Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

Les protocoles suivants décrivent la procédure détaillée pour C. elegans blessant la peau et pour tester les réponses des plaies. 1. Aiguille Blessant 3,4 <ol><li> Cultivez vers unstarved sains sur NGM norme (milieu de croissance des nématodes) Plaques avec E. bactéries coli OP50 que l&#39;alimentation, maintenues dans un incubateur à 20 °. NOTE: Méthodes de NGM plaques d&#39;agar et de culture de routine de C. elegans peut être trouvé à www.wormbook.org 6. </li><li> Choisissez 25 vers de stade L4 à un fraîchement ensemencées plaque 1 jour avant blessant et de la culture à 20 ° CO / N. </li><li> Avant blessant, tirez aiguilles des capillaires aide d&#39;un extracteur de l&#39;aiguille. Les aiguilles utilisées dans la blessure sont identiques à ceux utilisés pour la micro-injection de C. elegans. </li><li> Veiller à ce que tous les vers sont au stade jeune adulte. Placer la plaque de vers sur la glace pendant environ 30 min. Refroidissement provoque les animaux d&#39;être lente, facilitant aiguille blessure. <br /&gt; NOTE: Dans les 5 min de la sortie de la glace, les vers vont commencer à se déplacer normalement. Il est possible, mais difficile à blesser les vers mobiles. Avec l&#39;expérience, 5 min est assez de temps pour blesser 25 vers. Immobiliser avec des médicaments tels que le lévamisole (employé dans la blessure laser, voir ci-dessous), bien que les animaux prendront plus de temps pour récupérer. </li><li> Retirer la plaque de gélose de la glace à un stéréomicroscope à dissection. Avec une pointe de ver, déplacer 25 vers dans le centre de la plaque de gélose. </li><li> Placez l&#39;aiguille dans une pointe de pipette 100 pi de tenir plus facilement l&#39;aiguille. Percer la partie antérieure ou postérieure du corps de la vis sans fin avec l&#39;aiguille, évitant la gonade. En général, tenter de blesser entre le pharynx postérieur et antérieur gonade, ou entre la gonade postérieure et le rectum. Réutiliser les aiguilles à plusieurs reprises, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils cassent. NOTE: Se assurer que les blessures sont brèves, piqûres douces qui perforent la cuticule et la peau, pénétrant ~ 5-10 pm dans l&#39;animal. L&#39;aiguille doit entrer dans le animal environ à angle droit par rapport à la peau. Les blessures ne devraient pas causer des dommages aux organes internes évidente, ou la rupture immédiate du corps. Observez une petite quantité de cytoplasme suinte pendant quelques secondes après la blessure; Toutefois, si le contenu cellulaires fuite sur une période prolongée les animaux ne seront pas survivre. Pour l&#39;imagerie optimale, blesser le syncytium latérale épidermique (de hyp7) ou la couture latérale. Remarque: Cette procédure comprend l&#39;utilisation d&#39;une aiguille en verre. </li><li> Autoriser les vers de récupérer à la température ambiante, puis la culture à 20 ° C. Juger de la réussite de l&#39;aiguille blessure par un certain nombre de tests décrits ci-dessous. Plus de 95% des animaux de type sauvage survivre 24 heures après l&#39;aiguille blessant au stade de jeune adulte. L&#39;effet de blesser les larves ou les adultes plus âgés n&#39;a pas encore été analysée. </li></ol> 2. Laser Blessant 3 Utilisez irradiation laser femtoseconde (800 nm) pour effectuer blessures plus précis. <ol><li> Préparer p agarannonces sur une lame de verre fondu avec 2% d&#39;agar 7. Se assurer que les plaquettes sont similaires aux plaquettes d&#39;agar utilisés pour l&#39;imagerie en direct de C. elegans. </li><li> Transférer 10 jeunes vers adultes sur le tampon d&#39;agarose avec le ver de Pick, et ajouter une goutte 2 pi de 12 mM solution lévamisole. Couvrir les animaux et le liquide avec une lamelle. Attendre 1-2 min pour les vers à paralysent. </li><li> Placez la lame