Nous remercions M. Emir Islamovic pour son aide en laboratoire et en serre. Nous remercions également le Dr Sherry Flint-Garcia d’avoir fourni les lignes d’introgression de maïs x teosinte.

1. Croissance du matériel végétal
<ol><li>Sélectionner les lignées végétales pour l’inoculation et le dépistage. Deux lignées de maïs, cinq lignées de téosinte et quarante lignées de maïs x téosinte présentant une résistance non caractéristique à U. maydis ont été utilisées pour ces travaux(tableau 1).</li>
	<li>Plantez des graines pour des expériences expérimentales(injection d’U. maydis) et de contrôle (injection d’eau) d’injection d’aiguille. Faites-le pour chaque lignée de plantes.</li>
	<li>Plantez quatre graines (répliques) pour chaque lignée végétale dans de petits appartements en poussant les graines d’environ 1/2 pouce dans le sol avec le doigt et en les recouvrant légèrement de terre(figures 1A et 1B). N’emballez pas le sol sur la graine. Planter la graine plus profondément ou emballer le sol sur la graine peut causer des problèmes de levée des semis.</li>
	<li>Arrosez les graines dans le sol. Assurez-vous que le sol est trempé et que les graines restent sous le sol après l’arrosage.</li>
	<li>Après l’arrosage, placez les plantes dans une chambre de croissance avec des environnements diurtiques et nocturnes de température de 28/20 °C et 14/10 h de photopériode, respectivement et d’environ 500 μmol/m2 sec   de rayonnements photosynthétiquement actifs au sommet de la canopée. Maintenir l’humidité relative pendant le jour et la nuit à environ 70 % et 90 %, respectivement.</li>
	<li>Gardez toutes les plantes dans la même chambre de croissance pour maintenir un environnement de croissance qui est conforme tout au long de l’expérience.</li>
	<li>Après 10 jours, retirer les plantes de la chambre de croissance et leur inoculer la culture en suspension cellulaire U. maydis à l’aide d’une méthode d’inoculation par injection à l’aiguille. Note: Les plants de maïs peuvent être inoculés 7 jours après la plantation8-10. Cependant, les plantes de teosinte sont trop petites après 7 jours. Par conséquent, inoculer à la fois les plants de maïs et de téosinte 10 jours après la plantation pour assurer leur cohérence dans le cadre de l’expérience (voir l’étape 2.12).</li>
</ol>2. Inoculation par injection d’aiguille
<ol><li>Faites tout le travail dans une hotte à flux laminaire. Retirer les stocks de glycérol U. maydis de l’entreposage au congélateur. Utiliser une boucle stérile et des stocks de glycérol striés de souches de type sauvage U. maydis 1/2 (type d’accouplement a1b1) et 2/9 (type d’accouplement a2b2, près de l’isogénique à 1/2) sur les plaques de gélose au dextrose (PDA) de pomme de terre. Maintenez les souches séparément.</li>
	<li>Placer les plaques de PDA stries d’U. maydis dans un incubateur à 30 °C pendant deux jours. Si vous utilisez un agent pathogène biotrophique différent, utilisez la souche, le média et les conditions de croissance appropriés. Surveiller la croissance de l’agent pathogène au cours de la période de deux jours pour s’assurer que la souche U. maydis se développe bien.</li>
	<li>Retirez les plaques de PDA de l’incubateur après deux jours. Les plaques doivent avoir une bonne croissance pathogène et contenir des colonies simples (Figure 2A). Il est important d’obtenir des colonies uniques. Si des colonies simples ne sont pas présentes, les plaques sont à une concentration plus faible.</li>
	<li>Faites tout le travail dans une hotte à flux laminaire. Utilisez un cure-dent stérile pour sélectionner une seule colonie pour chaque souche parmi les plaques de PDA. Placez le cure-dent contenant une seule colonie dans un bouillon de dextrose de pomme de terre (APB) de 3 ml. Il est conseillé d’avoir 2-3 cultures.</li>
	<li>Placer les cultures d’APB de 3 ml dans un incubateur/agitateur à 30 °C pendant deux jours à 200 tr/min. Surveiller la croissance de la culture au cours de la période de deux jours pour assurer la croissance de la culture. La culture devrait sembler très trouble.</li>
	<li>Retirer les cultures liquides de l’incubateur/agitateur et mesurer la concentration àDO 600 pour s’assurer que les cellules ont été cultivées à une DO de 1,0 (~1 x 107 cellules/ml)17.</li>
	<li>Porter les cultures de suspension cellulaire de U. maydis à une concentration finale de 1 x 106 cellules/ml, en utilisant de l’eau dans un volume de culture final de 30 ml. Cette concentration entraîne systématiquement une bonne infection des plantes par la culture de suspension cellulaire pathogène. 17 ans 
</li>
</ol>Remarque : Diverses concentrations de suspension cellulaire doivent être testées lors de l’utilisation de différentes souches pathogènes afin de déterminer le titre cellulaire approprié nécessaire à l’inoculation18,19. La concentration finale donnée pour la culture en suspension cellulaire peut être utilisée comme point de départ pour le tittering. La concentration appropriée de la culture de suspension cellulaire pathogène doit être vérifiée en visualisant les phénotypes végétaux présentant une bonne infection (figures 3A-E).
<ol start="8"><li>Mélanger des volumes égaux des deux souches d’U. maydis avant l’inoculation. Si vous utilisez une souche pathogène, passez à l’étape 2.9. Préparer des cultures fraîches de suspension cellulaire d’U. maydis pour chaque expérience d’inoculation et jeter les cultures de suspension cellulaire après deux jours.</li>
	<li>Pour l’inoculation expérimentale par injection d’aiguille, remplissez une seringue de 3 ml avec la culture de suspension cellulaire U. maydis en tirant la culture de suspension cellulaire dans la seringue.</li>
	<li>Pour l’inoculation par injection d’aiguille de contrôle, remplissez une seringue de 3 ml avec de l’eau17. Utilisez la même procédure pour l’inoculation expérimentale par injection d’aiguilles.</li>
	<li>Fixez une aiguille hypodermique de 0,457 mm x 1,3 cm à l’extrémité de chaque seringue de 3 ml. La taille d’aiguille choisie fournira la culture de suspension cellulaire entre les feuilles de la plante avec un minimum de dommages au tissu végétal.</li>
	<li>Retirer les plantes expérimentales et témoins de la chambre de croissance 10 jours après la plantation en vue des inoculations par injection d’aiguilles(figure 2B)(voir l’étape 1.7).</li>
	<li>Insérez soigneusement l’aiguille hypodermique contenant la culture en suspension cellulaire U. maydis dans la tige d’une plante expérimentale à un angle de 90° juste au-dessus de la ligne du sol. Insérez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit au milieu de la tige. Ne poussez pas l’aiguille à travers la tige(figure 2C).</li>
	<li>Injecter à la plante expérimentale environ 100 μl de la culture en suspension cellulaire U. maydis 18,19. Cela variera légèrement en fonction de la hauteur du semis. La culture en suspension cellulaire poussera à travers la tige et se déplacera dans le tourbillon de la plante. La culture en suspension cellulaire sera visible dans le tourbillon de la plante. Continuer d’injecter 100 μl de la culture de suspension cellulaire dans chaque plante individuelle jusqu’à ce que la seringue de 3 ml soit vide.</li>
	<li>Après l’injection, retirez soigneusement l’aiguille de la tige de la plante. Retirez l’aiguille de la seringue de 3 ml maintenant vide et remplissez-la d’eau. Reblocez l’aiguille à la seringue et poussez l’eau à travers l’aiguille pour enlever tout tissu végétal qui pourrait être pris dans l’extrémité de l’aiguille.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.9 à 2.15 pour chaque plante expérimentale. Suivez le même protocole pour les plantes témoins en injectant de l’eau.</li>
	<li>Replacez les plantes expérimentales et de contrôle inoculées dans la chambre de croissance. Arrosez les plantes quotidiennement en mouillant le sol et non les tissus végétaux.</li>
	<li>Vérifiez les plantes quotidiennement pour détecter le développement d’agents pathogènes et les réactions de résistance des plantes.</li>
</ol>3. Dépistage des réactions de résistance
<ol><li>Noter et enregistrer les réactions de résistance pour chaque plante 7, 10, 14 et 21 jours après l’inoculation (dpi) à l’aide d’une échelle d’évaluation de réaction de résistance de 1 à 5. La gravité de la maladie augmente à mesure que les valeurs numériques sur l’échelle d’évaluation augmentent (tableau 2). Une réaction de résistance 1C (chlorose foliaire), 1A (production d’anthocyanine foliaire) ou 2 (petites galles foliaires) indique une résistance. Une réaction de résistance 3 (galles de la tige), 4 (galles basale) ou 5 (mort des plantes) indique une susceptibilité(figures 3A-E et tableau 2)18,19.</li>
	<li>Noter à la fois les plantes expérimentales et les plantes témoins et enregistrer les cotes de réaction de résistance.</li>
	<li>Comparer les réactions de résistance des plantes expérimentales et de contrôle. Sélectionnez des plantes expérimentales avec un indice de réaction de résistance de 1C, 1A ou 2. Ces plantes sont considérées comme résistantes à U. maydis18,19.</li>
	<li>Répétez toute l’expérience pour vérifier les phénotypes végétaux.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crop+fungal+resistance+developed+using+genetic+engineering+and+antifungal+proteins+from+viruses.">Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses.</a> , (2011).</li><li>Sher, A. F., MacNab, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).</li><li>Crepet, W. L., Feldman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+earliest+remains+of+grasses+in+the+fossil+record.">The earliest remains of grasses in the fossil record.</a> Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).</li><li>Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. 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S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+tumors+caused+by+Ustilago+maydis+require+organ-specific+genes+in+host+and+pathogen.">Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen.</a> Sci.. 328, 89-92 (2010).</li><li>Kamper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+maize+plants+expressing+the+Totivirus+antifungal+protein,+KP4,+are+highly+resistant+to+corn+smut.">Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut.</a> Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).</li><li>Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+regulatory+subunit+of+a+cAMP-Dependent+protein+kinase+is+required+for+gall+formation+in+maize.">The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize.</a> , (1997).</li><li>Gold, S. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+chitin+syn-+thase+genes+in+the+phytopathogenic+fungus+Ustilago+maydis.">Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).</li><li>Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis+as+a+Pathogen.">Ustilago maydis as a Pathogen.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).</li><li>Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., K&#228;mper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystems.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems.</a> J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).</li><li>Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indole-3-acetic+acid+(IAA)+biosynthesis+in+the+smut+fungus+Ustilago+maydis+and+its+relevance+for+increased+IAA+levels+in+infected+tissue+and+host+tumor+formation.">Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation.</a> Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).</li><li>Mart&#237;nez-Espinoza, A., Garc&#237;a-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilaginales+as+Plant+Pests+and+Model+Systems.">The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems.</a> Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).</li><li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Ustilago+maydis,+a+fungal+pathogen+that+induces+tumors+in+maize.">Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize.</a> Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).</li><li>Keen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+plant+pathology:+a+retrospective+view+on+understanding+host-parasite+interactions.">A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, la méthode d’inoculation par injection à l’aiguille utilisée pour administrer une souche d’U. maydis dans la tige de 700 plants de maïs et de téosinte a été couronnée de succès. De plus, une échelle révisée d’évaluation de la résistance aux maladies a été utilisée pour dépister les plantes et détecter le développement d’agents pathogènes. Grâce à l’utilisation des deux méthodes, des lignées de plantes résistantes à U. maydis ont été identifiée...

