Les auteurs tiennent à remercier Génome Canada et Génome Colombie-Britannique pour le financement de la plate-forme, et de soutien. Nous remercions également le Dr Carol E. Parker pour un examen critique du manuscrit et l&#39;édition assistance. CHL remercie également le Britannique protéomique réseau britannique de soutien.

Une. sectionnement des tissus <ol><li> Flash geler les spécimens d&#39;émission, une fois récoltés, en utilisant de l&#39;azote liquide, les expédier sur de la glace sèche (si l&#39;expédition est requise), et de les stocker à -80 ° C jusqu&#39;à ce que le sectionnement de tissu. (Si les échantillons commerciaux sont utilisés, veiller à ce que les échantillons sont préparés de cette manière.) </li><li> Couper les organes à une taille gérable pour s&#39;adapter à la cible MALDI. Coupez les parties non désirées de l&#39;organe. Pour cette étude décrit ici, les lentilles de veau bovins ont été décapsulés en utilisant une procédure décrite précédemment 35 avant découpe de tissu. </li><li> Retirer des organes entiers de -80 ° C congélateur et fixez-les sur une scène de coupe de tissu cryogénique. Pour fixer un objectif de veau, placer une ou deux gouttes d&#39;eau sur la scène d&#39;un cryostat tissu coupe. Placez rapidement la lentille dans l&#39;eau avant qu&#39;elle se solidifie. Sinon, la température de coupe optimale (OCT) composés peuvent également être utilisés pour fixer un tissu sur la scène de coupe. Si les composés de l&#39;OPO se servir, un minimal quantité d&#39;octobre doit être appliqué et il faut prendre soin de s&#39;assurer que les sections de tissu coupées ne sont pas contaminés par des composés octobre qui peut interférer avec l&#39;ionisation et la détection des analytes 5,36,37. </li><li> Laisser la température à l&#39;intérieur du cryostat à s&#39;équilibrer à 18 ° C. Les températures plus froides ou plus chaudes peuvent être utilisés pour les tissus plus doux ou plus durs, respectivement. Ensuite, couper le tissu équatoriale en 20 um tranches épaisses. Utilisez 10-15 um tranches épaisses pour la plupart des tissus, mais, en raison de la nature fragile du tissu de verre de bovins, 20 um tranches épaisses ont été utilisés. Pour le tissu de verre de bovin, jeter les premières sections de tissus et de n&#39;utiliser que des tranches qui sont proches ou au plan équatorial. </li><li> Si un tissu lentille oculaire est imagé, utiliser 1,5 ul d&#39;acide formique (98% de pureté, LC-MS grade) à pré-imbibé la surface d&#39;un oxyde d&#39;indium-étain (ITO) revêtu lame de verre. </li><li> Transférer délicatement les coupes de tissus à la surface de l&#39;ITO-coverre ATED lame de microscope à l&#39;intérieur du cryostat. La coupe de tissu se décongeler rapidement et deviendra hermétiquement fixé à la surface de glissement. Habituellement, des coupes de tissus multiples peuvent être montés sur une même lame d&#39;ITO revêtue de cette façon. </li><li> Lyophiliser la lame pendant 15 min avant l&#39;application de la matrice MALDI. </li><li> Pour le test de la matrice, dissoudre les matrices individuelles dans des solvants appropriés. Repérer manuellement 1 ul de chaque solution de matrice sur la coupe de tissu. De plus, repérer un standard d&#39;étalonnage de petite molécule sur le tissu pour la vérification de la sensibilité MALDI. </li><li> Ajouter trois points d&#39;enseignement de la lame de verre revêtue d&#39;ITO par écrit sur la surface non conductrice de la lame de verre revêtue d&#39;ITO avec un stylo correction fluide. Prendre une image optique de la lame de tissu à l&#39;aide d&#39;un scanner à plat et l&#39;enregistrer dans un format approprié comme tiff ou jpg. </li></ol> 2. Revêtement Matrix 2.1. Matrice revêtement automatisé <ol><li> Apsolutions de matrice de nappe, qui contiennent de l&#39;acétonitrile ou un mélange acétonitrile / eau comme solvant mixte, automatiquement à la surface des coupes de tissu en utilisant un Bruker ImagePrep ou une matrice électronique pulvérisateur similaire. </li><li> Couvrir les bords de la surface avant de la lame de verre revêtu d&#39;ITO avec un ruban de telle sorte que la matrice ne pas recouvrir les bords de la diapositive. Cela garantit que les marques d&#39;enseignement sur la surface opposée peuvent être utilisées pour l&#39;alignement de glissement des tissus. Ne pas recouvrir les bords de la glissière avec la matrice car ils sont utilisés en tant que points de contact pour maintenir la conductivité électrique de la lame revêtu d&#39;ITO. </li><li> Manteau de la lame de verre à l&#39;aide d&#39;une vingtaine de cycles de matrice revêtement (2-sec pulvérisation, 30 sec d&#39;incubation, et 60 secondes de temps de séchage pour chaque cycle). </li></ol> 2.2. Manuel Matrice revêtement <ol><li> Si des solvants organiques (par exemple le chloroforme et l&#39;acétate d&#39;éthyle) qui sont incompatibles avec les matériaux de fabrication de la matrice pulvérisateur électronique sont exirouge, utiliser un aérographe pulvérisateur pneumatique assisté à appliquer la matrice. Ajouter la solution de