de verre sur un microscope confocal disque rotatif. Déplacez la scène pour trouver les vers et se concentrer sur les antérieures ou syncytial postérieure épiderme latérales avec un objectif 100X (NA) de 1,4 à 1,46. </li><li> Régler la puissance du laser femtoseconde à 140 mW (mesurée avant l&#39;objectif). Utilisez le laser femtoseconde à un taux de 80 MHz de répétition. REMARQUE: Deux impulsions de 200 ms chacune (séparés par 20 ms) sont suffisantes pour blessant dans nos mains. </li><li> Focus sur la surface apicale de la cellule épidermique et enroulé l&#39;épiderme. Observez la perturbation locale du cytoplasme (bulles), ou de blanchiment o localef toute marqueur fluorescent utilisé. REMARQUE: Suivez les procédures de sécurité de laser appropriés lors de l&#39;utilisation du laser femtoseconde. balayages de ligne ou un point utilisant des lasers femtoseconde comme ceux de deux microscopes photoniques devraient fournir une puissance suffisante pour blessure laser. REMARQUE: Bien que nous ne avons pas d&#39;expérience directe de l&#39;utilisation d&#39;autres lasers, en principe blessure devrait être possible en utilisant des lasers UV conventionnelles (comme dans C. elegans ablations cellulaires). Eventuellement, utiliser une récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) module sur disque rotatif confocale de blesser l&#39;épiderme (N. Pujol, communication personnelle). </li></ol> 3. Visualisation des réponses des épidermique Ca à Blessant <ol><li> Utilisez transgénique C. elegans souches qui expriment Ca 2+ capteurs (tels que ceux de la série GCaMP) dans l&#39;épiderme, sous le contrôle du promoteur spécifique de l&#39;épiderme adulte col-19 (Figure 1A; transgènes sont répertoriés dans <strong&gt; Tableau 1). Utilisation d&#39;un transgène exprimant une protéine fluorescente rouge comme tdTomato comme contrôle interne pour le niveau d&#39;expression de transgène. NOTE: Nous avons utilisé tdTomato comme un contrôle interne pour l&#39;expression du transgène que la fluorescence épidermique tdTomato est relativement stable et ne interfère pas avec l&#39;imagerie GCaMP. </li><li> Les deux aiguilles et laser blessant déclenchement Ca 2+ élévation dans l&#39;épiderme. Cependant, comme la blessure aiguille ne peut être aisément effectuée sur un disque de filage confocal, des blessures laser est préférable pour l&#39;analyse quantitative de la réponse Ca 2+ (figure 1). </li><li> Acquérir les images de déchéance de temps en mode d&#39;acquisition multi-dimensionnelle (intervalle de temps de 2 secondes avec 114 exposition au laser d&#39;excitation msec) en utilisant un disque confocale de filature à l&#39;objectif 100X (NA 1,4 à 1,46) et des filtres appropriés (filtres GFP vont travailler pour GCaMP3). REMARQUE: Acquérir les images time-lapse toutes les 30 secondes pendant environ 2 heures pour examiner la resp Ca 2+onse à blesser sur un parcours de plus de temps. </li><li> Grâce à un logiciel d&#39;analyse d&#39;images mesurer la fluorescence de GCaMP moyenne en dix régions équivalentes d&#39;intérêt (ROI), dont cinq sont centrées sur le cytosol des cellules épidermiques et cinq en arrière-plan. </li><li> Obtenir fluorescence de référence (F 0) en faisant la moyenne de fluorescence dans les ROI 5 dans l&#39;épiderme puis en soustrayant la moyenne des cinq régions d&#39;intérêt dans le fond avant de blessure. Exprimer la variation de fluorescence AF comme le rapport de changement par rapport à la ligne de base [(F t -F 0) / F 0]. </li></ol> 4. Visualisation des Dynamics F-actine après la blessure <ol><li> NOTE: En réponse à aiguille blessure, observer un anneau d&#39;actine au site de la plaie qui se referme progressivement autour de la plaie. Cette section du protocole des essais fermeture des plaies en mesurant le diamètre de l&#39;anneau