Ce travail a été supporté en partie par des subventions de l&#39;Agence Nationale pour la Recherche, programme PIRIbio Dynabiofilm et de programme des risques interdisciplinaire CNRS. Nous remercions Philippe Thomen pour sa lecture critique du manuscrit et Christophe Beloin pour fournir l&#39;E. coli, souche utilisée dans ce travail.

1. Culture de bactéries et de préparation de Suspension <ol><li> Choisissez une colonie fraîchement cultivés à partir d&#39;une plaque de gélose Lysogénie Broth (LB), inoculer dans 5 ml de milieu LB liquide contenant 100 μ g / ml d&#39;ampicilline et 7,5 μ g / ml tétracycline et incuber pendant 5 à 6 heures à 37 ° C sur une plate-forme en secouant. </li><li> Ensuite, ajouter 100 μ l de la culture bactérienne dans 5 ml de milieu minimum (M63B1) supplémenté avec 0,4% de glucose et les mêmes concentrations en antibiotique. Incuber cette nuit de culture fraîchement diluée à 37 ° C sur une table d&#39;agitation. </li><li> Après 16 heures d&#39;incubation, ajouter 100 ul de la culture de la nuit à 5 ml M63B1, 0,4% de glucose. Garder le tube à 37 ° C à la plate-forme en secouant jusqu&#39;à 0,5 OD est atteint. La suspension est alors prêt pour l&#39;injection dans le canal d&#39;essai pour la formation de biofilm. </li></ol> 2. Préparation de particules magnétiques <ol><li> Prenez 10 particules magnétiques ul -2,8 μ m de diamètre - dans le stock et les laver 3x dans 190 pi de milieu minimum à l&#39;aide d&#39;un porte-échantillon magnétique. </li><li> Ajuster la concentration en particules de 5 x 10 6 / ml de perles. Typiquement, 50 pi de la solution de talon lavé est mélangé avec un autre 950 μ l de M63B1 avec 0,4% de glucose. </li></ol> 3. Préparation Manche et biofilm croissance <ol><li> Montage de la Manche <ol><li> Coupez deux carrés (800 μ m de longueur de côté) des capillaires en verre borosilicate 10 cm de long à obtenir deux 8 cm de long morceaux. </li><li> Coller les deux éléments capillaires sur deux lames de verre coupées en deux - première - 2 cm de distance avec une cm-faux à chaque extrémité comme dans la figure 1 à l&#39;aide d&#39;une colle à base de cyanoacrylate à action rapide (appelé super-colle). </li><li> Autoclave toute l&#39;installation et le tube nécessaire requis pour obtenir une connexion de canal. </li><li> Rassemblez tous les matériaux stériles sousune hotte à flux laminaire: i) le canal monté et piège 1, ii) les tubes et connecteurs, iii) les deux pièges à bulles - le filtre à bulles couramment utilisé pour sécuriser goutte-à-alimentation (le piège des enfants 1) et le piège à bulles fait maison comme un long tube de 4 cm de diamètre plus grand (piège 2), iv) des pinces, v) 30 ml seringues remplies de M63B1, 0,4% de glucose, et vi) le flacon à déchets. </li><li> Connectez l&#39;ensemble de l&#39;installation avec connecteurs Luer Lock ou des carrefours dans l&#39;ordre suivant: 50 ml M63B1 contrôlée par la pompe seringue, filtre à bulle pédiatrique, maison piège à bulles, capillaire (figure 1, partie B), et le tube de la bouteille de déchets seringue. Ensuite, remplissez le programme d&#39;installation avec M63B1 stérile, 0,4% de glucose, tourner sur la pompe à seringue à un débit d&#39;environ 10 ml / h, plus élevé que les taux expérimentales. Suivre attentivement et d&#39;éliminer toutes les bulles dans le circuit. </li><li> Débit moyen à travers le système pendant 10-15 min; simultanément mélanger 1 ml de la suspension de bactéries à DO 0,5 de la section1.3 avec 1 ml de la solution de billes lavé préparé dans la section 2.2. </li><li> Attacher (mais ne pas fermer) pinces à la tubulure à deux positions: avant et après les capillaires. Mettez le flux hors tension. </li><li> Introduire le