matrice préparée dans le réservoir de solvant de l&#39;aérographe et appliquer un léger flux d&#39;azote gazeux sous pression pour amorcer la pulvérisation. </li><li> Couvrir les bords de la surface avant des lames de verre ITO revêtus avec de la bande de sorte que la matrice ne pas recouvrir les bords de la diapositive. Cela garantit que les marques d&#39;enseignement sur la surface opposée peuvent être utilisées pour l&#39;alignement de glissement des tissus. Ne pas recouvrir les bords de la glissière avec la matrice car ils sont utilisés en tant que points de contact pour maintenir la conductivité électrique de la lame revêtu d&#39;ITO. </li><li> Après sprays stables et fines ont été observées, pulvériser manuellement la matrice de sorte qu&#39;il enrobe complètement la section de tissu. Appliquer le montant minimum de la solution de matrice nécessaire pour à peine mouiller la surface lors de chaque cycle pour éviter tout risque de délocalisation de l&#39;analyte. En général, utiliser environ 10 cycles de matrice pulvérisation pour enduire une section de tissu, le nombre de cycles esten fonction du type de tissu et la composition de la matrice. </li></ol> 3. MALDI MS <ol><li> Préparer une solution d&#39;étalonnage de masse par dilution de la &quot;Tuning ES Mix&quot; solution standard d&#39;un facteur 1:200 dans 60:40 isopropanol: eau (contenant de l&#39;acide formique à 0,1% dans le mélange final). </li><li> Introduire 2 ul / min de la solution diluée &quot;Tuning ES Mix&quot; dans le bi-mode ionisation électrospray (ESI) de source / MALDI d&#39;ions sur le spectromètre de masse FTICR, à partir du côté ESI. </li><li> Utilisez l&#39;instrument FTICR en mode ESI positif-ion, avec détection à large bande et une taille d&#39;acquisition de données de 1024 kb / s. Paramètres ESI typiques sont tension électrospray capillaire, 3900 V; pulvériser tension de bouclier, 3600 V, le gaz de nébulisation (N 2) flux, 2 L / min; gaz sec (N 2) débit et de température, 4 L / min et 200 ° C; skimmer 1 tension, 15 V, le temps de vol (TOF), 0.009 sec; gaz de collision (Ar) flux, 0,4 L / s; la source d&#39;ions temps d&#39;accumulation, 0,1 sec;et cellule de collision ion temps d&#39;accumulation, 0,2 sec. Régler les paramètres de fonctionnement FTICR afin de maximiser la sensibilité analytique sur la gamme de masse de m / z 200 à 1400, tout en maintenant le bon moment domaine d&#39;induction libre décroissance des signaux (FID). En règle générale, les paramètres de fonctionnement de l&#39;IC sont tension acolyte, 8 V; Sidekick tension de décalage, 8 V; excitation amplification de 10; excitation temps d&#39;impulsion, de 0,01 à 0,015 sec; avant tension de plaque de piège, de 1,5 V; dos piège tension de plaque, 1,6 V et analyseur tension d&#39;entrée, -4 V. Après un ensemble de paramètres de fonctionnement FTICR a été déterminé, d&#39;acquérir les spectres de masse ESI et calibrer l&#39;appareil en utilisant les masses des composés standards de référence dans la solution &quot;ES Tuning Mix&quot;. </li><li> Pour accorder l&#39;instrument pour un fonctionnement MALDI, dissoudre plusieurs fractions de 1 ul d&#39;une terfénadine mixte et la solution étalon de réserpine dans la solution de matrice à une concentration de 1 uM chacun, et repérer ces solutions directement sur l&#39;un des tissudes sections de e (c&#39;est à dire une section de tissu d&#39;essai) qui a été monté sur un coulisseau revêtu d&#39;ITO. Placer la lame revêtu d&#39;ITO dans un adaptateur de lame de tissu (c&#39;est à dire une cible MALDI spéciale) et de charger l&#39;adaptateur du côté MALDI dans la source d&#39;ions double ESI / MALDI. Optimiser les paramètres de fonctionnement MALDI appropriées pour la puissance du laser et le nombre de tirs laser pour MALDI accumulation de signal pour chaque balayage de masse, etc paramètres de fonctionnement MALDI typiques sont: des tirs laser, 50, et une tension de plaque MALDI de 300 V. </li><li> Après réglage, l&#39;étalonnage et l&#39;optimisation de l&#39;instrument pour des expériences MALDI-MSI, aligner l&#39;emplacement physique d&#39;une section de tissu à imager avec son image optique enregistrée dans le logiciel d&#39;imagerie. Utiliser les trois marques &quot;de correction&quot;-fluide, qui avaient été précédemment mis sur le côté opposé de la surface de glissement revêtue d&#39;ITO (étape 1.9), pour cet alignement en utilisant une méthode de triangulation à trois points. </li><li> Effectuez une ESI et MAL simultanéeOpération DI sorte que chaque spectre de masse contient les pics de masse de référence de la solution &quot;ES Tuning Mix&quot; post-acquisition étalonnage de masse interne. Cela se traduira par la mesure de la masse la plus précise au cours de MALDI MS. Pour ce faire, la première atténuer le signal ESI en diminuant la tension capillaire jusqu&#39;à ce que les signaux dominent les spectres MALDI tandis que les signaux de calibrant ESI sont encore suffisamment élevée pour l&#39;étalonnage de masse interne. </li><li> Ensuite, mettre en place une méthode de tramage