d&#39;actine. </li><li> Générer des vers transgéniques qui expriment un marqueur F-actine tel que le domaine de liaison de l&#39;actine de Drosophila moésine fusionné àGFP, exprimé sous le contrôle d&#39;un promoteur spécifique de l&#39;épiderme comme col-19 (figure 2A) (transgène juIs352). NOTE: Nous avons obtenu des résultats similaires en utilisant des marqueurs de domaine tels que Lifeact ou F-tractin (résultats non publiés) contraignant autre actine. </li><li> Effectuer aiguille blessant sur ​​P col-19- vers transgéniques GFP moésine. Après aiguille blessure, observer un anneau de GFP-moésine autour du site de la plaie par ~ 5 min. L&#39;anneau d&#39;actine devient de plus petit diamètre et finalement ferme 2-3 heures après blessant chez les animaux de type sauvage (figure 2A). </li><li> Préparer un tampon de gélose de 2% sur une lame de verre et de les transférer vers 10 sur le tampon dans 2 ul solution mM lévamisole 12. Image les anneaux GFP-moésine 1 h après la blessure en utilisant la microscopie confocale classique. REMARQUE: Utilisez la microscopie confocale à acquérir z-piles (13 x 0,5 um) d&#39;anneaux d&#39;actine 1 h après la blessure. </li><li> Mesurer le diamètre de l&#39;anneau d&#39;actine après la blessure. Pour quantifier épidermique GFP-moésine, d&#39;abord faire une projection d&#39;intensité maximale de la z-pile puis dessinez quatre balayages de lignes (à 45 ° à l&#39;autre) sur l&#39;anneau GFP-moésine. diamètre de la bague est défini comme la moyenne pic à pic de la distance des quatre balayages de ligne (figure 2B). Pour les anneaux qui ont déjà fermés, le diamètre est défini comme 0 um. NOTE: F-actine anneaux sont commodément mesurés 1 h après la blessure car ce est environ à mi-chemin à travers le processus de fermeture de plaie dans le type sauvage. Anneaux F-actine peuvent également être mesurés à de multiples points de temps pour obtenir un cours de temps de fermeture de la plaie. Accéléré films de fermeture de la plaie peuvent être acquises en utilisant les vers de lévamisole immobilisée et la filature disque microscopie confocale. </li></ol> 5. Essai d&#39;induction de épidermiques Antimicrobial Peptides REMARQUE: Blessant déclenche également les réponses immunitaires innées dans le C. la peau elegans. La transcription des gènes codant pour des peptides antimicrobiens (AMP) est induced dans l&#39;épiderme. Le PNL-29 (protéine de neuropeptide-like) AMP est fortement induite par blessant quatre. Pour doser la façon dont l&#39;épiderme contrôle l&#39;expression AMP après blessure, utiliser journalistes transgéniques ou PCR en temps réel pour détecter les niveaux de transcription AMP individuelles. <ol><li> Dosage rapporteur transgénique de la réponse immunitaire innée à blessant quatre. </li><li> Effectuer blessures d&#39;aiguille (comme dans le protocole 1) sur les animaux adultes exprimant le journaliste transgénique frIs7, qui contient P PNL-29- GFP et P col-12- DsRed comme un contrôle interne. Observez les animaux adultes non blessés rouge foncé ou orange dans un filtre à long passe de la GFP. NOTE: Blesser des vers de type sauvage induiront P nlp-29-GFP expression, mais ne affecteront pas P col-12 -dsRed, résultant en des vers qui apparaissent orange, jaune ou verte sous GFP longue passe illumination. Perte de la fonction des gènes dans la voie p38 MAPK, comme PCM-1 ou NSY-1 bloquera nlp-29-GFPinduction après blessant quatre. GFP P PNL-29- est exprimée à des niveaux élevés dans les stades larvaires </li><li> Effectuer AMP essais d&#39;induction chez les jeunes animaux adultes. Veiller à ce que les animaux témoins non blessés ont de faibles niveaux de GFP. NOTE: P PNL-29- expression de GFP est également induite par le stress osmotique 8, et peut être sensible à d&#39;autres stress environnementaux. </li><li> 6 h après la blessure, marquer le