mélange bactérien-perle dans le capillaire après le fait maison piège à bulles à l&#39;aide d&#39;une seringue de 1 ml, en prenant soin de tenir le tube se termine pour empêcher l&#39;entrée d&#39;air. Ré-attacher le tube et puis fermez les pinces. </li><li> Répétez la même procédure pour le deuxième capillaire et de vérifier tous les tubes pour les bulles. </li><li> Transférer le dispositif de microscope et la laisser reposer pendant 15 à 20 min pour permettre aux bactéries de se déposer et fixer sur la surface du capillaire. Installer le tube capillaire sur la platine du microscope avec le conteneur de déchets à un niveau légèrement supérieur. Placez la pompe de seringue sur le comptoir à côté du microscope. Élever le piège à bulles avant le capillaire légèrement plus élevé que le plan de capillaires pour capturer des bulles. </li></ol></li><li> Biofilm Growth <ol><li> Ajuster le débit de la pompe à seringue et démarrer l&#39;écoulement, le biofilm va maintenant développer sur la surface du capillaire pendant la période nécessaire - en général de 24 ou 48 heures dans ces expériences. </li><li> Focus sur le plan inférieur capillaire et commencer l&#39;enregistrement time-lapse des exemples d&#39;images - habituellement une fréquence d&#39;acquisition de 2 images / min rendra compte de manière adéquate la croissance du biofilm. Ce moniteurs vidéo biofilm post-contrôle de la croissance (voir extraits en vidéos 1, 2 et 3). </li></ol></li></ol> 4. Pinces magnétiques installation <ol><li> Visser les pinces magnétiques sur micromanipulateurs XYZ à commande manuelle et visser les micromanipulateurs sur la platine du microscope pour ajuster la position de la pince par rapport au capillaire. Placer la pince que sur la figure 2, pour assurer le gradient de champ magnétique approprié est généré dans la zone d&#39;observation. </li><li> Connectez les pinces to le générateur de fonction par l&#39;intermédiaire de l&#39;amplificateur de puissance pour générer une période de 40 secondes de temps en 24 sec de signal zéro et 16 sec de 4 A à courant continu avec un déclencheur envoyé au brillant obturateur de lumière de champ après 20 sec pour la synchronisation du signal fournissant une séquence de événements qu&#39;à la figure 3. Remarque: Ces deux opérations peuvent être réalisées à tout moment entre l&#39;installation capillaire et la mesure début. Voir expérimenter croquis aperçu dans la figure 4. </li></ol> 5. Acquisition courbe de fluage <ol><li> Utiliser la commande de déplacement xy de la platine du microscope à amener le bord du pôle magnétique gauche et le bord gauche de la capillarité dans le même champ d&#39;observation. Prendre l&#39;origine du référentiel analyse à l&#39;intersection de x et y des axes définis par le bord du capillaire et le bord de la pièce polaire, respectivement (voir Figure 2). </li><li> Ajustez la position verticale du capillaire à l&#39;aide mise au point fine control bouton de la position du microscope. Plan généralement le premier examen est situé entre 4 à 7 μ m au-dessus du fond du capillaire. Vidéo 1 correspond au champ xy qui a son coin supérieur gauche à l&#39;origine du référentiel spatial. </li><li> Déclencher la séquence de 40 secondes d&#39;événements décrits dans la section 4.2 et la figure 3 par la mise en marche du générateur de courant et dans le même temps, déclencher manuellement la séquence de la vidéo 1 d&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Déplacez le capillaire au champ droit voisin par un μ m traduction 250 de la platine du microscope à gauche et à fonctionner comme dans la section 5.3 pour générer la vidéo 2 de la tranche 2 et ainsi de suite pour obtenir les vidéos nécessaires. En général 3 à 4 domaines de 250 x 250 μ m 2 sont collectées le long de l&#39;axe x avant de changer le plan et en répétant les mêmes opérations pour le nouveau plan. </li></ol> 6. Calibration de travail <ol><li> Préparer une solution de glycérol en mélangeant 39,8 g de glycérol avec 190 μ l d&#39;eau bi-distillée et 10 pi de particules magnétiques à une 2 x 10 9 particules / ml et remplir un canal expérimental avec ce mélange et le placer sur la platine du microscope comme décrit pour l&#39;échantillon de biofilm. </li><li> Après l&#39;installation des pinces magnétiques comme indiqué dans l&#39;article 4, appliquer la force magnétique, comme indiqué à la section 5.4 et faire des images en accéléré pour extraire la vitesse de chaque particule unique (v) et sa position dans le capillaire pour obtenir le fichier de calibration. Ce fichier doit contenir la force appliquée en fonction de sa position dans la zone d&#39;analyse du capillaire conformément à la loi de Stokes, F = 6πRηv (R: rayon de la particule). </li></ol> 7. Analyse <ol><li> Utilisez un logiciel &quot;particules traqueur&quot; pour obtenir des fichiers de texte avec les positions de particules dans chaque trame pour toutes les piles d&#39;images acquises, comme indiqué dans l&#39;article 5. Using la fréquence d&#39;acquisition d&#39;image de la pile, de calculer le déplacement des particules en fonction du temps (par exemple de la figure 5 et vidéo 4). </li><li> Utilisation du fichier d&#39;étalonnage de la force, de convertir les courbes de déplacement à courbes de compliance (conformité totale de la matière - J (t) - en fonction du temps) selon la formule de la conformité: <img alt="" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq1.jpg" width="106" /> qui donne la relation entre la contrainte et la contrainte du matériau appliqué pour une particule de sonde de rayon R incorporé dans un milieu visco-élastique incompressible, homogène tel que précédemment établi par Schnurr et ses collaborateurs 19. </li><li> Régler les courbes de compliance de fluage au modèle de Burgers général pour les matériaux viscoélastiques et d&#39;en tirer les paramètres viscoélastiques, J 0, J 1, η 0, η 1 pour chaque particule ( <strong&gt; La figure 6) selon la formule de la Burgers: <img alt="" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq2.jpg" width="169" /> Remarque: Cette analyse phénoménologique a déjà été utilisée pour une large gamme de matériaux, y compris les matériaux biologiques tels que les biofilms à interpréter les données de rhéologie macroscopiques 20-22. </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Battling+biofilms.">Battling biofilms.</a> Scientific American. 285, 74-81 (2001).</li><li>Branda, S. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+antimicrobial+treatments+change+the+viscoelastic+properties+of+bacterial+biofilms.">Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms.</a> Biofouling. 27, 207-215 (2011).</li><li>Apgar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-particle+tracking+measurements+of+heterogeneities+in+solutions+of+actin+filaments+and+actin+bundles.">Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles.</a> Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Cette particule magnétique ensemencement et en tirant expérience in situ a permis la cartographie 3D des paramètres viscoélastiques d&#39;un biofilm de plus en plus dans son état ​​d&#39;origine en. Cette approche a révélé l&#39;hétérogénéité de la mécanique E. coli biofilm cultivé ici et a donné des indices pour pointer les composants du biofilm soutenant les propriétés physiques du biofilm, ce qui suggère fortement une implication fondamentale de la matrice extracellul...

Biofilms bactériens sont des communautés de bactéries associées à des surfaces biologiques ou artificiels 1-3. Ils forment par un mécanisme d&#39;adhérence croissance, associée à la production de matrice extracellulaire riche en polysaccharides qui protège et stabilise l&#39;édifice 4,5. Ces biofilms sont pas simplement passifs assemblages de cellules collées aux surfaces, mais les systèmes biologiques complexes dynamiques organisés et. Lorsque les bactéries planctoniques à passer de biofilm mode de vie, les changements dans l&#39;expression des gènes et la physiologie des cellules sont observées ainsi qu&#39;une augmentation de la résistance aux antimicrobiens et accueillent les défenses immunitaires étant à l&#39;origine de nombreuses infections persistantes et chroniques 6. Cependant, le développement contrôlé de ces structures vivantes offrent également des possibilités pour des applications industrielles et environnementales, telles que la bioremédiation des sites de déchets dangereux, bio-filtration de l&#39;eau industrielle ou de la formation de bio-barrières pour protéger les sols et les eaux souterraines de contamination. Bien que les caractéristiques moléculaires spécifiques de la manière de biofilm de vie sont de plus en plus décrits, les mécanismes d&#39;entraînement le développement communautaire et la persistance restent floues. En utilisant les dernières avancées sur les mesures micrométriques utilisant électrochimique de balayage ou la microscopie à fluorescence, ces organisations vivantes ont été montré pour présenter considérable structurel, chimique et biologique hétérogénéité 7. Pourtant, jusqu&#39;à présent, la mécanique du biofilm ont été principalement examinés macroscopiquement. Par exemple, l&#39;observation des banderoles de biofilm déformation due aux variations de taux d&#39;écoulement de fluide 8,9, compression uniaxiale de pièces mécaniques de biofilm milieu d&#39;agar ou cultivé sur le couvercle glisse 10,11, cisaillement du biofilm collecté de l&#39;environnement, puis transféré à un parallèle rhéomètre à plaques 12,13, la spectroscopie de force atomique en utilisant une bille de verre et revêtu d&#39;un biofilm bactérien fixé à un cantilever AFM 14 ou un micr dédiéocantilever méthode de mesure de la résistance à la traction de fragments de biofilm détachées 15,16 ont été mis en œuvre au cours des dix dernières années, fournissant des informations utiles sur la nature viscoélastique du matériau 17. Cependant, il semble probable que des informations sur des propriétés mécaniques du biofilm in situ est perdue lorsque le matériau est retiré de son environnement d&#39;origine, ce qui est souvent le cas dans ces approches. En outre, le traitement du biofilm en tant que matériau homogène manque les informations sur l&#39;éventuelle hétérogénéité des propriétés physiques au sein de la communauté. Par conséquent, la portée exacte de la mécanique de la structure de la formation de biofilm et des caractéristiques biologiques telles que les motifs d&#39;expression du gène ou de gradients chimiques peuvent difficilement être reconnus. Pour progresser vers une description microscopique des propriétés physiques du biofilm, de nouveaux outils dédiés sont nécessaires. Cet article détaille une approche originale conçue pour atteindrela mesure des paramètres mécaniques locales in situ, sans perturber le biofilm et permet le dessin de la répartition spatiale des propriétés du matériau à micro-échelle, puis l&#39;hétérogénéité mécanique. Le principe de l&#39;essai repose sur le dopage d&#39;un film biologique en croissance avec des microparticules magnétiques suivie de leur chargement à distance en utilisant des pinces magnétiques dans le biofilm mature. déplacement des particules sous l&#39;application de la force magnétique contrôlé imagé au microscope permet la dérivation de paramètre viscoélastique local, chaque particule de rapports de son propre environnement local. A partir de ces données, le profil 3D mécanique du biofilm peut être tirée, révélant état dépendances spatiales et environnementales. L&#39;ensemble de l&#39;expérience sera montrée ici sur un E. biofilm coli faite par une souche génétiquement modifiée portant un plasmide F-comme déréprimée. Les résultats détaillés dans un document récent 18 offrent une vision unique de l&#39;intérieur de la mécanique du biofilm intactes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 1: Reagents and cells</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="20" rowspan="2" style="height:22px;width:216px;">Magnetic particles</td>
			<td rowspan="2" style="width:323px;">Life technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:224px;">14307D</td>
			<td colspan="2" rowspan="2" style="width:496px;">Micrometric magnetic particle, 2.8 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr height="2">
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Ampicillin (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">A9518</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetracycline (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">87128</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacterial strain MG1655gfpF</td>
			<td style="width:323px;">UGB, Institut Pasteur, France</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 2:&#160; Capillaries and tubing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Filters for pediatric perfusion</td>
			<td style="width:323px;">Prodimed-Plastimed</td>
			<td style="width:224px;">6932002</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hollow Square Capillaries</td>
			<td style="width:323px;">Composite Metal Scientific</td>
			<td style="width:224px;">8280-100</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0512</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0700</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Table 3: Biofilm growth</td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td style="width:495px;"></td>
			<td style="width:1px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysogeny Broth (LB) solution</td>
			<td style="width:323px;">Amresco-VWR</td>
			<td style="width:224px;">J106-10PK</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">standard medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M63B1 solution</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Standard minimum&#160; medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">G8270</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 4: Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera EMCCD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:224px;">C9100-02</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Heater controller</td>
			<td style="width:323px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:224px;">300354</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Function generator</td>
			<td style="width:323px;">Agilent technologies</td>
			<td style="width:224px;">33210A</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power amplifier</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:323px;">Kd Scientific</td>
			<td style="width:224px;">KDS-220</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shutter</td>
			<td style="width:323px;">Vincent Associates</td>
			<td style="width:224px;">Uniblitz T132</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:216px;">Magnetic tweezers</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 5: Optics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:224px;">TE-300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20&#160; 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55</td>
			<td style="width:323px;">Chroma</td>
			<td style="width:224px;">1)#49020 2)#31002</td>
			<td>Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 6: Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:323px;">NIH - particle tracker plugin</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

remote magnetic actuation of micrometric probes for in situ 3d mapping of bacterial biofilm physical properties

L&#39;adhérence bactérienne et à la croissance sur les interfaces conduisent à la formation de structures en trois dimensions hétérogènes dits biofilms. Les cellules qui demeurent sur ces structures sont maintenues ensemble par des interactions physiques induites par un réseau de substances polymères extracellulaires. Biofilms bactériens impact sur de nombreuses activités humaines et la compréhension de leurs propriétés est cruciale pour une meilleure maîtrise de leur développement - la maintenance ou l&#39;élimination - en fonction de leur résultat négatif ou positif. Cet article décrit une nouvelle méthodologie visant à mesurer in situ les propriétés physiques locales du biofilm qui avait été, jusqu&#39;à présent, examiné que dans une perspective de matériau macroscopique et homogène. L&#39;expérience décrite ici consiste à introduire des particules magnétiques dans un biofilm de plus en plus aux semences sondes locales qui peuvent être actionnés à distance sans perturber les propriétés structurales du biofilm. Pinces magnétiques dédiés ont été développé pour exercer une force définie sur chaque particule noyée dans le biofilm. La configuration est monté sur la scène d&#39;un microscope pour permettre l&#39;enregistrement d&#39;images de time-lapse de la période de particules de traction. Les trajectoires des particules sont ensuite extraites à partir de la séquence de traction et les paramètres viscoélastiques locaux sont obtenus à partir de chaque courbe de déplacement des particules, assurant ainsi la distribution de 3D-spatiale des paramètres. Gagner un aperçu du profil mécanique du biofilm est essentiel du point de vue d&#39;un ingénieur des fins de contrôle du biofilm mais aussi d&#39;un point de vue fondamental de clarifier la relation entre les propriétés architecturales et la biologie particulière de ces structures.

Une analyse typique fournira la distribution spatiale des paramètres viscoélastiques à l&#39;échelle du micron sur un biofilm vivant sans déranger son agencement d&#39;origine. Des résultats typiques sont présentés dans la figure 7, où les valeurs de J 0 - la compliance élastique - sont donnés en fonction de l&#39;axe z le long de la profondeur et de l&#39;axe y le long d&#39;une dimension latérale du biofilm. Chaque point correspond à un bourrelet dont l&#39;analyse de la courbe...

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Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Ce document montre une méthodologie originale sur la base de l&#39;actionnement à distance de particules magnétiques ensemencées dans un biofilm bactérien et le développement des pinces magnétiques dédiés pour mesurer in situ les propriétés mécaniques locales du matériau vivant complexe construit par des micro-organismes au niveau des interfaces.

Déclenchement à distance magnétique de sondes micrométriques pour<em&gt; In situ</em&gt; Cartographie 3D de biofilms bactériens Propriétés physiques

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

9.1K vues.  Sorbonne Universités, UPMC.  Ce document montre une méthodologie originale sur la base de l'actionnement à distance de particules magnétiques ensemencées dans un biofilm bactérien et le développement des pinces magnétiques dédiés pour mesurer in situ les propriétés mécaniques locales du matériau vivant complexe construit par des micro-organismes au niveau des interfaces. 

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparamétrique cartographie optique du Cœur lapin perfusé de Langendorff

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Recherche

Bio-ingénierie

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided endovascular procedures have several significant limitations, including difficult catheter navigation and use of ionizing radiation, which can potentially be overcome using a magnetically steerable catheter under MR guidance.
	The main goal of this work is to develop a microcatheter whose tip can be remotely controlled using the magnetic field of the MR scanner. This protocol aims to describe the procedures for applying current to the microcoil-tipped microcatheter to produce consistent and controllable deflections.
	A microcoil was fabricated using laser lathe lithography onto a polyimide-tipped endovascular catheter. In vitro testing was performed in a waterbath and vessel phantom under the guidance of a 1.5-T MR system using steady-state free precession (SSFP) sequencing. Various amounts of current were applied to the coils of the microcatheter to produce measureable tip deflections and navigate in vascular phantoms.
	The development of this device provides a platform for future testing and opportunity to revolutionize the endovascular interventional MRI environment.

Current applied to an endovascular microcatheter with microcoil tip made by laser lathe lithography can achieve controllable deflections under magnetic resonance (MR) guidance, which may improve speed and efficacy of navigation of vasculature during various endovascular procedures.

Magnétique assistée à distance de déviation contrôlée Astuce Microcatheter sous imagerie par résonance magnétique

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Fabrication d&#39;un fonctionnalisés magnétique bactérienne nanocellulose avec oxyde de fer Nanoparticules

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Numérisation rapide résonance paramagnétique électronique ouvre de nouvelles voies pour l&#39;imagerie physiologiquement Paramètres importants<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

L&#39;agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Installation optimisée et protocole d’imagerie de domaines magnétiques sur mesure In Situ de hystérésis

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Amélioré l’Hydrogel 3D des Cultures de cellules gliales primaires pour In Vitro la modélisation du neuro-inflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositifs électriques et magnétiques de champ pour la stimulation des tissus biologiques

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...