automatisé pour l&#39;irradiation laser. Définir les zones de tissu à imager et définir la taille de l&#39;étape de trame laser approprié. Notez que les tailles de pas plus petit raster fournissent des images de tissus de la résolution, mais nécessitent un temps significativement plus long du spectre de masse d&#39;acquisition et plus d&#39;espace de stockage de données. Le nombre de pixels de l&#39;image dépend de la taille de pas de trame de laser à mettre en place et de la taille des tissus. Pour une lentille bovine typique qui a une taille de 1 cm 2 de tissu, une image de tissu est typiquement composée de ca. </em&gt; 5000 pixels si une taille de pas de trame de laser de 200 um est utilisé sur un instrument FTICR. Utiliser une analyse «point aléatoire&quot;, car cela empêche la polarisation basé sur la localisation progressive en raison de l&#39;atténuation du signal pendant l&#39;expérience. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Calibrer les spectres de masse MALDI utilisant le calibrage interne pour la comparaison initiale et pour sélectionner pics pour MS / MS. De-isotope et sélectionnez les sommets monoisotopiques comme décrit précédemment, en utilisant un script VBA personnalisée 38. </li><li> Export de la liste résultant de pointe monoisotopiques et saisir les valeurs m / z mesurées dans le METLIN 39 et / ou les BDMH 40 bases de données métabolome pour la masse correspondant avec les entrées de la bibliothèque. Prenons l&#39;(M + H) +, (M + Na) +, et (M + K) + ions pendant les recherches de base de données, avec une erreur de masse admissible de ± 1 ppm. </li><li> Générer des images MALDI pour l&#39;ensemble des entités de lipides détectés à travers l&#39;ensemble de coupe de tissu en utilisant imagun logiciel de courrier analyse, avec une largeur de filtre de masse de 1 ppm au sommet du pic. </li><li> Une fois les images ont été générées pour toutes les valeurs m / z qui correspondent à des entrées de base de données, générer des images pour tous les autres sommets ainsi à rechercher des modèles de distribution uniques qui peuvent être étudiés plus tard. </li></ol> 5. Confirmation de l&#39;identité des lipides imagés <ol><li> Confirmer l&#39;identité des lipides d&#39;abondance élevée, qui ont des ions fragments caractéristiques qui peuvent être détectées en utilisant l&#39;instrument FTICR (par exemple 184,073 pour les phospholipides), par MALDI-MS/MS. Effectuer MALDI-MS/MS utilisant dissociation induite par collision (CID) directement sur le tissu. </li><li> Pour les espèces lipidiques qui ne peuvent être directement confirmée par MALDI-MS/MS, utiliser un système UPLC couplé à un spectromètre de masse Q-TOF 34. <ol><li> Disséquer manuellement aliquotes contenant ~ 10 mg de tissu dans la zone où l&#39;espèce d&#39;intérêt ont été localisés. Placez ces aliquotes de tissu en 2des tubes de centrifugation ml. </li><li> Homogénéiser chaque aliquote de tissu dans 250 ul d&#39;eau, en utilisant un broyeur mélangeur avec deux billes métalliques en acier inoxydable de 5 mm. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;une solution chloroforme-méthanol (1:3, v / v), et les tubes vortex. Ensuite, centrifuger les tubes à l&#39;aide d&#39;une microcentrifugeuse à 12 000 xg pendant 10 min. </li><li> Recueillir les surnageants et les sécher dans un concentrateur de vitesse rotatif sous vide. </li><li> Dissoudre les résidus dans 100 pi de 30:70 isopropanol: eau. Injecter une portion aliquote de 10 ul sur la colonne UPLC pour la séparation en utilisant un gradient d&#39;élution. </li><li> Utiliser les conditions chromatographiques en ligne pour LC-MS/MS lipidiques, qui ont été publiées antérieurement 34. </li><li> Générer un courant ionique extrait (XIC) chromatogrammes en utilisant les valeurs théoriques m / z, avec une fenêtre de ± 50 ppm environ les masses théoriques. </li><li> Si les composés authentiques de ces lipides sont disponibles, faites correspondre les temps de rétention des composés authentiques avec ceux du corpondant pics de XIC à partir des échantillons de tissus. Si les composés sont les mêmes, les durées de rétention et les spectres MS / MS doivent correspondre. </li></ol></li><li> Si un composé authentique n&#39;est pas disponible, utiliser le schéma de fragmentation du lipide détecté pour correspondre à un spectre standard MS / MS à partir d&#39;une base de données métabolome comme METLIN ou BDMH. Utilisez de novo interprétation des spectres de masse pour déterminer une structure possible pour le lipide. </li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les considérations les plus importants pour la réussite MALDI MSI sont: 1) la préparation des tissus, 2) le choix de la matrice; 3) l&#39;application de la matrice, et 4) l&#39;interprétation et l&#39;analyse des données. Lorsque l&#39;échantillon et la matrice sont préparées de manière appropriée, l&#39;acquisition des données est automatisée MS. L&#39;analyse des données de ce type d&#39;expérience est assez de main-d&#39;œuvre. Préparation de tissu approprié est crucial p...

Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est une technique d&#39;analyse pour déterminer la localisation et de distribution la répartition spatiale des composés sur la surface d&#39;une coupe de tissu 1,2. Laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI) MSI pour l&#39;analyse des peptides et des protéines a été utilisé pour plus d&#39;une décennie et il ya eu de grandes améliorations dans les méthodes de préparation des échantillons, la sensibilité de détection, la résolution spatiale, la reproductibilité et le traitement des données de 3,4. En combinant les informations des sections histologiques colorées et expériences MSI, les médecins sont en mesure de corréler les distributions de composés spécifiques avec des caractéristiques intéressantes sur le plan physiopathologique 5. Les modes de distribution de petites molécules, y compris les médicaments exogènes 6,7 et de leurs métabolites 8-10 ont également été interrogés par MALDI-MS imagerie des tissus 11. Les lipides sont peut-être le cla plus largement étudiéart de composés avec l&#39;imagerie MALDI, à la fois dans les MS 12-17 et MS / MS 18 modes. L&#39;utilisation de MALDI MSI pour l&#39;imagerie du petit molécule a été limitée par plusieurs facteurs: 1) des matrices MALDI sont eux-mêmes de petites molécules (typiquement m / z &lt;500), qui génèrent des signaux d&#39;ions abondantes. Ces signaux abondantes peuvent supprimer l&#39;ionisation des analytes à petites molécules et interférer avec leur 19,20 de détection. Sans solvant matrice revêtement 21, matrice sublimation 22, et de la matrice MALDI prérevêtue MS 23, entre autres, ont été développées pour améliorer MSI de petites molécules. Nouvelles matrices qui peuvent améliorer l&#39;analyse des composés de faible poids moléculaire sont d&#39;un grand intérêt dans une petite molécule MSI. Ces matrices doivent fournir des signaux accrus d&#39;analyte avec les signaux de la matrice diminué. Dans le mode ions positifs, le 2,5-dihydroxybenzoïque acide (DHB) et-4-hydroxycinnamique α-cyano acide (ACSSD) sont les deux matrices MALDI MS couramment utilisés pour MSI 24 </sup&gt;. L&#39;idéal serait de former une matrice de petits cristaux, de façon à préserver la localisation spatiale des analytes. DHB a tendance à former des cristaux plus grands, par conséquent, l&#39;application de la matrice à l&#39;aide de sublimation a été développé pour surmonter partiellement ce problème, et a permis l&#39;utilisation de cette matrice pour l&#39;imagerie sensible de phospholipides 22,25. 9-aminoacridine a été utilisé pour des analytes MSI protiques dans le mode ions positifs, et 26 pour les nucleotides et les phospholipides dans la négative, le mode ions 26 à 29. 2-mercaptobenzothiazole a été trouvée pour donner détection de MALDI efficace des lipides 30, et a été utilisée pour l&#39;imagerie du cerveau de souris 31 gangliosides. La très haute résolution de la transformée de Fourier ion résonance cyclotron (FTICR) spectromètres de masse peuvent quelque peu atténuer ce problème en réglant les signaux d&#39;analyte à partir des signaux de la matrice 32. Un autre avantage de l&#39;utilisation de MS-FTICR est que les intensités des pôles de la matrice sont métastables réductioned 33, ce qui réduit également ces interférences 27. L&#39;utilisation de dithranol (DT; la 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) sous forme de matrice MALDI pour l&#39;imagerie des tissus a été précédemment rapporté 34. Dans ce travail en cours, un protocole détaillé est fourni pour l&#39;utilisation de DT pour la MSI des lipides endogènes sur les surfaces des sections de tissu de lentille bovine, dans le mode ions positifs.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Liver</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56023-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Lens</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>57114-2</td>
			<td>Sample should be decapsulated29 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithranol (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10608</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70990</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85707</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terfenadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td></td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Tuning Mix</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2431A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO Coated Glass Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI1207000</td>
			<td>Ensure that samples are placed on the electrically conductive side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen</td>
			<td>Bic</td>
			<td>WOSQP11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush Sprayer</td>
			<td>Iwata</td>
			<td>Eclipse HP-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagePrep</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>249500-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI adapter</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>235380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dithranol as a matrix for matrix assisted laser desorption/ionization imaging on a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer

Spectrométrie de masse imagerie (MSI) détermine la localisation et de la distribution spatiale des motifs de composés sur la surface d&#39;une coupe de tissu, en utilisant principalement MALDI (laser assistée par matrice de désorption / ionisation) à base de techniques analytiques. Nouvelles matrices pour petite molécule MSI, ce qui peut améliorer l&#39;analyse de bas poids moléculaire (MW) composés, sont nécessaires. Ces matrices doivent fournir des signaux accrus d&#39;analyte tout en diminuant les signaux de fond MALDI. En outre, l&#39;utilisation d&#39;instruments très haute résolution, telles que la transformée de Fourier à résonance cyclotronique ionique (FTICR) des spectromètres de masse, a la capacité de résoudre des signaux d&#39;analyte à partir des signaux de la matrice, ce qui peut partiellement surmonter de nombreux problèmes associés à l&#39;arrière-plan provenant de la MALDI matrice. La réduction de l&#39;intensité des métastables grappes de matrice par FTICR MS peut également aider à surmonter certains des interférences associées aux pics de la matrice sur d&#39;autres instruments. Haute résolutioninstruments tels que les spectromètres de masse FTICR sont avantageux car ils peuvent produire des modèles de distribution de nombreux composés simultanément tout en offrant la confiance dans les identifications chimiques. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) a déjà été rapporté comme une matrice MALDI pour l&#39;imagerie des tissus. Dans ce travail, un protocole pour l&#39;utilisation de MALDI DT pour l&#39;imagerie des lipides endogènes à partir des surfaces des sections de tissus de mammifères, par-ion positif MALDI-MS, sur un hybride quadripolaire à ultra-haute résolution FTICR instrument a été fournie.