nombre de vers qui ont P nlp-29-GFP induction (Figure 3) 9 en utilisant une fluorescence dissection portée avec la GFP filtre passe-temps. NOTE: À 1 h après la blessure P PNL-29- GFP est visiblement induite, atteignant un pic d&#39;environ 6 h ​​après la blessure, puis restant élevée jusqu&#39;à 24 heures après la blessure. Quantifier expression en notation visuelle 4,9. Sinon, quantifier les niveaux d&#39;expression en utilisant une fluorescence activé ver trieuse quatre. Pour la trieuse de ver, au moins 50 animaux ont besoin d&#39;être blessé. </li><li> Test PCR en temps réel pour quantitating niveaux des gènes AMP individuelles de transcription. Les niveaux de transcription analyse pour plusieurs gènes: nlp-29, nlp-30, cnc-1, et cnc-5. </li><li> Effectuer aiguille sur blessant de type sauvage ou vers mutants (voir le protocole 1) </li><li> Recueillir 50 blessés et 50 vers des vers non blessés aux moments souhaités (par exemple, 3, 6, 24 h) après la blessure. </li><li> Extrait ARN en utilisant un kit commercial en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Effectuer une transcription inverse pour obtenir de l&#39;ADNc total de 20 ul en utilisant un kit commercial de la transcriptase inverse. </li><li> Par RT-PCR, en utilisant 0,2 ul d&#39;ADNc (1/40) à partir de chaque échantillon en combinaison avec un supermix vert avec de la fluorescéine et 0,2 uM des amorces. Pour comparer la qualité de l&#39;ARN, utiliser ama-1 ou SNB-1 RT-PCR comme référence; comparer le niveau d&#39;expression relatif AMP en normalisant au contrôle interne (ama-1 ou SNB-1), ou comparer pli induction après la blessure (AMP induction dans les vers blessés / des vers non blessés) par la normealizing au contrôle interne. REMARQUE: cnc-1 et cnc-5 sont caenacin famille peptides antimicrobiens dont la transcription est activée en blessant 10. Typiquement, l&#39;aiguille blessure induit l&#39;expression (~ 500 fois pour cnc-1) sur un parcours de temps de 4 h 10. Les amorces utilisées dans les travaux publiés sont énumérés dans le tableau 2. </li></ol> 6. Essai de survie après la blessure <ol><li> REMARQUE: Blessant active au moins deux voies de signalisation indépendantes de l&#39;épiderme: la plaie voie dépendante de Ca2 + et de réparation de la voie de réponse immunitaire innée. Les deux voies sont nécessaires pour la survie complète de la blessure stérile. Pour tester si un mutant ou un traitement ARNi affecte la cicatrisation des plaies, de mesurer la survie à 24-48 h après la blessure. Eventuellement, utiliser des essais de durée de vie classiques pour déterminer l&#39;effet de blesser sur la longévité 4,9. </li><li> Effectuer aiguille blessant sur les jeunes adultes (L4 + 24 h) vers (50 vers, répétez sevefois RAL) suivantes protocole 1 ci-dessus. Maintenir un nombre équivalent de vers non blessés comme témoins. </li><li> Vérifiez la survie toutes les 24 heures (transfert vers blessés à une nouvelle plaque de gélose toutes les 24 heures). Observez ~ 50% de survie 24 heures après la blessure dans les mutants qui sont défectueux dans la réparation des plaies telles que GTL-2 ou tir-1, après normalisation pour les animaux de contrôle non blessés. Le décès est défini comme un manque de réponse locomotrice à toucher par le ver choix. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

Les méthodes présentées ici pour aiguille et blessures laser offrent des approches complémentaires pour évaluer la capacité de l&#39;épithélium épidermique pour réparer les dégâts. Laser blessure est relativement localisée et (selon la configuration de laser) peut être limitée à l&#39;épiderme, tandis que l&#39;aiguille blessure perturbe l&#39;épiderme, la cuticule, et susceptibles membranes basales internes. Needle blessure peut ressembler plus précisément blessures infligées par des agents pathog?...

