Cette recherche est soutenue par la Fondation Nationale de la Recherche et de l&#39;Education de Singapour Ministère en vertu de son Centre de recherche du Programme d&#39;excellence, les subventions de démarrage (M4330002.C70) de l&#39;Université technologique de Nanyang, et ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) du Ministère de l&#39;Education, à Singapour. Les auteurs remercient Joey Yam Kuok Hoong pour participer à la manifestation de ce protocole.

1. biofilm Culture <ol><li> Préparation de Souches bactériennes <ol><li> 1 jour avant la culture du biofilm, préparer des cultures bactériennes planctoniques par inoculation de 2 ml de milieu de croissance approprié de culture bactérienne congelé. Utilisez milieu Luria-Broth (10 g L -1 NaCl, 10 g d&#39;extrait de levure L -1, et 10 g L -1 tryptone) pour mucoïde P. aeruginosa et ses Δ pel et Δ PSL mutants défectueux. Incuber une nuit à 37 ° C et 200 rpm conditions secouant. Diluer cultures d&#39;une nuit à une DO 600 de 0,40 à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. </li><li> Assembler configuration de cellule d&#39;écoulement, ce qui a été décrit précédemment 14, de préférence sur une station ou un chariot mobile qui peut être amené dans la chambre de microscope pour l&#39;imagerie de la cellule d&#39;écoulement sans démontage. </li><li> Préparer un milieu de croissance stérile dans L 2 ou L 5 bouteilles pour chaque cellule d&#39;écoulement. Utilisez milieu minimal M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM de NH 4 Cl, NaCl 9 mM, 2 mM de MgSO 4, et 0,1 mM de CaCl2) supplémenté avec 0,04% de glucose (poids / volume) et 0,2% (poids / volume) casaminoacides) pour P. aeruginosa biofilms flux de cellules. </li><li> Microsphères fluorescentes aliquote dans des microtubes et filent dans H 2 O stérile pendant 5 min dans la centrifugeuse à 9,391.2 g. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de milieu de croissance pour supprimer l&#39;azide de sodium (désinfectant) avant d&#39;ajouter à un milieu de croissance dans 2 L ou L 5 bouteilles de taille. NOTE: Différentes tailles de microsphères viennent dans différentes concentrations et doivent être dilués en conséquence les instructions. Par exemple, disperser 120 ul de 1,0 um microsphères de diamètre, 15 ul de 0,5 um microsphères de diamètre et 0,96 pi de 0,2 um microsphères de diamètre dans 2 L de milieu de croissance pour donner 2,18 × 10 6 microsphères ml -1 pour chaque taille de particule. </li><li> Fixer la bouteille moyenne à UPSTrame de cellule d&#39;écoulement et permettre milieu de croissance de circuler à travers toute l&#39;installation. Arrêter l&#39;écoulement et injecter cultures de la nuit dilué dans des chambres de la cellule d&#39;écoulement. Permettre aux bactéries de se fixer au substrat de lamelle couvre-objet pendant 1 heure avant de continuer l&#39;écoulement de milieu de croissance à un taux d&#39;environ 5,5 x 10 -3 m s -1, ou 8 tours par minute avec une pompe péristaltique écoulement. NOTE: Les biofilms sont généralement cultivées à la température ambiante (25 ° C) pendant 3-7 jours. </li><li> En variante, pour la configuration de culture statique, diluer 100 fois cultures d&#39;une nuit dans des tubes de microcentrifugation en ajoutant 10 ul d&#39;une culture d&#39;une nuit de milieu de croissance ml de particules. Augmenter la concentration des particules dans le milieu de croissance de culture statique d&#39;environ 500 fois par rapport à celle utilisée pour les films biologiques d&#39;écoulement (par exemple, laver et remettre en suspension 600 ul de 1,0 um sphères d&#39;un diamètre dans 10 ml de milieu de croissance) comme biofilms de cellules d&#39;écoulement sont constamment réapprovisionné avec particules, mais les cultures ne sont pas statiques. <ol><li> Ajouter 2001; l de culture de nuit diluée avec des particules dans les chambres de 8 diapositives ainsi. Incuber à 37 ° C dans des conditions statiques. Les biofilms sont généralement cultivées pendant 1 nuit. Remplacer milieu de croissance journalier passé avec le milieu de croissance frais avec des particules si biofilm est cultivée pour plus de 1 jour. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Microscopie <ol><li> Le jour 3 et 5, éteignez débit de la pompe péristaltique et mettre la configuration de la cellule d&#39;écoulement dans la salle de microscopie. Tube de serrage près de l&#39;entrée et la sortie des chambres de cellules de flux pour éviter la dérive (une cause d&#39;erreur systématique par des changements dans l&#39;environnement) de flux. Placer la cellule d&#39;écoulement sur la platine du microscope de un microscope droit. REMARQUE: Utilisez un microscope inversé pour l&#39;imagerie de micropuits. </li><li> Utilisez la microscopie à fluorescence avec 40X objectif d&#39;huile de prendre des vidéos du mouvement de microsphères embarqués dans le biofilm à divers endroits (microcolonies et couches indifférenciées plat) et à des jours différents (jour 3 et 5) pourenquêtes temporelles et spatiales. Prenez des vidéos courtes avec un taux de trame plus élevée pour enquêter sur les événements qui se produisent au sein de courtes échelles de temps (par exemple 1,5-3 min vidéos à taux de 25-50 images par seconde pour la dynamique rapide de trame), et des vidéos plus longues avec un taux de cadre inférieur pour enquêter sur les