Les maladies fongiques des plantes représentent l’une des menaces les plus éminentes pour l’agriculture. La nécessité de développer des cultures présentant une meilleure résistance aux maladies augmente en raison des besoins alimentaires d’une population mondiale croissante. Les agents pathogènes des plantes infectent naturellement les plantes cultivées dans le champ, provoquant des maladies qui ont un impact négatif sur le rendement des cultures6. Il a été démontré que l’identification et l’utilisation de plantes résistantes peuvent améliorer la résistance et diminuer la perte de rendement. Des cultivars résistants ont été identifiés chez de nombreuses espèces végétales, y compris le maïs, le blé, le riz et le sorgho, en inoculant les plantes avec un phytopathogène et en sélectionnant pour les lignées résistantes7. Par conséquent, la mise au point et l’utilisation d’une méthode d’inoculation efficace permettraient à de nombreuses plantes d’être inoculées et de faire l’objet d’un dépistage de résistance. Diverses méthodes d’inoculation ont été utilisées, y compris l’inoculation par immersion, la canalisation de la culture de suspension cellulaire pathogène dans le tourbillon de la plante et l’inoculation par injection d’aiguille8-11. Avec chaque méthode, l’agent pathogène doit être introduit de manière fiable entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria pour assurer le développement de l’agent pathogène et l’infection des plantes12,13.
La méthode d’inoculation par immersion consiste à plonger un semis de plante dans une culture en suspension cellulaire d’agent pathogène, tandis que la méthode de pipetage nécessite de placer la culture de suspension cellulaire pathogène dans le tourbillon du semis de plante. Toutefois, il existe des problèmes avec les deux méthodes. Premièrement, les deux méthodes dépendent du mouvement naturel de l’agent pathogène de la surface des feuilles dans le tissu végétal, qui est très variable. La plupart des agents pathogènes pénètrent naturellement dans la plante par des ouvertures stomatiques ou des plaies à la surface des feuilles de la plante. Cependant, il existe une variabilité importante dans la capacité des agents pathogènes à pénétrer à la surface des feuilles de la plante à travers les stomates et/ou les plaies à la surface des feuilles. Par conséquent, la pénétration des agents pathogènes ne peut pas être contrôlée par l’une ou l’autre des méthodes d’inoculation, ce qui pourrait entraîner des données incohérentes. Deuxièmement, lors du criblage d’un grand nombre de plantes, la fusion des semis dans une culture en suspension cellulaire d’agents pathogènes peut prendre beaucoup de temps et peut limiter le nombre de plantes qui peuvent être examinées. A l’inverse, le protocole d’inoculation par injection d’aiguille décrit ici délivre la culture de suspension cellulaire pathogène entre les feuilles de la plante facilitant la formation de l’appressoria14. L’agent pathogène utilise ensuite l’appressoria nouvellement développé pour entrer dans la plante en éliminant le problème de pénétration de l’agent pathogène. De plus, le protocole d’inoculation par injection d’aiguille fournit une gamme de phénotypes pour les plants de maïs et de téosinte qui ont été inoculés avec U. maydis et qui démontrent une bonne infection. Les phénotypes peuvent être utilisés comme marqueur pour déterminer la meilleure concentration pour la culture de suspension cellulaire pathogène, ce qui donne des phénotypes végétaux cohérents dans et entre différentes expériences.
Après l’inoculation des plantes avec une culture en suspension cellulaire pathogène, les plantes sont généralement examinées pour détecter un phénotype8-11,15résistant ou sensible. Bien que les échelles d’évaluation des maladies aient été largement utilisées pour dépister et classer les phénotypes des plantes, les échelles d’évaluation diffèrent selon l’agent pathogène analysé. Par conséquent, un protocole d’évaluation des maladies pour les interactions entre U. maydis et le maïs peut être utilisé pour des agents pathogènes fongiques similaires16.
La présente série de protocoles détaille l’inoculation par injection d’aiguille avec une culture de suspension cellulaire d’U. maydis et un criblage de réaction de résistance aux maladies des lignées d’introgression du maïs, de la téosinte et de la teosinte de maïs x. Les protocoles actuels ne se limitent pas à l’injection à l’aiguille d’U. maydis dans les plants de maïs, mais peuvent être utilisés pour relativement n’importe quel agent pathogène fongique et espèce végétale. Par conséquent, l’inclusion des détails des deux méthodes dans le même protocole permettra aux chercheurs d’utiliser directement les protocoles d’inoculation et de dépistage ou de manipuler les protocoles originaux pour mieux s’adapter à l’agent pathogène et aux espèces végétales d’intérêt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed for plants</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collected from original crosses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Conviron</td>
			<td>PGR14 REACH-IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planting flats</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-3385-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>10-1059-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Lab Conoco</td>
			<td>70875372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stocks were grown from original culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17356A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar (PDA) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R454311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator set to 30 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-690-650F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile toothpicks</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Walmart and sterilized by autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose broth (PDB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1008617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator-shaker set to 30 &#176;C</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>14-278-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4001000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U. maydis&#160;cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Grown from glycerol stock as described in the methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles</td>
			<td>Kendall Brands</td>
			<td>8881250321</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method for assessing pathogenicity of ustilago maydis on maize and teosinte lines

Le maïs est l’une des principales cultures céréalières dans le monde. Cependant, la sensibilité aux agents pathogènes biotrophiques est le principal obstacle à l’augmentation de la productivité. U. maydis est un champignon pathogène biotrophique et l’agent causal du charbon de maïs sur le maïs. Cette maladie est responsable d’importantes pertes de rendement d’environ 1,0 milliard de dollars par an aux États-Unis1 Plusieurs méthodes, y compris la rotation des cultures, l’application de fongicides et les traitements des semences, sont actuellement utilisées pour contrôler le charbon du maïs2. Cependant, la résistance de l’hôte est la seule méthode pratique pour gérer le charbon de maïs. L’identification des plantes cultivées, y compris le maïs, le blé et le riz, qui sont résistantes à divers agents pathogènes biotrophiques a considérablement réduit les pertes de rendement annuellesde 3à 5 . Par conséquent, l’utilisation d’une méthode d’inoculation d’agents pathogènes qui délivre efficacement et de manière reproductible l’agent pathogène entre les feuilles des plantes faciliterait l’identification rapide des lignées de maïs résistantes à U. maydis. Comme, une première étape vers l’identification des lignées de maïs qui sont résistantes à U. maydis, une méthode d’inoculation par injection d’aiguille et une méthode de criblage de réaction de résistance ont été utilisées pour inoculer des lignées d’introgression de maïs, de téosinte et de maïs x teosinte avec une souche d’U. maydis et pour sélectionner des plantes résistantes.
Des lignées d’introgression de maïs, de téosinte et de maïs x teosinte, composées d’environ 700 plantes, ont été plantées, inoculées avec une souche d’U. maydiset examinées pour la résistance. Les méthodes d’inoculation et de dépistage ont permis d’identifier trois lignées de téosinte résistantes à U. maydis. Ici, un protocole détaillé d’inoculation par injection d’aiguille et de criblage de réaction de résistance pour les lignées d’introgression du maïs, de la téosinte et du maïs x teosinte est présenté. Cette étude démontre que l’inoculation par injection d’aiguilles est un outil précieux en agriculture qui peut fournir efficacement U. maydis entre les feuilles de la plante et a fourni des lignées végétales résistantes à U. maydis qui peuvent maintenant être combinées et testées dans des programmes de sélection pour améliorer la résistance aux maladies.

Une inoculation par injection d’aiguille réussie peut être déterminée en visualisant le phénotype des plantes inoculées avec U. maydis (expérimental). La majorité des plantes expérimentales étaient sensibles à l’infection à U. maydis. Les plantes sensibles ont montré un développement de maladie très grave démontré par la formation de tiges et de galles basales avec des téliospores noires(figures 3D et 3E, tableau 2). Plusieurs plan...

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A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

L’utilisation d’une méthode d’injection d’aiguille pour inoculer le maïs et les plantes de teosinte avec l’agent pathogène biotrophic Ustilago maydis est décrite. La méthode d’inoculation par injection d’aiguille facilite l’administration contrôlée de l’agent pathogène fongique entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria. Cette méthode est très efficace, permettant des inoculations reproductibles avec U. maydis.

Une méthode rapide et efficace pour évaluer la pathogénicité d’Ustilago maydis sur les lignées de maïs et de téosinte

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

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Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

8.4K vues.  University of Georgia. L’utilisation d’une méthode d’injection d’aiguille pour inoculer le maïs et les plantes de teosinte avec l’agent pathogène biotrophic Ustilago maydis est décrite. La méthode d’inoculation par injection d’aiguille facilite l’administration contrôlée de l’agent pathogène fongique entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria. Cette méthode est très efficace, permettant...

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Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. Unfortunately, traditional benthic larval sampling methods, such as the dip-net, can be time-consuming and expensive. An alternative protocol involves collection of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Chironomidae is a species-rich family of flies (Diptera) whose immature stages typically occur in aquatic habitats. Adult chironomids emerge from the water, leaving their pupal skins, or exuviae, floating on the water&#8217;s surface. Exuviae often accumulate along banks or behind obstructions by action of the wind or water current, where they can be collected to assess chironomid diversity and richness. Chironomids can be used as important biological indicators, since some species are more tolerant to pollution than others. Therefore, the relative abundance and species composition of collected SFPE reflect changes in water quality. Here, methods associated with field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of chironomid SFPE are described in detail. Advantages of the SFPE method include minimal disturbance at a sampling area, efficient and economical sample collection and laboratory processing, ease of identification, applicability in nearly all aquatic environments, and a potentially more sensitive measure of ecosystem stress. Limitations include the inability to determine larval microhabitat use and inability to identify pupal exuviae to species if they have not been associated with adult males.

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

L&#39;utilisation de Chironomidae (Diptera) Surface-Flottant nymphose exuvies comme un protocole Rapid Bioassessment des plans d&#39;eau

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Recherche

Environnement

The Use of an Automated System (GreenFeed) to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during storage. These processes are the major sources of greenhouse gas (GHG) emissions from animal production systems. Techniques for measuring enteric CH4 vary from direct measurements (respiration chambers, which are highly accurate, but with limited applicability) to various indirect methods (sniffers, laser technology, which are practical, but with variable accuracy). The sulfur hexafluoride (SF6)&#160;tracer gas method is commonly used to measure enteric CH4 production by animal scientists and more recently, application of an Automated Head-Chamber System (AHCS) (GreenFeed, C-Lock, Inc., Rapid City, SD), which is the focus of this experiment, has been growing. AHCS is an automated system to monitor CH4 and carbon dioxide (CO2) mass fluxes from the breath of ruminant animals. In a typical AHCS operation, small quantities of baiting feed are dispensed to individual animals to lure them to AHCS multiple times daily. As the animal visits AHCS, a fan system pulls air past the animal&#8217;s muzzle into an intake manifold, and through an air collection pipe where continuous airflow rates are measured. A sub-sample of air is pumped out of the pipe into non-dispersive infra-red sensors for continuous measurement of CH4 and CO2 concentrations. Field comparisons of AHCS to respiration chambers or SF6 have demonstrated that AHCS produces repeatable and accurate CH4 emission results, provided that animal visits to AHCS are sufficient so emission estimates are representative of the diurnal rhythm of rumen gas production. Here, we demonstrate the use of AHCS to measure CO2 and CH4 fluxes from dairy cows given a control diet or a diet supplemented with technical-grade cashew nut shell liquid.

The Use of an Automated System GreenFeed to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Accuracy and precision of the techniques used to measure methane emissions from ruminant animals are critically important for the success of greenhouse gas mitigation efforts. This manuscript describes the principles and operation of an automated system to monitor methane and carbon dioxide mass fluxes from the breath of ruminant animals.

L&#39;utilisation d&#39;un système (fourrage vert) automatisé pour surveiller entérique méthane et de dioxyde de carbone Les émissions provenant de ruminants Animaux

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Administrer et détecter des marques de protéines sur les arthropodes pour la dispersion de la recherche

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester fabric and glue can be folded and glued to construct a strip of compartments that house seeds and identifying information, while allowing contact with soil leachate, water, microorganisms, and ambient temperature. Strips may be constructed with a wide range of compartment numbers and sizes and allow the researcher to house a variety of genotypes within a single species, different species, or seeds that have experienced different treatments. As opposed to individual seed packets, strips are more easily retrieved as a unit. While replicate packets can be included within a strip, different strips can act as blocks or can be retrieved at different times for observation of seed behavior over time. We used a high temperature glue gun to delineate compartments and sealed the strips once the seed and tags identifying block and removal times were inserted. The seed strips were then buried in the field at the desired depth, with the location marked for later removal. Burrowing animal predators were effectively excluded by use of a covering of metal mesh hardware cloth on the soil surface. After the selected time interval for burial, strips were dug up and seeds were assessed for germination, dormancy and mortality. While clearly dead seeds can often be distinguished from ungerminated living ones by eye, dormant seeds were conclusively identified using a standard Tetrazolium chloride colorimetric test for seed viability.

Here we present a protocol for assessing seed survivorship, germination and dormancy under field conditions using buried, labeled seed strips and tetrazolium chloride (TZ) viability testing.

Reliable Méthode d&#39;évaluation de la germination des graines, dormance, et la mortalité sous conditions de terrain

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which promotes growth of large weaponry and body size. Populations of the same species display each phenotype depending on environmental conditions. Although antler and body size of male white-tailed deer (Odocoileus virginianus) varies by physiographic region in Mississippi, USA and is strongly correlated with regional variation in nutritional quality, the effects of population-level genetics from native stocks and previous re-stocking efforts cannot be disregarded. This protocol describes how we designed a controlled study, where other factors that influence phenotype, such as age and nutrition, are controlled. We brought wild-caught pregnant females and six-month-old fawns from three distinct physiographic regions in Mississippi, USA to the Mississippi State University Rusty Dawkins Memorial Deer Unit. Deer from the same region were bred to produce a second generation of offspring, allowing us to assess generational responses and maternal effects. All deer ate the same high-quality (20% crude protein deer pellet) diet ad libitum. We uniquely marked each neonate and recorded body mass, hind foot, and total body length. Each subsequent fall, we sedated individuals via remote injection and sampled the same morphometrics plus antlers of adults. We found that all morphometrics increased in size from first to second generation, with full compensation of antler size (regional variation no longer present) and partial compensation of body mass (some evidence of regional variation) evident in the second generation. Second generation males that originated from our poorest quality soil region displayed about a 40% increase in antler size and about a 25% increase in body mass when compared to their wild harvested counterparts. Our results suggest phenotypic variation of wild male white-tailed deer in Mississippi are more related to differences in nutritional quality than population-level genetics.

Phenotypic differences among cervid populations may be related to population-level genetics or nutrition; discerning which is difficult in the wild. This protocol describes how we designed a controlled study where nutritional variation was eliminated. We found that phenotypic variation of male white-tailed deer was more limited by nutrition than genetics.

Protocole pour évaluer les effets relatifs de l’environnement et de la génétique sur le cartilage de wapiti pur et la croissance du corps pour une longue durée de vie de cervidés

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic pathway of dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation, have been recently found in the environment as well as human organs. DMMTAV and DMDTAV can be quantified to determine the ecological effects of dimethylated thioarsenicals and their stability in environmental media. The synthesis method for these compounds is unstandardized, making replicating previous studies challenging. Furthermore, there is a lack of information about storage techniques, including storage of compounds without species transformation. Moreover, because only limited information about synthesis methods is available, there may be experimental difficulties in synthesizing standard chemicals and performing quantitative analysis. The protocol presented herein provides a practically modified synthesis method for the dimethylated thioarsenicals, DMMTAV and DMDTAV, and will help in the quantification of species separation analysis using high performance liquid chromatography in conjunction with inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). The experimental steps of this procedure were modified by focusing on the preparation of chemical reagents, filtration methods, and storage.

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

This article presents modified experimental protocols for dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV) synthesis, inducing dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation through mixing of DMAV, Na2S, and H2SO4. The modified protocol provides an experimental guideline, thereby overcoming limitations of the synthesis steps that could have caused experimental failures in quantitative analysis.

Préparation des DJIBY92V DMDTAV à l’aide de DMAV pour Applications environnementales : synthèse, la Purification et Confirmation

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

The Hawaii Protocol for Scientific Monitoring of Coffee Berry Borer: a Model for Coffee Agroecosystems Worldwide

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at capturing and quantifying the dynamics and impact of this invasive insect pest as well as the development of its host plant across a heterogeneous landscape. The cornerstone of this comprehensive monitoring system is timely georeferenced data collection on CBB movement, coffee berry infestation, mortality by the fungus Beauveria bassiana, and coffee plant phenology via a mobile electronic data recording application. This electronic data collection system allows field records to be georeferenced through built-in global positioning systems, and is backed by a network of weather stations and records of farm management practices. Comprehensive monitoring of CBB and host plant dynamics is an essential part of an area-wide project in Hawaii to aggregate landscape-level data for research to improve management practices. Coffee agroecosystems in other parts of the world that experience highly variable environmental and socioeconomic factors will also benefit from implementing this protocol, in that it will drive the development of customized integrated pest management (IPM) to manage CBB populations.

Comprehensive monitoring of coffee berry borer and host plant dynamics is essential for aggregating landscape-level data to improve management of this invasive pest. Here, we present a protocol for scientific monitoring of coffee berry borer movement, infestation, mortality, coffee plant phenology, weather, and farm management via a mobile electronic data recording application.

Le protocole de Hawaï pour un suivi scientifique de café térébrant : un modèle pour les agroécosystèmes cafés dans le monde entier

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Un Flexible Low Cost système hydroponique, évaluer les réactions des plantes à petites molécules dans des Conditions stériles

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

Haut-débit, Microscale protocole pour l’analyse des paramètres de traitement et les qualités nutritionnelles du maïs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Évaluer les capacités d’enlèvement de matière particulaire d’arbre feuilles

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...