mécanismes de guérison des plaies de la peau sont d&#39;intérêt biologique fondamentale et pertinente pour la santé humaine. La cicatrisation des plaies chez les vertébrés et les mammifères comprend une série complexe de réponses coordonnées de multiples tissus et de signalisation 1. De nombreux organismes modèles génétiques simples sont également capables de cicatrisation des plaies de la peau 2. Il est donc intéressant d&#39;analyser les modèles génétiquement traitables de plaie cutanée réparation. Nous et d&#39;autres avons commencé à utiliser Caenorhabditis elegans comme nouveau modèle de plaie cutanée guérison 3,4. L&#39;objectif de ce protocole est de permettre à un ensemble plus large de chercheurs d&#39;utiliser C. elegans comme un outil pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de l&#39;épiderme de la cicatrisation. La C. elegans peau comprend l&#39;épiderme (aussi connu comme hypoderme) et la cuticule extracellulaire 5. L&#39;épiderme adultes est formé à partir d&#39;un petit nombre de syncytia multinucléés, dont le plus grand est le syncytium kurnommée hyp7. L&#39;épiderme est un épithélium simple qui sécrète la cuticule sur sa surface apicale. La peau peut défendre activement contre les agents pathogènes de pénétration cutanée et réparer les petites plaies quatre. La réparation des plaies de la C. la peau elegans est robuste, comme presque tous les animaux de type sauvage survivent peuvent survivre petites plaies perforantes causées par des aiguilles ou des dommages à la peau locale provoquée par irradiation laser. C. elegans blessure de la peau déclenche une série de réactions, y compris une réponse épidermique immunitaire inné, fermeture de la plaie, et la formation de cicatrices 4. L&#39;épiderme adultes est post-mitotique, et la cicatrisation des plaies implique réponses cellulaires locaux, par opposition à la prolifération épidermique ou la migration des cellules. Nous avons montré que les blessures de la peau provoque une augmentation forte et durable dans l&#39;épiderme de Ca2 +, ce qui nécessite le canal de TRPM-2 GTL membrane interne et Ca 2+ trois magasins. Le signal de la Ca épidermique est nécessaire pour la formation et la fermeture des anneaux F-actine à la woSite und. Blessant induit également des réponses immunitaires innées qui activent la transcription de SAP tels que la PNL-29. La transcription induite blessure-de SAP dépend d&#39;un TIR-1 / PMK-1 p38 MAP kinase cascade agir de façon autonome dans l&#39;épiderme 4. Des défauts, soit la voie de signalisation Ca 2+ ou dans la réponse immunitaire innée mèneront à une survie plus faible après la blessure. La structure relativement simple de la C. elegans épiderme, sa traçabilité génétique et des avantages pour l&#39;imagerie in vivo en font un excellent système pour étudier plusieurs aspects de la réparation des plaies. Nous présentons ici des protocoles pour les deux méthodes courantes de blessures: blessure aiguille et en blessant laser. Blessure aiguille nécessite aucun équipement spécialisé (autre que l&#39;extracteur de l&#39;aiguille), et avec l&#39;expérience peut être effectuée sur des centaines de vers par jour. Blessure aiguille est effectué sur les animaux en croissance sur gélose. En revanche, une blessure au laser est effectuée sur anesanimaux thetized montés sur patins agar sous une lamelle, et est adapté pour l&#39;imagerie en direct des réponses cellulaires aux dommages.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Name</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:227px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:227px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:227px;">CA3510-8</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Plastic Petri plate</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">T3308</td>
			<td style="width:227px;">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Levamisole</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">L9756</td>
			<td style="width:227px;">12 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;"><a name="RANGE!A5">Borosilicate Glass Capillary&#160;</a></td>
			<td style="width:227px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:227px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Needle puller</td>
			<td style="width:227px;">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:227px;">P-2000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Worm pick (Platinum wire)</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">PT-9010</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:227px;">M9 solution</td>
			<td style="width:227px;">Home-made</td>
			<td colspan="2" style="width:453px;">3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Trizol</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:227px;">15596026</td>
			<td style="width:227px;">Use 500 ml for 50 worms</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">iQ SYBR Green</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:227px;">1708882</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">SuperScript III</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:227px;">18080-051</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">PCR machine</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">C1000/CFX96</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">96-well PCR tubes</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">MLL9601</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:227px;">Metamorph</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

La C. elegans cuticule épiderme et forment une couche de la peau simple mais sophistiqué qui permet de réparer des dommages localisés résultant de blessant. Études des réponses de la plaie et la réparation de ce modèle ont éclairé notre compréhension du cytosquelette et les réponses génomiques à des lésions tissulaires. Les deux méthodes les plus couramment utilisés pour blesser l&#39;C. elegans peau adulte sont piqûres avec aiguilles de microinjection, et irradiation laser local. Needle blessant localement perturbe la cuticule, épiderme, et de la matrice extracellulaire associé, et peut également endommager les tissus internes. les résultats d&#39;irradiation laser dans des dommages plus localisée. Blessure déclenche une succession de réponses facilement dosés y compris épidermique élevée de Ca2 + (secondes) minutes, la formation et la fermeture d&#39;un cycle contenant de l&#39;actine au niveau du site de la plaie (1-2 heures), la transcription de gènes élevée de peptides antimicrobiens (24/2 h), et la formation de cicatrices. Essentiellement tous les animaux adultes de type sauvage survivent blessure, oùque des mutants défectueux dans la réparation de la plaie ou d&#39;autres réponses montrent diminution de la survie. Des protocoles détaillés pour l&#39;aiguille et blessures laser, et des dosages pour la quantification et la visualisation des réponses plaies et les processus de réparation (dynamique Ca, dynamique de l&#39;actine, antimicrobien peptide induction et la survie) sont présentés.

Laser ou une aiguille blessure va déclencher l&#39;élévation rapide et soutenue des niveaux Ca épidermiques, comme visualisé avec des capteurs Ca tels que GCaMPs (Figure 1). L&#39;élévation Ca se produit en quelques secondes, et reste élevé pendant plusieurs dizaines de minutes. Aiguille blessant reproductible conduit à la formation d&#39;anneaux F-actine dans des sites de la plaie (figure 2); ceux-ci apparaissent en quelques minutes, et peu à peu étroit sur 1-2 heures aprè...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Méthodes pour Blessant Peau et Essais pour les réponses de blessure dans<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.2K vues.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

Vidéo: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Paradigmes pour la caractérisation pharmacologique de C. elegans mutants transmission synaptique

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Recherche

Biologie

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Les dosages des Saisies en Neurocircuit Mutants épilepsie du Drosophile</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Méthodes d&#39;évaluation de Subcellular compartiments de muscle en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Suivi et quantification des processus de développement des<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilisation des outils open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Méthodes d’étude des changements dans l’agrégation des protéines inhérente avec l’âge chez Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Mesures des réponses physiologiques au stress à C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...