie qui pourrait aller dans l&#39;espace sous-rétinien. En outre, il existe un risque de blessure de l&#39;objectif lorsque le rétinotomie est créé. Il existe plusieurs méthodes pour l&#39;approche modifiés de transsclérale. Dans la plupart de ces méthodes 12.7, après réduction de la pression intra-oculaire avec une perforation de la chambre antérieure, une aiguille 30 G raccordée à une seringue remplie de l&#39;hyaluronate de sodium est directement introduit dans l&#39;espace sous-rétinien à travers la conjonctive, la sclère, la choroïde, et RPE. Le hyaluronate de sodium est ensuite injectée dans l&#39;espace sous-rétinien. Le risque de déchirure de la rétine et le cristallin des blessures en utilisant cette méthode de transsclérale est inférieur à celui utilisant l&#39;approche transvitreal. Cependant, le trou pratiqué dans la sclérotique par une aiguille de 30 G est grand, en particulier pour les yeux de souris, et le hyaluronate de sodium injecté dans l&#39;espace sous-rétinien coule facilement hors de l&#39;oeil à travers la plaie sclérale. Cela conduit à une RD inférieure, et moins persistant plus de mort des cellules photoréceptrices variable. En outre, si le saignement se produit dans la choroïdel&#39;étape de perforation sclérale, l&#39;hémorragie se propage dans l&#39;espace sous-rétinien parce que la pression intraoculaire a été réduite avant l&#39;injection sous-rétinienne d&#39;hyaluronate. Plusieurs facteurs peuvent influencer l&#39;effet de RD sur le décollement de la rétine, y compris les sous-rétinien hémorragie et la hauteur et la persistance de la RD 16-21. décès augmente de cellules photoréceptrices avec l&#39;augmentation de la hauteur de la RD 16, 17, et les dommages des cellules photoréceptrices peuvent être plus étendues en raison de la réduction de la diffusion de l&#39;oxygène et des nutriments essentiels de la choriocapillaire avec RD plus élevé par rapport aux RD faible. Hémorragie sous-rétinienne est également toxique pour les cellules photoréceptrices 18-21; mécanismes possibles de cette toxicité dans le décollement de la rétine comprennent une hypoxie et une perturbation métabolique par l&#39;hémorragie sous-rétinienne comme une barrière de diffusion, et la neurotoxicité induite directement par des composants sanguins (tels que le fer). blessure de Lens, qui a été signalé à avoir un effet protecteur sur reticellules ganglionnaires internes 23, peuvent également affecter mort des cellules photoréceptrices après l&#39;induction de RD. En outre, si le site de la plaie d&#39;entrée n&#39;est pas scellée, l&#39;hyaluronate de sodium est susceptible de s&#39;échapper par la manipulation de l&#39;oeil pendant l&#39;énucléation. Cela peut conduire à la classification erronée d&#39;un RD comme peu profondes, qui peuvent à leur tour affecter l&#39;interprétation des résultats. Nous avons modifié la méthode de transsclérale pour injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium pour augmenter la reproductibilité des diététistes et de réduire le taux d&#39;hémorragie sous-rétinienne. L&#39;étape critique de ce protocole est de créer une incision sclérale auto-étanche à l&#39;aide d&#39;une aiguille G 30, qui empêche la fuite de l&#39;hyaluronate de sodium après l&#39;injection. Contrairement aux méthodes précédentes, ce protocole est effectuée sans observation du fond si une plus grande attention est accordée à la plaie sclérale. Application de la colle empêche également le hyaluronate de sodium de fuir hors de l&#39;œil. Dans notre expérience, le taux d&#39;hémorragie sous-rétinienne avec ce protocole wcomme significativement inférieure à celle d&#39;autres protocoles. Si le saignement de la choroïde se produit pendant l&#39;étape d&#39;incision sclérale, il va quitter l&#39;oeil à travers la plaie sclérale car cette étape est réalisée avant la réduction de la pression intraoculaire. Si un saignement se produit choroïdienne après réduction de la pression et de détachement de la rétine neurosensorielle oculaire, le sang va disséquer dans l&#39;espace sous-rétinien. Nous avons trouvé que cela se produise chez environ 5% des cas en revanche pour environ 10-20% avec les autres techniques. Ces animaux doivent être exclus de l&#39;analyse. Cette technique peut également être utilisée pour une injection sous-rétinienne d&#39;un transfert de gène à médiation par vecteur pour cibler des cellules photoréceptrices ou RPE 24, 25. Étant donné que le véhicule typique (PBS, solution saline) pour ces injections est nettement moins visqueux que le hyaluronate de sodium, des techniques standard sont infestés par plus de fuites. La technique décrite ici, en réduisant ce risque, effectue des expériences de transfert de vecteur plus reproductible etfiable.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50660/">Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate</a>. The footnotes were removed from the abstract due to redundancy in the introduction.

Erratum: Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Mort des cellules photoréceptrices et le déclin visuel ultérieur se produit lorsque les photorécepteurs sont séparés de l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine sous-jacente. La séparation physique des photorécepteurs est vu dans diverses maladies de la rétine, y compris la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge (DMLA), la choriorétinopathie séreuse centrale, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie des prématurés, ainsi que rhegmatogène (c. causée par une rupture de la rétine), décollement de la rétine ( RD). Injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium est un modèle largement accepté de créer un RD qui mène à la mort des cellules photoréceptrices, donnant un aperçu de la physiopathologie de la dégénérescence des photorécepteurs 1-15. Dégénérescence des photorécepteurs induite par l&#39;injection de hyaluronate de sodium sous-rétinien, la première fois en 2001 7, a l&#39;avantage d&#39;un cours de temps raisonnable (de quelques jours ou semaines). Cependant, elle peut avoir une variabilité importante de la perte de photorécepteurs cellule de l&#39;animal à animal en raison de deux facteurs majeurs qui affectent mort des cellules photoréceptrices après RD: 1) la hauteur et la durée de la RD, et 2) la survenue d&#39;une hémorragie sous-rétinienne. Il ya une courbe d&#39;apprentissage abrupte technique à la méthode qui contribue à deux facteurs. dégénérescence des cellules photoréceptrices augmente avec la hauteur de la RD, comme la distance entre le pigment épithélial de la rétine (RPE) couche et photorécepteurs augmente 16-17. Conformément à ces rapports, nos expériences précédentes ont montré plus mort des photorécepteurs RDS bulleuses que les diététistes peu profondes. Il a également été rapporté que l&#39;hémorragie sous-rétinienne est toxique pour les cellules photoréceptrices et affecte la mort des cellules photoréceptrices 18-21. De même, nous avons observé plus mort des photorécepteurs dans RDS avec hémorragie sous-rétinienne de diététistes sans hémorragie sous-rétinienne. Par conséquent, les techniques pour réduire la variabilité doivent se concentrer sur la réalisation d&#39;altitudes cohérentes de RD tout en évitant une hémorragie sous-rétinienne. Notre méthode modifiée d&#39;enducing RD peut faire bulleuse reproductible et RD persistante à la même position de l&#39;œil avec rare d&#39;hémorragie sous-rétinienne. Nous avons effectué la chirurgie utilisant une approche temporelle, car il est plus facile de parvenir à un plus large champ opératoire par rapport aux autres sites. Après l&#39;incision de la conjonctive, une incision sclérale auto-étanchéité est réalisée en utilisant une aiguille 30 G. Un tunnel scléral est créée, suivie par la pénétration sclérale dans la choroïde. Si le saignement se produit dans la choroïde cette étape, l&#39;hémorragie va quitter l&#39;oeil à travers la plaie sclérale, et le saignement peut être arrêté par astriction avec une lance chirurgicale. Une chambre antérieure ponction est ensuite réalisée à partir de la cornée afin de réduire la pression intraoculaire. Il s&#39;agit d&#39;une étape importante, car l&#39;injection sous-rétinienne seul entraînera une augmentation de la pression intraoculaire avec l&#39;occlusion de l&#39;artère rétinienne résultant et l&#39;ischémie de la rétine interne. Une aiguille 33 G raccordée à une seringue Hamilton de 10 ul est ensuite inséré dans l&#39;espace sous-rétinien, et 3,5 μ; Hyaluronate de sodium de l est injecté doucement pour détacher la rétine neurosensorielle de l&#39;EPR sous-jacent. Contrairement à d&#39;autres méthodes de RD induisant qui sont effectuées sous la surveillance du fond d&#39;œil, cette technique est réalisée sous observation directe. Depuis la blessure scléral est auto-obturant, hyaluronate de sodium ne sera pas s&#39;échapper après l&#39;injection. Enfin, la colle est placée sur la plaie sclérale, et la conjonctive est remis en place dans sa position initiale. Ces étapes dure réduisent également le risque de fuite de l&#39;hyaluronate de sodium. L&#39;injection de 3,5 hyaluronate de sodium ul crée DR reproductibles (50% de la rétine) dans les yeux de souris 8 semaines d&#39;âge. La création de la plaie auto-obturante est l&#39;étape la plus importante dans notre mode opératoire modifié, car elle empêche le hyaluronate de sodium injecté de s&#39;écouler hors de l&#39;oeil, ce qui permet bulleuse reproductible et DR persistants.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketaject</td>
 <td>Phoenix</td>
 <td>2010025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AnaSed</td>
 <td>LLOYD</td>
 <td>4004821</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide</td>
 <td>Massachusetts Eye and Ear Pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution</td>
 <td>AKORN</td>
 <td>17478-263-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Provics</td>
 <td>Alcon</td>
 <td>8065183085</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Webglue</td>
 <td>Patterson Veterinary</td>
 <td>07-8566128</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MG90</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30G1/2 PrecisionGlide Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Weck-Cel Eye Spears</td>
 <td>Beaver-Visitec</td>
 <td>0008685</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 Microliter Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7635-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>33 gauge, 0.5 inch needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18x18mm Cover Glass</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>18-548A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate

Injection sous-rétinienne de l&#39;hyaluronate de sodium est un procédé largement accepté d&#39;induire un décollement de rétine (RD). Cependant, la hauteur et la durée de RD ou la survenue d&#39;une hémorragie sous-rétinienne peuvent affecter la mort des cellules photoréceptrices de la rétine décollée. Par conséquent, il est avantageux de créer DR reproductibles sans hémorragie sous-rétinienne d&#39;évaluation de la mort des cellules photoréceptrices. Nous avons modifié une méthode précédemment rapporté pour créer bulleuse et RDS persistantes dans un endroit reproductible avec rare d&#39;hémorragie sous-rétinienne. L&#39;étape cruciale de cette méthode modifiée est la création d&#39;une incision sclérale auto-obturante, qui peut empêcher une fuite de l&#39;hyaluronate de sodium après injection dans l&#39;espace sous-rétinien. Pour réaliser l&#39;incision sclérale auto-étanche, un tunnel scléral est créée, suivie par la pénétration sclérale dans la choroïde avec une aiguille 30 G. Bien que l&#39;hémorragie de la choroïde peut se produire au cours de cette étape, astriction avec une lance chirurgicale réduit le taux de l&#39;ourlet de la choroïdeorrhage. Cette méthode permet à un modèle plus reproductible et fiable de mort des photorécepteurs dans des maladies qui impliquent RD comme rhegmatogène RD, la rétinopathie du prématuré, la rétinopathie diabétique, CRSC, et la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge (DMLA).

Pour évaluer la persistance de la RD faite par ce protocole, cryosections ont été faites aux jours 3, 7, et 14 après l&#39;induction de RD. Six yeux ont été utilisés pour chaque point de temps. Hématoxyline et l&#39;éosine (HE) coloration a été utilisé pour visualiser les sections. Toutes les sections ont montré une RD bulleuse approche de la lentille (figure 2). Un œil a montré une hémorragie sous-rétinienne au jour 7. Pas yeux ont montré des signes d&#39;infection ou de blessure de l&#39;objectif. <img src="/files/ftp_upload/50660/50660fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50660/50660fig1highres.jpg" /> Figure 1. La création d&#39;une incision sclérale auto-étanche. Ce schéma montre une image en coupe transversale d&#39;un œil normal de souris. La ligne rouge indique l&#39;incision sclérale auto-obturant. Un tunnel scléral suivie par la pénétration scléral dans la choroïde avec une aiguille 30 G crée une incision sclérale auto-obturant. Cette blessure scléralsera auto-étanche avec la pression intra-oculaire, ce qui peut empêcher une fuite de l&#39;hyaluronate de sodium après injection dans l&#39;espace sous-rétinien et de réaliser des détachements rétiniens bulleuses persistants. <img src="/files/ftp_upload/50660/50660fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50660/50660fig2highres.jpg" /> Figure 2. Évolution dans le temps de décollement de la rétine. Cette photo de fond montre un décollement de la rétine bulleux sans hémorragie sous-rétinienne immédiatement après la chirurgie. Cryocoupes avec hématoxyline et l&#39;éosine (HE) coloration spectacle persistante décollement de la rétine bulleux sans hémorragie sous-rétinienne à travers au moins 14 jours.

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Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Création décollements de rétine expérimentales avec une hauteur reproductible et durable de détachement, et sans hémorragie sous-rétinienne, est important pour l&#39;étude de la physiopathologie des photorécepteurs perte de cellules dans la maladie de la rétine et l&#39;évaluation des interventions thérapeutiques potentielles. Ici, nous rapportons une telle méthode en détail.

Décollement de la rétine modèle chez les rongeurs par injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

retinal-detachment-model-rodents-subretinal-injection-sodium

Research

JoVE Journal

Medicine

20.6K vues.  Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Harvard Medical School.  Création décollements de rétine expérimentales avec une hauteur reproductible et durable de détachement, et sans hémorragie sous-rétinienne, est important pour l'étude de la physiopathologie des photorécepteurs perte de cellules dans la maladie de la rétine et l'évaluation des interventions thérapeutiques potentielles. Ici, nous rapportons une telle méthode en détail. 

Vidéo: Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;œil de la souris

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Recherche

Médecine

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

A l&#39;étape par le protocole de l&#39;étape pour la chirurgie sous-rétinienne chez les lapins

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Studying Left Ventricular Reverse Remodeling by Aortic Debanding in Rodents

To better understand the left ventricular (LV) reverse remodeling (RR), we describe a rodent model wherein, after aortic banding-induced LV remodeling, mice undergo RR upon removal of the aortic constriction. In this paper, we describe a step-by-step procedure to perform a minimally invasive surgical aortic debanding in mice. Echocardiography was subsequently used to assess the degree of cardiac hypertrophy and dysfunction during LV remodeling and RR and to determine the best timing for aortic debanding. At the end of the protocol, terminal hemodynamic evaluation of the cardiac function was conducted, and samples were collected for histological studies. We showed that debanding is associated with surgical survival rates of 70-80%. Moreover, two weeks after debanding, the significant reduction of ventricular afterload triggers the regression of ventricular hypertrophy (~20%) and fibrosis (~26%), recovery of diastolic dysfunction as assessed by the normalization of left ventricular filling and end-diastolic pressures (E/e&#39;&#160;and LVEDP). Aortic debanding is a useful experimental model to study LV RR in rodents. The extent of myocardial recovery is variable between subjects, therefore, mimicking the diversity of RR that occurs in the clinical context, such as aortic valve replacement. We conclude that the aortic banding/debanding model represents a valuable tool to unravel novel insights into the mechanisms of RR, namely the regression of cardiac hypertrophy and the recovery of diastolic dysfunction.

Here we describe a step-by-step protocol of surgical aorta debanding in the well-established mice model of aortic-constriction. This procedure not only allows studying the mechanisms underlying the left ventricular reverse remodeling and regression of hypertrophy but also to test novel therapeutic options that might accelerate myocardial recovery.

Étude du remodelage inverse ventriculaire gauche par débandage aortique chez les rongeurs

To better understand the left ventricular (LV) reverse remodeling (RR), we describe a rodent model wherein, after aortic banding-induced LV remodeling, ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the pathophysiological changes of human OA. However, as the main symptom in the late stage of OA, pain affects the patients&#39; daily life, and there are not many available models. The mono-iodoacetate (MIA)-induced model is the most widely used OA pain model, mainly used in rodents. MIA is an inhibitor of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, which causes chondrocyte death, cartilage degeneration, osteophyte, and measurable changes in animal behavior. Besides, expression changes of matrix metalloproteinase (MMP) and pro-inflammatory cytokines (IL1 &#946; and TNF &#945;) can be detected in the MIA-induced model. Those changes are consistent with OA pathophysiological conditions in humans, indicating that MIA can induce a measurable and successful OA pain model. This study aims to describe the methodology of intra-articular injection of MIA in rats and discuss the resulting pain-related behaviors and histopathological changes.

This study describes the method of intra-articular injection of mono-iodoacetate in rats and discusses the resulting pain-related behaviors and histopathological changes, which provide references for future applications.

Modèle de douleur arthrosique induite par injection intra-articulaire de mono-iodoacétate chez le rat

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. To investigate pathological mechanisms of retinal ischemia, relevant experimental models need to be developed. Anatomically, a main retinal blood supplying vessel is the ophthalmic artery (OpA) and OpA originates from the internal carotid artery of the common carotid artery (CCA). Thus, disruption of CCA could effectively cause retinal ischemia. Here, we established a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion (tBCCAO) to tie the right CCA with 6-0 silk sutures and to occlude the left CCA transiently for 2 seconds via a clamp, and showed that tBCCAO could induce acute retinal ischemia leading to retinal dysfunction. The current method reduces reliance on surgical instruments by only using surgical needles and a clamp, shortens occlusion time to minimize unexpected animal death, which is often seen in mouse models of middle cerebral artery occlusion, and maintains reproducibility of common retinal ischemic findings. The model can be utilized to investigate the pathophysiology of ischemic retinopathies in mice and further can be used for in vivo drug screening.

Here, we describe a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion using simple sutures and a clamp. This model can be useful for understanding the pathological mechanisms of retinal ischemia caused by cardiovascular abnormalities.

Un modèle murin des dommages rétiniens ischémiques induits par occlusion commune transitoire d’artère carotide

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Transplantation d’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle de primate non humain pour les maladies dégénératives de la rétine

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

A Simplified Model for Heterotopic Heart Valve Transplantation in Rodents

There is an urgent clinical need for heart valve replacements that can grow in children. Heart valve transplantation is proposed as a new type of transplant with the potential to deliver durable heart valves capable of somatic growth with no requirement for anticoagulation. However, the immunobiology of heart valve transplants remains unexplored, highlighting the need for animal models to study this new type of transplant. Previous rat models for heterotopic aortic valve transplantation into the abdominal aorta have been described, though they are technically challenging and costly. For addressing this challenge, a renal subcapsular transplant model was developed in rodents as a practical and more straightforward method for studying heart valve transplant immunobiology. In this model, a single aortic valve leaflet is harvested and inserted into the renal subcapsular space. The kidney is easily accessible, and the transplanted tissue is securely contained in a subcapsular space that is well vascularized and can accommodate a variety of tissue sizes. Furthermore, because a single rat can provide three donor aortic leaflets and a single kidney can provide multiple sites for transplanted tissue, fewer rats are required for a given study. Here, the transplantation technique is described, providing a significant step forward in studying the transplant immunology of heart valve transplantation.

This protocol describes a simple and efficient method for the transplantation of aortic valve leaflets under the renal capsule to allow for the study of alloreactivity of heart valves.