Les auteurs remercient l’USDA-NIFA pour son soutien financier (numéros de subvention 2018-67013-28489 et 2020-70410-32901). Les opinions, constatations, conclusions ou recommandations exprimées dans ce manuscrit sont uniquement celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue du ministère de l’Agriculture des États-Unis. Nous remercions Mayara de Silva, étudiante invitée de Science Sans Frontières au Brésil, pour les images qui apparaissent dans les figures 6A et 7D. Nous remercions également le département de pathologie végétale de l’Université du Kentucky pour avoir fourni l’accès aux microscopes confocaux Olympus.

REMARQUE : Le flux de travail de la méthode est illustré à la figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig01.jpg"> Figure 1 : Étapes du protocole d’inoculation optimisé à l’aide de gaines de feuilles de maïs détachées. La préparation de la suspension de spores, l’inoculation de la gaine foliaire et la préparation d’échantillons pour la microscopie de cellules vivantes sont surlignées dans des cases vertes (A), violettes (B) et oranges (C), respectivement. Créé avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
1. Matériel végétal et fongique
<ol><li>Croissance des plantes<ol><li>Cultivez les plants de maïs (voir tableau des matériaux) en serre (14 h lumière/27 °C et 10 h obscurité/22 °C) dans des conteneurs SC10 (voir tableau des matériaux). Utilisez un milieu de culture composé de trois parties de terreau commercial (voir le tableau des matériaux) et de deux parties de terre végétale stérilisée à la vapeur.</li>
		<li>Arrosez les semis pendant 2 min avec un système d’irrigation par aspersion une fois par jour, le matin.</li>
		<li>Récoltez les semis au stade V2 en les coupant au niveau du sol. Le stade de croissance V2 est atteint lorsque les plantules mesurent de 5 à 10 cm de haut et ont deux feuilles à collette visibles21.</li>
		<li>Enveloppez les plantes avec une serviette en papier humide et placez-les dans un sac en plastique pour les transporter au laboratoire pour un traitement ultérieur.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultures fongiques<ol><li>Réactiver les cultures mères de silice fongique entreposées dans des conditions aseptiques22en saupoudrant environ 50 granules de silice infestée sur un milieu gélosé approprié. Pour éviter les changements morphologiques et la perte de pathogénicité, les souches de sous-culture ne dépassent pas 3 fois après la réactivation. La gélose au dextrose de pomme de terre (PDA ; voir le tableau des matériaux) est couramment utilisée pour la culture de C. graminicola, tandis que la gélose à l’avoine (OA ; voir le tableau des matériaux) est utilisée pour S. maydis.</li>
		<li>Pour préparer la PDA à la culture de souches fongiques, suspendre 19,5 g de PDA déshydraté préparé commercialement dans 500 mL d’eau déminéralisée (DI). Pour faire de l’arthrose, faites bouillir 36 g d’arthrose déshydratée préparée dans du commerce dans de l’eau déminéralisée pendant 15 à 30 minutes, filtrez à travers trois couches d’étamine et portez le filtrat à 500 ml avec de l’eau déminéralisée. Milieu autoclave à stériliser.</li>
		<li>Complétez le milieu fondu et refroidi avec un antibiotique approprié (p. ex., hygromycine B, génétique) lorsque vous travaillez avec des souches transformantes. Les concentrations finales d’hygromycine ou de génétique dans 500 mL de milieu sont respectivement de 250 μg/mL et de 100 μg/mL.</li>
		<li>Incuber les cultures dans des conditions optimales jusqu’à ce qu’un mycélium sporulant se soit développé. Colletotrichum graminicola et S. maydis poussent bien à 23 °C avec une lumière fluorescente continue et des niveaux d’humidité ambiante. La sporulation a lieu 7 jours après l’inoculation (dai) pour S. maydis ou 14 jours après l’inoculation pour C. graminicola.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inoculations de la gaine foliaire
<ol><li>Assemblage de l’unité de filtration en laine de verre<ol><li>À l’aide de ciseaux ou de cisailles robustes, coupez le capuchon à environ 0,5 mm du fond conique d’un tube de microcentrifugation de 1,5 ml (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Placez un morceau de laine de verre (environ 0,5 cm x 0,5 cm ; voir le tableau des matériaux) à l’intérieur du tube coupé pour couvrir le trou central, comme illustré à la figure 2.</li>
		<li>Portez des gants lorsque vous coupez de la laine de verre, car le verre borosilicaté peut provoquer des irritations.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des supports de gaine de vantail<ol><li>Découpez une plaque PCR à 96 puits sans jupe (voir le tableau des matériaux) en six racks de support à deux colonnes (8 x 2 puits), comme illustré à la figure 3A.</li>
		<li>Retournez les grilles à deux colonnes de manière à ce que les fonds coniques des puits soient orientés vers le haut et les sommets plats vers le bas (Figure 3B).</li>
		<li>Placez chaque support dans une plaque de Pétri en verre contenant du papier filtre humidifié et couvrez-la avec le couvercle (voir le tableau des matériaux). Cette unité fonctionne comme une petite chambre d’humidité pour les gaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de l’inoculum<ol><li>Pour chaque souche fongique, placer une unité de filtration en laine de verre assemblée dans un tube de microcentrifugation stérile intact de 1,5 mL, comme illustré à la figure 2. Ce dernier fonctionne comme un tube de collecte.</li>
		<li>Étiquetez les tubes.</li>
		<li>Récoltez les conidies des cultures sporulées en inondant d’abord chaque plaque de 3 à 4 ml d’eau DI stérile. Dans certains cas, il peut être nécessaire d’avoir plus d’eau pour produire une couche de liquide à la surface de la colonie. Les agents mouillants ne sont pas nécessaires dans ce système.</li>