<html> Des échantillons de tissus qui sont sectionnés et dégel monté sur les lames de verre recouvertes d&#39;ITO doivent être intacts, sans déchirure visible. Pour de nombreux tissus, dégel des tissus montage direct sur une lame de verre recouverte d&#39;ITO est acceptable. Pour certains tissus spécifiques comme objectif de bovin, vaste déchirure des tissus est souvent observé lorsque dégel montage direct est utilisé (figure 1a). Pré-revêtement de la lame de verre ITO avec de l&#39;éthano...

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Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol (DT; la 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) a été précédemment rapporté comme une matrice MALDI pour l&#39;imagerie des tissus de petites molécules, des protocoles pour l&#39;utilisation de DT pour l&#39;imagerie MALDI des lipides endogènes sur l&#39; surface des coupes de tissus par ions positifs MALDI-MS sur un ultra-résolution quadripolaire FTICR instrument sont fournies ici.

Dithranol en tant que matrice pour Matrix Assisted Laser Désorption / Ionisation imagerie sur une transformée de Fourier Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vues.  University of Victoria.  Dithranol (DT; la 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) a été précédemment rapporté comme une matrice MALDI pour l'imagerie des tissus de petites molécules, des protocoles pour l'utilisation de DT pour l'imagerie MALDI des lipides endogènes sur l' surface des coupes de tissus par ions positifs MALDI-MS sur un ultra-résolution quadripolaire FTICR instrument sont fournies ici. 

Vidéo: Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recherche

Biologie

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantifier mélange à l&#39;aide d&#39;imagerie par résonance magnétique

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Améliorer le taux de réussite de cristallisation de protéines par hasard Microseed Matrice dépistage

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Enrichissement de matrice extracellulaire de protéines à partir de tissus et la digestion en peptides pour l&#39;analyse de spectrométrie de masse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

La mise en œuvre d&#39;un système anti-Stokes cohérente Raman Scattering (CARS) sur un Ti: saphir et microscope à balayage laser OPO Based Laser Standard

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

Étalonnage et utilisation des performances de microcoil MRM démontrés sur les racines de la truncatule Medicago à 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Chargement d’échantillons cryogéniques dans un spectromètre à résonance magnétique nucléaire à angle magique qui préserve la viabilité cellulaire

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired from&#160;lipidomics is valuable in studying the pathways involved in development, disease, and cellular metabolism. Many tools and instrumentations have aided lipidomics projects, most notably various combinations of mass spectrometry and liquid chromatography techniques. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has recently emerged as a powerful imaging technique that complements conventional approaches. This novel technique provides unique information on the spatial distribution of lipids within tissue compartments, which was previously unattainable without the use of excessive modifications. The sample preparation of the MALDI MSI approach is critical and, therefore, is the focus of this paper. This paper presents a rapid lipid analysis of a large number of Drosophila brains embedded in optimal cutting temperature compound (OCT) to provide a detailed protocol for the preparation of small tissues for lipid analysis or metabolite and small molecule analysis through MALDI MSI.

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

The aim of this protocol is to provide detailed guidance on the proper sample preparation for lipid and metabolite analysis in small tissues, such as the Drosophila brain, using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging.

Préparation d’échantillons pour analyse lipidique rapide dans le cerveau de drosophile à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice