Les auteurs tiennent à remercier Malinda Spry pour l&#39;assistance technique. Nous reconnaissons également les sources de financement actuelles et passées: l&#39;Institut national du cancer (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), le Fonds de recherche Wendy Will cas du cancer, la Fondation Markey Cancer, le Réseau de l&#39;enfance et la Jennifer et Dickens Research Foundation mélanome David.

Une. Préparation de la forskoline pour l&#39;administration topique d&#39;un extrait de racine de brut de l&#39;usine de Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) <ol><li> Protocoles pour expériences murines ont suivi les lignes directrices pour la conduite éthique dans le soin et l&#39;utilisation des animaux et ont été approuvés par la institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux Comité à l&#39;Université du Kentucky (Protocole # 00768M2004). L&#39;extrait de racine est constituée à 40% poids / volume dans une base dermatologique norme de 70% d&#39;éthanol, 30% de propylène glycol. </li><li> Peser 200 g de forskoline brut extrait de racine et le transférer dans un bêcher. Pour faire 500 ml de 40% (p / v) de solution, remettre en suspension 200 g de forskoline brut extrait de racine par l&#39;ajout de la plupart, mais pas la totalité du volume du véhicule (70% éthanol, 30% de propylene glycol) et porter la solution à environ 450 ml. </li><li> Agiter pendant une heure à température ambiante. La solution sera un peu visqueux et peut nécessiter une agitation manuelle de «lever» l&#39;extrait en solution avantla barre d&#39;agitation est en mesure de prendre le relais. </li><li> Après une heure d&#39;agitation, verser le mélange dans un cylindre gradué et porter le volume à 500 ml en utilisant un véhicule qui a été utilisé à &quot;rincer&quot; le bêcher qui a été utilisé pour agiter la bouillie (pour maximiser la récupération de la forskoline à partir du bécher) . </li><li> Transférer la suspension de tubes de 50 ml à centrifuger en polypropylène. Centrifugeuse (1500 xg, la température ambiante, 15 min) à l&#39;aide d&#39;une centrifugeuse de table. A ce moment, la matière insoluble sera assez compacté, ce qui permet au surnageant d&#39;être facilement déversé. </li><li> Filtrer la solution à travers une membrane d&#39;acétate de cellulose de 0,22 um pour éliminer toute matière insoluble résiduelle à partir de l&#39;extrait. On utilise un système de haut-bouteille conçue pour la culture cellulaire, ainsi que l&#39;utilisation des pré-filtres qui viennent avec l&#39;appareil pour éviter un colmatage prématuré de la membrane à partir de composants insolubles de l&#39;extrait de racine. Lors de grands volumes de l&#39;extrait, un filtrage d&#39;environ 100 ml à la fois, en changeant le pari préfiltreween chaque volume ajouté. </li><li> Lorsqu&#39;elles sont stockées à la température ambiante, l&#39;extrait maintient l&#39;activité biologique pour jusqu&#39;à un an. </li></ol> 2. Préparation de C57BL / 6 K14-Scf souris pour des traitements topiques <ol><li> Retirer dorsale fourrure des animaux par cisaillement électrique. Anesthésier brièvement les animaux avec de l&#39;isoflurane inhalation pour faciliter la tonte de dorsale fourrure avec des ciseaux électriques équipés d&#39;une tête préparatoire chirurgicale 0,25 mm (Fisher Scientific). De préférence, utiliser un seul type d&#39;anesthésie (par exemple, la kétamine / xylazine) pour minimiser les risques de surdose d&#39;anesthésique. La chambre d&#39;inhalation saturé comporte des risques au travail lorsqu&#39;il est utilisé en dehors d&#39;une hotte et fournit des quantités inconnues de l&#39;anesthésie des animaux. Idéalement, un vaporisateur de précision doit être utilisé. </li><li> Pour supprimer résiduelle chaume de cheveux, traiter les animaux avec un dépilatoire chimique. Administrer une anesthésie à l&#39;animal par une injection ip de la kétamine à 40 mg / kg de xylazine et 4 mg / kg </li&gt; <li> Lorsque les animaux sont anesthésiés de façon adéquate (à en juger par pincement de l&#39;orteil), appliquer une quantité doigt de taille de crème dépilatoire à cisaillé peau du dos à l&#39;aide d&#39;un doigt ganté. Frottez la crème dans la peau pendant 30-60 secondes ou jusqu&#39;à ce que les poils sont clairement visibles dans la crème comme il est déplacé. Laissez la crème sur que pour le montant minimum de temps nécessaire pour l&#39;épilation comme l&#39;exposition prolongée conduit à la combustion chimique de la peau, l&#39;éclatement de l&#39;épiderme et de la mort de la perte de l&#39;intégrité de l&#39;épiderme. </li><li> Essuyez la peau du dos avec des tampons de gaze imbibée d&#39;eau jusqu&#39;à ce que toutes les crèmes a été supprimé. Animaux à sec utilisant des serviettes en papier doux, et leur permettront de récupérer dans un endroit isolé chaud (par exemple cages propres placés sur un coussin chauffant). Épiler les animaux un par un et suivre de près tout au long de la procédure. </li></ol> 3. L&#39;administration topique de la forskoline ou de contrôle des véhicules <ol><li> Les animaux doivent être traités un à la fois. Anesthésier brièvement à inhalerd isoflurane en plaçant la souris au-dessus d&#39;un filtre en nylon perméable à l&#39;air de forme équipée en vertu de laquelle a été placé un papier essuie-isoflurane saturé dans un bocal en verre avec couvercle clair isoflurane saturé dans une hotte. Exposer la souris à l&#39;isoflurane pendant un temps suffisant pour supprimer les mouvements musculaires volontaires mais aussi pour préserver la respiration spontanée (typiquement 10-20 sec). Laissant l&#39;animal dans l&#39;isoflurane trop longtemps se traduira par la suppression respiratoire et la mort. Il est préférable de pécher par excès de «lumière qui&quot; et d&#39;avoir à ré-exposer la souris brièvement plus isoflurane plutôt que de sur-exposer l&#39;animal à la mort de la drogue et les risques. </li><li> Retirer l&#39;animal de la chambre de l&#39;isoflurane et le placer sur un tapis de banc absorbant propre. </li><li> Avec une micropipette 1000 pi équipé d&#39;une pointe de polypropylène à usage unique, établir 400 ul de 40% d&#39;extrait de forskoline brut (animaux de contrôle du véhicule recevront 70% d&#39;éthanol, 30% de propylène glycol seul). </li><li> Transvaser l&#39;extrait sur ledos de l&#39;animal par égouttement il sur la peau, puis, à l&#39;aide du côté de la pointe de la pipette, appliquer l&#39;extrait sur la peau du dos jusqu&#39;à ce que toute la peau a été couvert. Il n&#39;est pas nécessaire d&#39;effacer la peau après application. </li><li> Retour de la souris dans sa cage, et observer attentivement jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère de l&#39;anesthésie. </li><li> Afin que les effets de l&#39;AMPc non pigments ne doivent pas confondre expériences de sensibilité UV, arrêter tous les traitements topiques deux jours avant l&#39;exposition aux UV (effet de pigment dure plusieurs jours au-delà dernier traitement topique). </li></ol> 4. Couleur de la peau de mesure par colorimétrie réfléchissant <ol><li> Anesthésier brièvement la souris avec de l&#39;isoflurane en inhalation (voir ci-dessus). </li><li> Calibrer un colorimètre Minolta en plaçant la tête portable sur la surface blanche standard fourni avec le colorimètre. </li><li> Placez la tête de mesure portable de la chasse du colorimètre avec la peau du dos de l&#39;animal assurer que le cycle apertur 1 cm 2e est complètement enfoncé sur la peau. Prenez au moins trois mesures distinctes dans différents domaines de la peau du dos. </li><li> Calculer moyenne L * Partition ± SD par animal et par groupe de traitement. Colorimétrie réfléchissante peut se faire à n&#39;importe quel moment dans l&#39;expérience. </li></ol> 5. Détermination de la sensibilité aux UV par calcul de &quot;Minimal érythémateuse Dose&quot; (MED) <ol><li> Utiliser des animaux qui ont été pré-traitées avec le véhicule ou la forskoline comme décrit ci-dessus. Anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale d&#39;un mélange standard de kétamine et de xylazine (voir ci-dessus). </li><li> Préparer un morceau de ruban adhésif occlusif-UV pour les tests MED. Pour générer des trous dans la bande, utilisez une perforatrice de grande puissance avec une découpe circulaire 1 cm 2 (Figures 2A et B). Ayant des trous d&#39;une taille définie et la disposition symétrique dans la bande facilite la reconnaissance de modifications de la peau après irradiation. Sur chaque trou dans la bande, appliquer une petite mais facilement détachable pièce<html> de ruban qui peut être retiré à des instants définis pendant l&#39;exposition aux UV pour permettre l&#39;administration de différentes doses d&#39;UV. </li><li> Lorsque les animaux sont suffisamment sédation, placez le ruban sur la surface dorsale. lubrifiant des yeux doit toujours être utilisée sous anesthésie. </li><li> Allumez la source UV composé de deux Westinghouse F15T8UV-B lampes avec une puissance de pointe de 313 nm et une gamme de 280-370 nm. Laissez la lampe à s&#39;équilibrer à une sortie d&#39;UV constante telle que mesurée par un photomètre UV avec un capteur de rayons UVB (faut généralement quelques minutes pour les lampes à réchauffer). </li><li> Sur la base de la vitesse de transmission des UV, tel que mesuré par le photomètre UV, UV calculer le temps d&#39;exposition pour chaque dose désirée. Par exemple, UVB mesures de sortie de notre lampe de 2,4 mW / cm 2. Par conséquent, l&#39;administration de 5 kJ / m 2, la peau aurait besoin d&#39;être exposé à 208 sec (qui est de 3 min et 28 s) de rayonnement UVB, tel que calculé ci-dessous: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Placez les animaux sous sédation (chacune avec bande occlusif en place) ventrale de surface vers le bas pour assurer une exposition même UV. Pour administrer les doses choisies de rayonnement UV, retirer successivement les petites bandes occlusifs couvrant les trous d&#39;exposer 1 cm 2 zones de peau à des doses correctes de rayonnement. Par conséquent, en utilisant l&#39;exemple ci-dessus, si 40 kJ / m 2 est la plus grande dose dans l&#39;expérience, alors que l&#39;animal serait sous la lampe à 27 min et 47 sec total de la peau et dans la condition de 40 kJ / m 2 n&#39;aurait pas d&#39; bande recouvrant tout le temps. Cependant, la bande recouvrant la condition 5 kJ / m 2 serait supprimé quand il ya 208 sec restant dans l&#39;exposition. Moment de retrait de la bande doit être fait pour que chaque état se termine en même temps. </li><li> Après l&#39;exposition aux UV, ôtez la pellicule de la peau du dos, en prenant soin de ne pas déchirer la peau avec des mouvements brusques ou trop énergiques. Placer les animaux dans un endroit calme au chaud pour permettrerécupération de l&#39;anesthésie. </li><li> Surveillance de la souris pendant 24-48 heures à chercher des zones discrètes de l&#39;érythème (rougeur) ou œdème (gonflement) correspondant à des sites anatomiques exposés à la dose spécifique de l&#39;irradiation UV. Documenter les résultats de la peau photographiquement. </li><li> MED valeur correspond à la dose minimale d&#39;UV qui provoque une inflammation telle que définie par un érythème et / ou d&#39;œdème de l&#39;ensemble du cercle de peau exposée. Notez que la pigmentation de la peau peut contester la détermination de MED, cependant, un érythème et un oedème peuvent encore généralement être évalués avec précision, grâce en partie à la forme définie des ouvertures dans la bande pendant l&#39;exposition aux UV. </li></ol> 6. Analyse statistique Analyser les données entre les cohortes de souris par une ANOVA avec post-test de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Des valeurs de p &lt;0,05 sont considérées comme statistiquement significative.

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

En utilisant un modèle animal de l&#39;être humain à la peau claire, nous constatons que l&#39;application topique d&#39;un extrait brut racine forskoline riche s&#39;assombrit robuste l&#39;épiderme en stimulant la production de mélanine dans la peau. Mélanisation épidermique est dépendante de l&#39;expression du facteur de cellules souches dans l&#39;épiderme basales, comme cela se produit dans la peau humaine, mais pas dans la peau non modifiée génétiquement souris. La peau dorsale de souris génétiqueme...

L&#39;incidence du mélanome, la forme la plus mortelle de cancer de la peau, a considérablement augmenté au cours des dernières décennies aux États-Unis, en particulier chez les personnes à peau claire. Preuve moléculaire et épidémiologique forte implique rayonnement UV comme un facteur causal majeur de l&#39;environnement 2-5. L&#39;exposition aux UV renforcée sous forme d&#39;exposition au soleil et l&#39;utilisation des lits de bronzage est susceptible d&#39;être responsable de la plupart des augmentations de mélanome incidence 6-7. risque de mélanome semble particulièrement liée à des coups de soleil 8, en particulier ceux au début de la vie 9-10. Le risque de coup de soleil est liée non seulement à la dose et l&#39;intensité de l&#39;exposition aux UV, mais aussi par des facteurs héréditaires qui influencent la réponse cutanée à un rayonnement UV. pigmentation de la peau est l&#39;un des déterminants les plus importants de la sensibilité aux UV, le risque de coups de soleil et le risque de cancer. Le mélanome se produit environ vingt fois plus souvent chez les personnes à peau claire par rapport à individua peau foncéels 11-13. La mélanine, un pigment produit par les mélanocytes de l&#39;épiderme, est le principal déterminant de teint de la peau. La mélanine est disponible en deux variétés principales: (1) l&#39;eumélanine, un pigment brun / noir foncé efficace pour absorber l&#39;énergie du rayonnement UV, et (2) phéomélanine, un rouge / pigment blond moins efficace pour prévenir la pénétration de photons UV dans la peau. couleur de la peau, la sensibilité aux UV et le risque de mélanome sont en grande partie déterminées par le contenu épidermique eumélanine 14-15. Le plus eumélanine dans l&#39;épiderme, les photons UV moins peut pénétrer dans la peau. En raison de faibles niveaux innées de l&#39;eumélanine, les personnes à la peau claire sont beaucoup plus sujettes à des effets aigus et chroniques du rayonnement UV 16-18. la pigmentation de la peau, le mélanome et le risque de la capacité de &quot;bronzage&quot; après l&#39;exposition aux UV tout en corrélation avec la capacité de signalisation du récepteur de la mélanocortine 1 (Mc1r), une s-G à sept domaines transmembranaires couplés srécepteur de urface sur les mélanocytes 19-22. Lorsque Mc1r se lie à son ligand apparenté à haute affinité, α-mélanocyte stimulating hormone (α-MSH), il est l&#39;activation de l&#39;adénylcyclase et la production de la deuxième camp de messager 23. La réponse physiologique normale de la peau après exposition aux UV comprend la production de l&#39;épiderme de α-MSH par les kératinocytes 24-29. Nous émettons l&#39;hypothèse que d&#39;autres et de kératinocytes dérivées de α-MSH se lie à Mc1r sur les mélanocytes épidermiques, s&#39;engageant dans la production en aval du second messager AMPc par l&#39;activation de l&#39;adénylcyclase 30. taux d&#39;AMPc contrôlent de nombreux aspects de la différenciation des mélanocytes, y compris les voies de survie, réparation de l&#39;ADN et de la synthèse du pigment. signalisation de l&#39;AMPc Mc1r et induisent clairement les niveaux de l&#39;enzyme de pigments et de la production de l&#39;eumélanine. Lorsque la signalisation Mc1r est intacte et les taux d&#39;AMPc mélanocytaires sont robustes, l&#39;eumélanine est produite et la peau s&#39;assombrit. Toutefois, si la signalisation Mc1r est défectueux etles taux d&#39;AMPc cytoplasmiques restent faibles, pheomelanin est produite à la place 1. synthèse de eumélanine peut être stimulé pharmacologiquement par des agents qui augmentent le taux d&#39;AMPc 1,14,31-35. Depuis la protéine Mc1r est un régulateur majeur du risque de mélanome chez l&#39;homme 36-46, nous sommes intéressés aux mécanismes par lesquels Mc1r protège les mélanocytes contre la carcinogenèse induite par les UV. En tant que fondation pour nos études, nous avons généré un Mc1r-modèle murin transgénique variante sur un pur C57BL / 6 génétique 1. Dans ce modèle, facteur des cellules souches (SCF) est constitutivement exprimé dans l&#39;épiderme basaux et des mélanocytes épidermiques interfolliculaires sont retenus dans la peau tout au long de la vie 47, contrairement aux souris non-transgénique, dans lequel mélanocytes localiser au derme dans les follicules pileux. Avec le transgène K14-Scf incorporé, l&#39;épiderme devient pigmenté avec notamment la caractéristique de la mélanine de pigments de pigmentsouche de l&#39;animal 1. souris K14-SCF sur le fond génétique C57BL / 6 de type sauvage signalisation Mc1r ont la peau noire de jais caractérisé par des niveaux très élevés de l&#39;eumélanine pigment. Sans surprise, ces animaux sont très résistants aux UV. En revanche, génétiquement adaptés K14-SCF C57BL / 6 animaux qui abritent un inactif Mc1r mutant n&#39;ont presque pas d&#39;eumélanine dans l&#39;épiderme. Au lieu de cela, ces animaux «d&#39;extension» (Mc1r e / e) ont un teint de peau juste causée par le dépôt de pheomelanin pigment (figure 1A) et sont beaucoup plus sensibles aux UV 48-49. Composés pharmacologiques ayant des propriétés chimiques qui permettent la pénétration dans la peau ont été montré pour induire puissamment eumélanine dans le prolongement (Mc1r e / e) modèle animal K14-Scf en manipulant directement les taux d&#39;AMPc dans les mélanocytes de l&#39;épiderme de la peau. La mélanine régulation à la hausse dans ce modèle a été reported par adénylylcyclase activation 1 ainsi que de la phosphodiestérase 4 inhibition 35. Dans cet article, nous démontrons la préparation et l&#39;application topique de la forskoline en extension (Mc1r e / e) animaux K14-SCF qui modèle la sensible aux UV humain à la peau claire. Nous montrons que l&#39;application deux fois par jour du médicament favorise la mélanisation accélérée, ce noircissement de la peau est due au dépôt de l&#39;épiderme de mélanine et qui induit la mélanine épidermique protège contre les coups de soleil induite par les UV à travers la mesure de la &quot;dose minimale érythémateuse&quot; (MED) 48.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coleus Forskoli extract 20%</td>
			<td>Buckton Scott USA Inc. </td>
			<td>n/a</td>
			<td>Princeton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isothesia, Isoflurane , USP</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>NCD 11695-6776-1</td>
			<td>Dublin, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased Injection</td>
			<td>LA04612</td>
			<td>Shenandoah, Iowa, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl, USP</td>
			<td>Putney</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>St. Joseph, MO, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs.</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Adesco</td>
			<td>05751L</td>
			<td>Solon, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Depilatory cream, Nair</td>
			<td>Church &amp; Dwight</td>
			<td>JF-11 4381322</td>
			<td>Priceton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Germicidal Hg Lamp UV-B</td>
			<td>Westinghouse</td>
			<td>F15T8UV-B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Radiometer photometer</td>
			<td>International light</td>
			<td>1LT400A</td>
			<td>Peabody, MA,USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chromameter</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>CR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data Processor for 	Chromameter CR-400</td>
			<td>Konica Monilta</td>
			<td>DR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