		<li>Détachez les spores de la gélose à l’aide d’un pilon stérile à pointe conique (voir le tableau des matériaux) pour racler uniformément toute la plaque.</li>
		<li>Appliquer 1 mL de suspension de spores sur une unité de filtration en laine de verre de manière aseptique et laisser les spores s’écouler dans le tube collecteur par gravité.</li>
		<li>Centrifuger les tubes de prélèvement contenant les suspensions de spores filtrées à 3 500 x g pendant 5 min. Les spores doivent être granulées au fond du tube de la microcentrifugeuse. REMARQUE : Centrifuger les spores de C. graminicola à des vitesses plus élevées que celles recommandées ici entraîne une perte importante de viabilité.</li>
		<li>Versez le liquide dans un récipient autoclavable, ajoutez 1 mL d’eau dépérissable stérile et agitez doucement pour remettre en suspension les spores granulées. Centrifugeuse comme à l’étape 2.3.6.</li>
		<li>Lavez les spores 3 fois pour éliminer toute matrice conidiale qui pourrait contenir des auto-inhibiteurs susceptibles de réduire la germination ou la pénétration.</li>
		<li>Après le troisième lavage, ajouter 300 à 500 μL d’eau stérile d’injection intraveineuse pour remettre les spores en suspension à des fins de quantification.</li>
		<li>Utilisez un hémocytomètre sous un microscope composé à un grossissement de 100x pour déterminer la concentration de spores. Il n’est pas nécessaire de colorer les spores avant de les compter.</li>
		<li>Préparer une suspension de 5 x 105 spores/mL avec de l’eau stérile. REMARQUE : La suspension de spores de C. graminicola ne peut être conservée à température ambiante pendant 4 h maximum avant une perte rapide de viabilité. La réfrigération des conidies n’augmente pas la viabilité.</li>
	</ol></li>
	<li>Inoculations de gaine<ol><li>Vérifiez les pratiques et les procédures de biosécurité pertinentes avant d’inoculer des souches fongiques aux plantes.</li>
		<li>Retirez la gaine de la première vraie feuille des semis V2 en passant un ongle de pouce le long de la marge qui se chevauche de la gaine et détachez-la doucement de la pousse. Desserrez la gaine des deux côtés de la pousse avant d’essayer de la retirer.</li>
		<li>Coupez les gaines foliaires récupérées en segments de 3 à 5 cm. Il n’est pas nécessaire de désinfecter les gaines en surface avant l’inoculation.</li>
		<li>Déroulez chaque segment très doucement pour exposer la couche épidermique interne (adaxiale).</li>
		<li>Lors de la préparation des gaines pour l’inoculation, gardez les gaines excisées restantes enveloppées d’un essuie-tout humide pour éviter la dessiccation.</li>
		<li>Placez 20 μL de la suspension de spores fongiques sur la surface interne au centre de la gaine, directement au-dessus de la nervure médiane, comme illustré à la figure 4.</li>
		<li>Placez les gaines foliaires inoculées horizontalement, avec la nervure médiane placée en bas, dans le support à l’intérieur d’une boîte de Pétri en verre contenant un papier filtre humidifié, comme illustré à la figure 5.</li>
		<li>Chaque rack peut contenir jusqu’à sept gaines. Inoculer au moins cinq gaines par souche pour compenser la perte de répétitions qui peut se produire lors de la préparation ou de l’incubation de l’échantillon.</li>
		<li>Placez les petites chambres d’humidité dans une boîte de rangement transparente recouverte de papier de germination humidifié (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Couvrez la boîte avec le couvercle. Incuber la boîte à 23 °C avec un éclairage continu pour l’évolution temporelle prévue, qui dépend du champignon et des stades de développement fongique qui seront observés. Le tableau 1 résume l’évolution temporelle des gaines de maïs inoculées avec C. graminicola.</li>
		<li>Vérifiez tous les jours s’il y a des signes ou des symptômes de maladie sur les gaines et gardez les papiers de germination et les papiers filtres humides. Les gaines foliaires peuvent être conservées jusqu’à 6 jours sans mort ou dégradation évidente des cellules végétales en l’absence d’inoculation.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig02.jpg"> Figure 2 : Préparation de l’unité de filtration en laine de verre. (A) Une boule de laine de verre de 0,5 cm x 0,5 cm est placée à l’intérieur du tube de microcentrifugation 1 dont le fond conique a été retiré. (B-C) Le tube filtrant est ensuite placé dans le tube de microcentrifugation 2 pour générer une unité de filtration assemblée pour la préparation de la suspension des spores. Créé avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig03.jpg"> Figure 3 : Méthode de découpe d’une plaque PCR à 96 puits sans jupe. (A) Plaque PCR découpée en six racks de support, 8 x 2 puits. Un exemple d’un support de gaine unique est illustré en (B). Les gaines foliaires sont posées horizontalement sur le support. Créé avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig04.jpg"> Figure 4 : Méthode d’inoculation de la gaine. Une seule goutte d’inoculum appliquée directement sur la surface adaxiale de la section de gaine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig05.jpg"> Figure 5 : Méthode d’incubation de la gaine. Gaines foliaires inoculées placées horizontalement dans un support à l’intérieur d’une boîte de Pétri en verre contenant du papier filtre humidifié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Microscopie de cellules vivantes
<ol><li>Préparation d’échantillons pour la microscopie<ol><li>Rincez délicatement les pièces de la gaine avec de l’eau détritue stérile pour éliminer les spores non détectées ou les excroissances fongiques superficielles.</li>
		<li>Placez la gaine sur une lame de microscope en verre propre (voir le tableau des matériaux) avec la surface adaxiale (intérieure) de la gaine vers le bas et la surface abaxiale (extérieure) vers le haut.</li>
		<li>Utilisez une nouvelle lame de rasoir à un seul tranchant (voir le tableau des matériaux) pour couper environ 1 cm des extrémités de la gaine et enlever la majeure partie du tissu du limbe de chaque côté de la nervure médiane.</li>
		<li>Tenez la lame de rasoir à un angle de 90° par rapport à la gaine pour raser le tissu de la nervure médiane abaxiale et exposer la couche épidermique sur la surface adaxiale au-dessus de la tache inoculée. Essayez de maintenir une épaisseur uniforme. Une fois que les gaines foliaires sont rasées, il n’est pas recommandé de les tailler davantage car cela pourrait endommager l’échantillon.</li>
		<li>Assurez-vous que les sections rasées ne mesurent pas plus de 1 cm x 1 cm. Évitez d’appuyer sur le centre de la gaine pendant ce processus. Lorsque vous travaillez avec des gaines inoculées avec différentes suspensions de spores, désinfectez les gants et changez la lame de rasoir entre les échantillons.</li>
		<li>Gardez une lame de microscope en verre propre à portée de main. Soulevez la section de la gaine d’un bord et transférez-la soigneusement sur une nouvelle lame. La surface inoculée (adaxiale) de la gaine doit être la plus haute, la plus proche de la lentille de l’objectif. Montez les sections en douceur pour éviter d’endommager les structures fongiques.</li>
		<li>Appliquer 60 μL d’eau stérile sur la section et ajouter une lamelle en verre de 24 mm x 60 mm (voir le tableau des matériaux). Faites-le lentement pour éviter les bulles d’air.</li>
		<li>Lorsque vous êtes prêt pour la microscopie, scellez la lamelle avec du vernis à ongles transparent (voir le tableau des matériaux) en plaçant une petite goutte sur chaque bord, puis en reliant les gouttes ensemble avec un pinceau à vernis à ongles pour obtenir un joint homogène. REMARQUE : Ce protocole de gaine peut être utilisé avec des colorants cytologiques, par exemple, le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), le rouge neutre ou le bleu trypan, ou pour l’observation de la plasmolyse cellulaire afin d’évaluer la viabilité des cellules végétales. Pour les essais de coloration de gaine ou de plasmolyse cellulaire, ne pas sceller la lamelle.</li>
		<li>Pour les essais de plasmolyse, ajoutez une solution hypertonique (saccharose 0,75 M ou chlorure de sodium 1 M) sur un bord de la lamelle et utilisez un papier de soie non pelucheux plié pour aspirer la solution à travers l’échantillon jusqu’à l’autre bord de la lamelle. Pour la coloration, utilisez une méthode similaire pour appliquer la solution de teinture.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopie à champ large<ol><li>Une fois que les gaines foliaires sont montées sur des lames de microscope, inspectez-les pour détecter toute colonisation fongique à l’aide d’un microscope optique à grand champ à grossissement de 400x.</li>
		<li>Pour observer en détail les structures fongiques, utilisez un objectif à immersion dans l’eau plutôt que de l’huile pour une meilleure qualité d’image des échantillons. L’aberration sphérique due à un décalage de l’indice de réfraction peut entraîner une dégradation de l’image. Des objectifs à eau sont disponibles pour les microscopes optiques à grand champ ainsi que pour les microscopes confocaux.</li>
		<li>Pour déterminer la quantité relative de colonisation par gaine, comptez le nombre de cellules de maïs envahies à partir de chaque site de pénétration fongique à l’aide d’un microscope optique à grand champ à un grossissement de 100x. Cette quantification est une étape de dépistage appropriée avant toute analyse statistique comparant les souches, les traitements et/ou les stades de développement.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopie confocale à balayage laser<ol><li>Pour observer les protéines fluorescentes dans les tissus de maïs au cours du développement de souches fongiques transgéniques, ajustez les paramètres de base de l’acquisition d’images. Identifiez les meilleurs paramètres d’excitation/d’émission en fonction du marqueur fluorescent sélectionné. REMARQUE : Un objectif d’eau 60x est préférable lors de l’analyse de fusions fluorescentes construites avec des protéines sécrétées. Les microscopes confocaux modernes ont des objectifs d’immersion dans l’eau hautement corrigés pour éviter les artefacts et les aberrations de forme.</li>
		<li>Si l’imagerie de cellules vivantes de protéines fluorescentes est prévue, utiliser des souches fongiques non transformées comme témoins de l’autofluorescence. Utilisez les paramètres d’acquisition d’images suivants pour capturer la dynamique champignon-hôte sur un microscope confocal inversé et pour la protéine fluorescente mCherry. Réglez la puissance du laser jusqu’à 5 %, 450-600 haute tension (HV) selon le niveau d’expression, un gain de 1,375 X, un décalage de 3 %, un facteur de zoom optique de 1 pour l’analyse de jusqu’à cinq cellules de maïs par section et un facteur de zoom optique de 2 à 5 pour les hyphes individuels. REMARQUE : Les images confococaux haute résolution de la pile Z fournissent des données tridimensionnelles et une meilleure vue des interactions en temps réel entre l’hôte et l’agent pathogène.</li>
		<li>Pour quantifier les intensités de fluorescence correspondant aux protéines de fusion sécrétées, utilisez un logiciel d’analyse d’images du fabricant de confocaux ou un programme de traitement d’images tel que ImageJ, qui peut être téléchargé gratuitement en ligne. Consultez un manuel pour plus de détails sur la façon de quantifier les signaux fluorescents en conséquence.</li>
	</ol></li>
</ol>

Visualisation des interactions cellulaires entre les gaines de maïs et les champignons

<ol>
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Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).</li><li>Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+influence+of+inoculation+methods+on+in+planta+growth+of+rice+blast+fungus.">Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus.</a> Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).</li><li>Belis&#225;rio, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+anthracnose+stalk+rot+in+the+genomic+era.">Maize anthracnose stalk rot in the genomic era.</a> Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).</li><li>Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+Colletotrichum+graminicola+on+sweet+corn+in+Indiana.">Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana.</a> Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).</li><li>Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+a+corn+plant+develops.">How a corn plant develops.</a> Special Report, Iowa State University. 48, (1986).</li><li>Tuite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).</li><li>Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. 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M., Roichman, Y., Fridman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+tracking+of+the+endoplasmic+reticulum+in+live+pathogenic+fungal+cells.">Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).</li><li>Lorang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+is+lighting+up+fungal+biology.">fluorescent protein is lighting up fungal biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li><li>Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+yeast+organelles+with+fluorescent+protein+markers.">Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).</li><li>Westermann, B., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-targeted+green+fluorescent+proteins:+convenient+tools+for+the+study+of+organelle+biogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).</li><li>Lee, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER+chaperone+and+signaling+regulator+GRP78/BiP+as+a+monitor+of+endoplasmic+reticulum+stress.">The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress.</a> Methods. 35 (4), 373-381 (2005).</li><li>Krishnakumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+maize+database+resource+that+captures+tissue-specific+and+subcellular-localized+gene+expression,+via+fluorescent+tags+and+confocal+imaging+(Maize+Cell+Genomics+Database).">A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database).</a> Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).</li><li>Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+marker+lines+in+maize:+generation+and+applications.">Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications.</a> International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).</li><li>O'Connell, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifestyle+transitions+in+plant+pathogenic+Colletotrichum+fungi+deciphered+by+genome+and+transcriptome+analyses.">Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses.</a> Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).</li><li>Torres, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Colletotrichum+graminicola+mutant+deficient+in+the+establishment+of+biotrophy+reveals+early+transcriptional+events+in+the+maize+anthracnose+disease+interaction.">A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction.</a> BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).</li><li>Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ToxA+and+ToxB+promoter-driven+fluorescent+protein+expression+vectors+for+use+in+filamentous+ascomycetes.">Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes.</a> Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).</li><li>Gordon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucoamylase::+green+fluorescent+protein+fusions+to+monitor+protein+secretion+in+Aspergillus+niger.">Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger.</a> Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).</li><li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants.">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li><li>Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggressiveness+of+Colletotrichum+sublineola+strains+from+Sorghum+bicolor+and+S.+halepense+to+sweet+sorghum+variety+Sugar+Drip,+and+their+impact+on+yield.">Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield.</a> Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents et qu’ils n’ont rien à divulguer.

La méthode optimisée d’inoculation de la gaine foliaire décrite ici est modifiée à partir d’un protocole original qui a été développé et appliqué aux gaines foliaires du riz 6,8,36. Il permet des observations directes et détaillées de la croissance et du développement fongiques dans les cellules végétales vivantes par microscopie à grand champ ou confocale. Le protocole est adapté à la caractérisation, à ...

Les analyses spatiales et temporelles au niveau cellulaire sont essentielles pour comprendre la physiologie et la cytologie des interactions fongiques-plantes. Les tissus foliaires qui ont été fixés chimiquement 1,2,3 ou nettoyés et colorés4, ainsi que les membranes artificielles5, ont été utilisés dans le passé pour étudier la cytologie du développement des agents pathogènes foliaires et les interactions plantes-champignons. Cependant, l’étude des événements infectieux dans les tissus de l’hôte vivant en temps réel sans fixation ni nettoyage est difficile en raison de problèmes techniques liés à la préparation d’échantillons optiquement transparents pour l’imagerie.
À la fin des années 1940, un protocole d’inoculation de gaine foliaire détachée a été mis au point pour l’étude microscopique en fond clair de la résistance des cellules épidermiques vivantes du riz au champignon Magnaporthe oryza6. Plus récemment, des observations moléculaires, physiologiques et cytologiques détaillées de la colonisation de l’hôte par les espèces Colletotrichum et Magnaporthe ont été grandement facilitées par la combinaison de versions modifiées de cette méthode de gaine foliaire avec des transformants fongiques exprimant des protéines fluorescentes, et des protocoles d’imagerie de cellules vivantes à haute performance, y compris l’épifluorescence et la microscopie confocale 7,8,9,10,11,12,13.
Cet article détaille un protocole d’inoculation optimisé utilisant des gaines de feuilles de maïs détachées pour l’observation des processus d’infection par des agents pathogènes fongiques foliaires hémibiotrophes et nécrotrophes. Nous l’avons spécifiquement utilisé pour étudier Colletotrichum graminicola (C. graminicola), l’agent causal de la brûlure des feuilles anthracnose et de la pourriture de la tige, et Stenocarpella maydis, qui cause la brûlure des feuilles et la pourriture de la tige de Diplodia. Cependant, la méthode devrait être applicable à d’autres pathogènes fongiques foliaires hémibiotrophes et nécrotrophes. Les réponses cytologiques et physiologiques lors d’événements d’infection et de colonisation dans ces gaines foliaires excisées sont similaires à celles des limbes entiers12,14,15. De plus, la colonisation hémibiotrophe des cellules épidermiques de la gaine par C. graminicola est similaire à la colonisation des cellules de la moelle pédonculaire16,17. Les gaines détachées présentent une plus grande synchronicité et une plus grande reproductibilité expérimentale de la pénétration et de la colonisation fongiques que les limbes des feuilles ou les tissus de la moelle des tiges14,16,17,18. La plupart des variétés de maïs peuvent être utilisées pour ce protocole. Cependant, les consanguins ou les hybrides avec des pigments violets excessifs dans les gaines sont moins appropriés car les pigments interfèrent avec l’imagerie. Le maïs sucré du jubilé d’or a été particulièrement utile pour nos études, car les semences non traitées sont disponibles dans le commerce, les plantes sont très sensibles à de nombreuses maladies foliaires et elles poussent bien en serre. Les premières épidémies de pourriture de la tige par l’anthracnose aux États-Unis ont entraîné la perte totale des récoltes de maïs sucré dans l’Indiana dans les années1970 19,20. Cette méthode d’inoculation de la gaine foliaire peut être appliquée pour observer et quantifier directement la croissance et le développement fongiques dans les cellules végétales vivantes par rapport aux cellules végétales tuées localement, pour démontrer les réactions de résistance dans les réponses compatibles/incompatibles à l’infection fongique et pour tester les interactions entre les souches fongiques sur la même gaine en temps réel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axiocam monochrome microscope camera</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>426560-9010-000</td>
			<td>Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 epifluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Allows live viewing and image/video capture&#160;of biological samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002431</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon bacteriological Petri dish with lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-105</td>
			<td>Polystyrene material; hydrophobic surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-920-115</td>
			<td>Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV 3000 laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For visualization of fungal transformants&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germination paper</td>
			<td>Anchor Paper Co.</td>
			<td>SD7615L</td>
			<td>76# heavy weight for plastic box moist chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>75845-542</td>
			<td>Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; 
			complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool&#160;</td>
			<td>Ohio Valley Specialty Chemical&#160;</td>
			<td>3350</td>
			<td>For glass-wool filter units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>15170-172</td>
			<td>0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-457&#160;</td>
			<td>Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize cultivar Golden Jubilee seeds</td>
			<td>West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada</td>
			<td>CN361</td>
			<td>Matures&#160;in 95-105 days; seed type: F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>USA Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td>1.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-123&#160;</td>
			<td>Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal Agar (OA)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>255210</td>
			<td>Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>43671</td>
			<td>Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-skirted 96-well PCR plate</td>
			<td>USA Sientific</td>
			<td>1402-9500</td>
			<td>100 uL plate volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle for microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific&#160;</td>
			<td>1415-5390</td>
			<td>Conical tip; polypropylene material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB933</td>
			<td>Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>90000-758</td>
			<td>Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Mix BX</td>
			<td>Premium Horticulture Supply Co.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Premium general-purpose growing medium formulated to provide 
			a&#160;balance of water retention and proper drainage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC10 cone-tainers&#160;</td>
			<td>Greenhouse Megastore&#160;</td>
			<td>CN-SS-SC-10B</td>
			<td>1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC10 cone-tainers tray</td>
			<td>Greenhouse Megastore&#160;</td>
			<td>CN-SS-SCTR98</td>
			<td>24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-989-145</td>
			<td>AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage containers/boxes with latch closure</td>
			<td>Target</td>
			<td>002-02-0405</td>
			<td>Clear view storage boxes for rmoist chamber; 
			outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detached maize sheaths for live-cell imaging of infection by fungal foliar maize pathogens

Nous avons optimisé un protocole d’inoculation des gaines foliaires du maïs avec des champignons pathogènes foliaires hémibiotrophes et nécrotrophes. La méthode est modifiée par rapport à celle appliquée à l’origine aux gaines des feuilles de riz et permet une observation microscopique directe de la croissance et du développement fongiques dans les cellules végétales vivantes. Les gaines foliaires prélevées sur des semis de maïs dont le collet est entièrement levé sont inoculées avec 20 μL de suspensions de spores fongiques de 5 x 105 spores/mL et incubées dans des chambres humides à 23 °C sous une lumière fluorescente continue. Après 24 à 72 h, l’excès de tissu est retiré avec une lame de rasoir pour laisser une seule couche de cellules épidermiques, un échantillon optiquement clair qui peut être imagé directement sans qu’il soit nécessaire de fixer ou de nettoyer chimiquement. Les cellules végétales et fongiques restent vivantes pendant toute la durée de l’expérience et les interactions peuvent être visualisées en temps réel. Les gaines peuvent être colorées ou soumises à une plasmolyse pour étudier la cytologie du développement et la viabilité des cellules hôtes et pathogènes au cours de l’infection et de la colonisation. Les souches fongiques transformées pour exprimer des protéines fluorescentes peuvent être inoculées ou co-inoculées sur les gaines pour une résolution accrue et pour faciliter l’évaluation des interactions compétitives ou synergiques. Les souches fongiques exprimant des protéines de fusion fluorescentes peuvent être utilisées pour suivre et quantifier la production et le ciblage de ces protéines individuelles in planta. Les tissus de gaine inoculés peuvent être extraits pour caractériser les acides nucléiques, les protéines ou les métabolites. L’utilisation de ces essais de gaine a considérablement fait progresser les études détaillées des mécanismes de pathogénicité fongique chez le maïs, ainsi que des effecteurs protéiques fongiques et des métabolites secondaires contribuant à la pathogénicité.