pharmacologic induction of epidermal melanin and protection against sunburn in a humanized mouse model

Équité de la peau, la sensibilité aux UV et le risque de cancer de la peau tout en corrélation avec la fonction physiologique du récepteur de la mélanocortine 1, une protéine de signalisation G s couplé trouve à la surface des mélanocytes. Mc1r stimule l&#39;adénylyl cyclase et la production d&#39;AMPc qui, à son tour, régule à la hausse la production de mélanine dans les mélanocytes de la peau. Afin d&#39;étudier les mécanismes par lesquels la signalisation Mc1r protège la peau contre les dommages UV, cette étude s&#39;appuie sur un modèle de souris avec &quot;peau humanisé&quot; basé sur l&#39;expression épidermique du facteur de cellules souches (SCF). Souris transgéniques K14-SCF conservent mélanocytes dans le épiderme et ont donc la possibilité de déposer la mélanine dans l&#39;épiderme. Dans ce modèle animal, type sauvage résultats de l&#39;état Mc1r en dépôt solide de pigment noir de l&#39;eumélanine et un phénotype anti-UV. En revanche, les animaux K14-SCF avec signalisation défectueux Mc1r capacité présentent une pigmentation rouge / blonde, très peu d&#39;eumélanine dans la peau etun phénotype sensible aux UV. Raisonnement que le dépôt de l&#39;eumélanine pourrait être renforcée par des agents topiques qui imitent signalisation Mc1r, nous avons constaté que l&#39;application directe de l&#39;extrait de la forskoline sur la peau de souris à la peau claire Mc1r défectueux a entraîné robuste induction de l&#39;eumélanine et la protection UV 1. Nous décrivons ici la méthode pour la préparation et l&#39;application d&#39;un extrait de racine naturelle contenant la forskoline à des souris à la peau claire K14-SCF et signaler une méthode pour mesurer la sensibilité aux UV par déterminer la dose érythémateuse minimale (DEM). En utilisant ce modèle animal, il est possible d&#39;étudier comment épidermique AMPc induction et la mélanisation de la peau affectent les réponses physiologiques à l&#39;exposition aux UV.

Souris C57BL / 6 ont été générées sur un fond eumelanotic, pheomelanotic ou amélanotiques intégrant le transgène K14-SCF comme décrit (figure 1A). Cohortes d&#39;extension à la peau claire (Mc1r e / e, Tyr + / +) souris ont été traitées par voie topique avec deux doses quotidiennes de véhicule (70% d&#39;éthanol, 30% de propylène glycol) ou 40% d&#39;extrait de coleus brut forskohlii racine (80 uM par dose) pendant 5 jours (Figure ...

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Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Mélanine épidermique est induite par l&#39;application topique de la forskoline dans un modèle murin de la sensible aux UV humain à la peau claire. Manipulation pharmacologique du taux d&#39;AMPc dans la peau et l&#39;épiderme assombrissant fortement protéger contre l&#39;inflammation médiée par les UV (coups de soleil), telle que mesurée par la dose érythémateuse minimale (DEM) de dosage.

Induction pharmacologique de mélanine épidermique et la protection contre les coups de soleil dans un modèle humanisé de souris

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

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Research

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Medicine

18.0K vues.  University of Kentucky College of Medicine.  Mélanine épidermique est induite par l'application topique de la forskoline dans un modèle murin de la sensible aux UV humain à la peau claire. Manipulation pharmacologique du taux d'AMPc dans la peau et l'épiderme assombrissant fortement protéger contre l'inflammation médiée par les UV (coups de soleil), telle que mesurée par la dose érythémateuse minimale (DEM) de dosage. 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modèle murin de In utero Transplantation

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Recherche

Médecine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

L&#39;immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Création et caractérisation de l&#39;UTI et Cauti dans un modèle de souris

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic differentiation and immune function of the genetically modified cells. The humanized Bone-marrow/Liver/Thymus (BLT) mouse model allows for full reconstitution of a human immune system in the periphery, which includes T cells, B cells, NK cells and monocytes. The human thymic implant also allows for thymic selection of T cells in autologous thymic tissue. In addition to the study of HIV infection, the model stands as a powerful tool to study differentiation, development and functionality of cells derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Here we outline the construction of humanized non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (SCID)-common gamma chain knockout (c&#947;-/-)-Bone-marrow/Liver/Thymus (NSG-BLT) mice with HSCs transduced with CD4 chimeric antigen receptor (CD4CAR) lentivirus vector. We show that the CD4CAR HSCs can successfully differentiate into multiple lineages and have anti-HIV activity. The goal of the study is to demonstrate the use of NSG-BLT mouse model as an in vivo model for engineered immunity against HIV. It is worth noting that, because lentivirus and human tissue is used, experiments and surgeries should be performed in a Class II biosafety cabinet in a Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+) facility.

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

De cellules souches Basé Immunité Engineered contre l&#39;infection à VIH dans le modèle humanisé Souris

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Génération d&#39;un humanisée foie de souris Utilisation hépatique humaine Cellules souches

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induction de l’athérosclérose accélérée chez les souris : le modèle « Wire-Injury »

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Microscopie intravitale et thrombus induction dans le lobe de l&#39;oreille d&#39;une souris sans poils

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Induction et Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations dans le modèle murin

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...