Spatial and temporal analyses at the cellular level are critical for understanding the physiology and cytology of fungal-plant interactions. Foliar tissues that have been chemically fixed1,2,3or cleared and stained4, as well as artificial membranes5, have been used in the past to investigate the cytology of foliar pathogen development and plant-fungal interactions. However, investigation of infection events in living host tissues in real-time without fixation or clearing is challenging due to technical issues related to the preparation of optically transparent samples for imaging.
A detached leaf sheath inoculation protocol was developed in the late 1940s for bright field microscopic investigation of resistance of living rice epidermal cells to the rice blast fungus Magnaporthe oryza6. More recently, detailed molecular, physiological, and cytological observations of host colonization by Colletotrichum and Magnaporthe species have been greatly facilitated by combining modified versions of this leaf sheath method with fungal transformants expressing fluorescent proteins, and high-performance live-cell imaging protocols, including epifluorescence and confocal microscopy7,8,9,10,11,12,13.
This paper details an optimized inoculation protocol using detached maize leaf sheaths for observation of infection processes by hemibiotrophic and necrotrophic foliar fungal pathogens. We have specifically used it to study Colletotrichum graminicola (C. graminicola), the causal agent of anthracnose leaf blight and stalk rot, and Stenocarpella maydis, which causes Diplodia leaf blight and stalk rot. However, the method should be applicable to other hemibiotrophic and necrotrophic foliar fungal pathogens. Cytological and physiological responses during infection and colonization events in these excised leaf sheaths are similar to those in entire leaf blades12,14,15. Furthermore, hemibiotrophic colonization of sheath epidermal cells by C. graminicola is similar to colonization of stalk pith cells16,17. Detached sheaths show greater synchronicity and experimental reproducibility of fungal penetration and colonization than leaf blades or stalk pith tissues14,16,17,18. Most maize varieties can be used for this protocol. However, inbreds or hybrids with excessive purple pigments in the sheaths are less suitable since the pigments interfere with imaging. Golden Jubilee sweet corn has been particularly useful for our studies because untreated seeds are commercially available, the plants are highly susceptible to many foliar diseases, and they grow well in the greenhouse. The first epidemics of anthracnose stalk rot in the United States resulted in the total loss of sweet corn crops in Indiana in the 1970s19,20. This leaf sheath inoculation method can be applied to directly observe and quantify fungal growth and development in living vs. locally killed plant cells, to demonstrate resistance reactions in compatible/incompatible responses to fungal infection, and to test interactions between fungal strains on the same sheath in real-time.

Pleins feux sur l’auteur : Étude des mécanismes de pathogénicité fongique chez le maïs 

Gaines de maïs détachées pour l’imagerie de cellules vivantes d’une infection par des agents pathogènes fongiques foliaires du maïs

So our team aims to understand fungal pathogenicity mechanisms in plants to improve disease management. We are currently exploring how the maize autochthonous fungus regulates protein secretion beyond its housekeeping function. Our protocol shows high synchronicity across replications and reproducibility of fungal colonization.Also, with our assays, there is no need for clearing or fixating samples before imaging them in real-time. The method offers a variety of applications in plant-pathogen interactions and contributed to detailed studies on the mechanisms of fungal pathogenicity in maize and comparative genomic analysis.

Les exemples ci-dessous décrivent des résultats représentatifs de l’utilisation de la méthode d’inoculation de la gaine des feuilles de maïs. Ces exemples démontrent la facilité, la rapidité et la précision avec lesquelles l’observation et la comparaison des interactions maïs-champignon peuvent être réalisées en temps réel avec ce test optimisé. L’imagerie de cellules vivantes permet également d’extraire des informations quantitatives, ce qui constitue un outil utile pour les études moléculair...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize at JoVE.com

Ce manuscrit détaille un protocole d’inoculation optimisé qui utilise des gaines de feuilles de maïs détachées pour des études cytologiques, physiologiques et moléculaires reproductibles des interactions du maïs avec les agents pathogènes fongiques des plantes. Les gaines foliaires facilitent l’observation en temps réel des interactions cellulaires entre la plante vivante et le champignon dans les tissus non fixés.

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...

Notre équipe vise donc à comprendre les mécanismes de pathogénicité fongique chez les plantes afin d’améliorer la gestion des maladies. Nous étudions actuellement comment le champignon autochtone du maïs régule la sécrétion de protéines au-delà de sa fonction d’entretien. Notre protocole montre une synchronicité élevée entre les réplications et la reproductibilité de la colonisation fongique.De plus, avec nos tests, il n’est pas nécessaire d’effacer ou de fixer les échantillons avant de les imager en temps réel. La méthode offre une variété d’applications dans les interactions plantes-pathogènes et a contribué à des études détaillées sur les mécanismes de la pathogénicité fongique dans le maïs et à l’analyse génomique comparative.

detached-maize-sheaths-for-live-cell-imaging-infection-fungal-foliar

Research

JoVE Journal

Biology

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

1.0K vues.  University of Kentucky. Notre équipe vise donc à comprendre les mécanismes de pathogénicité fongique chez les plantes afin d’améliorer la gestion des maladies. Nous étudions actuellement comment le champignon autochtone du maïs régule la sécrétion de protéines au-delà de sa fonction d’entretien. Notre protocole montre une synchronicité élevée entre les réplications et la reproductibilité de la colonisation fongique.De plus, avec nos tests, il n’est pas nécessaire d’effacer ou de fix...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Étude des mécanismes de pathogénicité fongique chez le maïs 

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one originally applied to rice leaf sheaths and allows direct microscopic observation of fungal growth and development in living plant cells. Leaf sheaths collected from maize seedlings with two fully emerged leaf collars are inoculated with 20 &#181;L drops of 5 x 105 spores/mL fungal spore suspensions and incubated in humidity chambers at 23 &#176;C under continuous fluorescent light. After 24-72 h, excess tissue is removed with a razor blade to leave a single layer of epidermal cells, an optically clear sample that can be imaged directly without the necessity for chemical fixation or clearing. Plant and fungal cells remain alive for the duration of the experiment and interactions can be visualized in real-time. Sheaths can be stained or subjected to plasmolysis to study the developmental cytology and viability of host and pathogen cells during infection and colonization. Fungal strains transformed to express fluorescent proteins can be inoculated or co-inoculated on the sheaths for increased resolution and to facilitate the evaluation of competitive or synergistic interactions. Fungal strains expressing fluorescent fusion proteins can be used to track and quantify the production and targeting of these individual proteins in planta. Inoculated sheath tissues can be extracted to characterize nucleic acids, proteins, or metabolites. The use of these sheath assays has greatly advanced the detailed studies of the mechanisms of fungal pathogenicity in maize and also of fungal protein effectors and secondary metabolites contributing to pathogenicity.

This manuscript details an optimized inoculation protocol that uses detached maize leaf sheaths for reproducible cytological, physiological, and molecular studies of maize interactions with fungal plant pathogens. The leaf sheaths facilitate real-time observation of cellular interactions between the living plant and fungus in unfixed tissues.

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Inoculation of Maize Leaf Sheaths with Pathogenic Fungi for Assessing Fungal Pathogenicity

To begin, use heavy duty scissors or shears to cut off the cap end 0.5 millimeters from the conical bottom of a 1.5-milliliter micro-centrifuge tube. Place a piece of glass wool in the cut tube to cover the center hole. Place one assembled glass wool filter unit into a sterile 1.5-milliliter micro-centrifuge tube and label the tube.Next, cut a non-skirted 96-well PCR plate into six two-column support racks. Flip the two-column racks so the conical bottoms of the wells face upwards. Place the rack in a glass Petri dish containing moist filter paper and cover it with the lid to create a humidity chamber for the leaf sheaths.To harvest conidia from the sporulating Colletotrichum graminicola, add three to four milliliters of sterile deionized water into the plate. Using a sterile conical tip pestle, scrape evenly across the entire plate to loosen the spores from the agar. Aseptically add one milliliter of spore suspension onto a glass wool filter unit and allow the spores to flow into the collection tube by gravity.Centrifuge the filtered spore suspension at 3, 500 G for five minutes and pour off the liquid into an autoclavable container. Add one milliliter of sterile deionized water into the collection tube and gently agitate to resuspend the pelleted spores. Again, centrifuge the suspension and resuspend the spores for quantification in 300 to 500 microliters of deionized water.Use a hemocytometer under a compound microscope at 100 times magnification to determine the spore concentration. Then prepare 500, 000 spores per milliliter suspension with deionized water. To remove the sheath from the first true leaf of week two stage seedlings.Run a thumbnail along the overlapping margin of the sheath and gently loosen it from the chute. Cut the recovered leaf sheath into three to five-centimeter segments. Carefully unroll each segment to expose the inner epidermal layer.Apply 20 microliters of fungal spore suspension on the inner surface at the center of the sheath above the mid-rib. Place the inoculated leaf sheaths horizontally, with a mid-rib positioned at the bottom, in a glass Petri plate containing moistened filter paper. Next place the small humidity chambers into a clear storage box lined with moistened germination paper, cover the storage box with a lid, and incubate at 23 degrees Celsius under continuous illumination for the intended time course.Regularly check the boxes for signs of disease on the sheaths.

Inoculation de gaines foliaires de maïs avec des champignons pathogènes pour évaluer la pathogénicité fongique

Preparation of Fungal Infected Detached Maize Leaf Sheaths for Live-Cell Imaging

To begin, gently rinse the maize leaf sheaths inoculated with fungal spores in deionized water. Place the sheath on a clean glass microscope slide with the adaxial surface facing down and the abaxial surface uppermost. Using a single-edge razor blade, trim approximately one centimeter off the sheath ends and remove most lamina tissue on either side of the midrib.Hold the razor blade at a 90-degree angle to shave tissue from the abaxial midrib, exposing the epidermal layer on the adaxial surface above the inoculated spot. Carefully lift the sheath section from one edge and transfer it onto a new slide with the adaxial surface facing the uppermost closest to the objective lens. Apply 60 microliters of deionized water to the section and place a glass cover slip without introducing air bubbles.Stenocarpella maydis rapidly invaded epidermal cells directly via undifferentiated hyphal swellings. While Colletotrichum graminicola produced melanized appressoria. Trypan blue staining revealed the nature and extent of fungal hyphae colonization, with C.graminicola initially invading via thick primary hyphae and later switching to a necrotrophic stage.C.graminicola invades living maize cells using thick primary hyphae separated from the host cytoplasm by a membrane. In contrast, S.maydis produces a phytotoxin that kills the epidermal cells before invading them. In C.graminicola, the production of dark brown precipitate in the maize leaf sheaths indicated an oxidative burst related to a host-resistance response.