événements de plus de plus de temps échelles (par exemple des vidéos de 15-30 min à taux de 2,5-5 images / sec pour une dynamique plus lente cadre). NOTE: Une vidéo contient généralement 5-10 particules, et est typiquement de 1,0-2,5 Go en taille de fichier. Grandes microcolonies peuvent détenir plus de particules. Prenez 5-10 vidéos pour chaque catégorie (par exemple 5-10 vidéos de différents microcolonies et de différents endroits dans les couches plates indifférenciées). Le biofilm a une architecture hétérogène qui peut consister en microcolonies, des canaux, des vides et des couches plates indifférenciées. </li><li> Enregistrer des vidéos en format approprié qui peut être lu par les Fidji / ImageJ (par exemple CZI, TIF). </li><li> Vérifiez vidéos pour la dérive en faisant défiler vid finieo et en observant que les particules ne se déplacent pas dans le même sens en même temps. La dérive peut être provoquée par le mouvement z-étape, les courants dans la cellule d&#39;écoulement, le déséquilibre de table anti-vibration, pression d&#39;air ou des variations de température. Corriger mineure à la dérive en utilisant des techniques de post-traitement généralement fournis avec le logiciel de microscope. Jeter toutes les vidéos dans lequel la dérive ne peut pas être corrigée. Enregistrer les paramètres suivants, qui sont nécessaires lors de repérage et d&#39;analyse de particules: Résolution (px / um), Number of Frames, Durée. </li><li> Retirez la cellule de flux de platine du microscope et de redémarrer la pompe péristaltique continuer à cultiver le biofilm. </li></ol> 3. particules repérage et d&#39;analyse <ol><li> Obtenir les trajectoires des particules en utilisant le plug-in TrackMate dans les logiciels open source (ImageJ). Télécharger Fidji au <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Ouvrez la vidéo avec les Fidji et sous le menu Plugins, sélectionnez Suivi et TrackMate. </li><li> Vérifiez et ajustez les paramètres dans THfenêtre e suggérant réglages initiaux d&#39;étalonnage pour correspondre aux paramètres vidéo comme enregistré dans l&#39;étape 2.4. </li><li> Détecter des particules dans TrackMate utilisant ImageJ. <ol><li> Sélectionnez &#39;détecteur Log&#39;, le diamètre des particules d&#39;entrée et la valeur de seuil (par exemple 1000). Faites défiler la vidéo tout en cliquant sur le bouton Aperçu pour vérifier que les cercles pourpres suivent les particules tout au long de la vidéo. Ajustez les valeurs de diamètre et de seuil que nécessaire: augmenter la valeur de seuil si cercles pourpres apparaissent dans l&#39;espace vide. Réduire la valeur de seuil si pas assez de particules sont détectées. Cliquez sur le bouton Suivant pour terminer la détection des particules. </li><li> Cliquez sur le bouton à côté lorsqu&#39;ils sont présentés avec la possibilité d&#39;ajouter ou de retirer les particules détectées dans «seuil initial», «Choisissez une vue &#39;et&#39; sélectionner un filtre« fenêtres de continuer sans ajustement si la détection de particule initiale était satisfaisante. </li><li> Sélectionnez &#39;LAP Tracker Simple&#39; dans le optisur la barre de «Sélectionnez une méthode de suivi&quot; fenêtre particules se déplacent rarement de mise au point dans le biofilm et sont facilement suivis. Utilisez les valeurs de distance max suggéré ou faible liaison et de l&#39;écart à la clôture, et cliquez sur suivant. </li><li> Vérifiez que le suivi de particules est satisfaisante en faisant défiler la vidéo pour voir ce que les particules suivent les pistes tracées par TrackMate, et qu&#39;il n&#39;y a pas de pistes non désirées ou manquants. Passer les différentes étapes de filtrage. Aller à la dernière fenêtre «Sélectionner une action». Sélectionnez &#39;pistes Exporter vers un fichier xml&#39; du menu déroulant et cliquez sur «Exécuter». Choisissez un dossier pour enregistrer les pistes. NOTE: Il existe divers programmes disponibles dans le domaine public pour l&#39;analyse des trajectoires des particules et de l&#39;utilisation des microrhéologie. msdanalyzer et TrackArt sont des exemples de suivi des particules programmes d&#39;analyse qui fonctionnent dans l&#39;environnement Matlab. </li></ol></li><li> Préparer Matlab pour importer les trajectoires des particules dans les fichiers xml en sélectionnant dans le menu deMatlab Fichier&gt; Définir le chemin ... et ajoutez les scripts dossier disponible avec le paquet Fidji. </li><li> Pour analyser les trajectoires des particules avec msdanalyzer, le lien pour télécharger le fichier zip ou le fichier tar.gz at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Extraire le dossiermsdanalyzer 15 et déposez-le dans un dossier qui appartient à la trajectoire Matlab (par exemple C: Documents and Settings &lt;Nom d&#39;utilisateur&gt; Mes Documents Matlab). Commencez Matlab et de lancer l&#39;analyseur en tapant: MA = msdanalyzer (2, «euh», «sec») où um et sec sont les unités de temps et d&#39;espace physique dans la vidéo. <ol><li> Importez les trajectoires des particules en tapant: [pistes, MD] = importTrackMateTracks (&#39;filename.xml&#39;, &#39;CLIPZ&#39;;, &#39;Scalet&#39;) MA = ma.addAll (pistes); où «CLIPZ &#39;supprime la dimension z une vidéo 2D, et&#39; scalet &#39;. </li><li> Tracer les trajectoires ONTO graphique à l&#39;aide: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Calculer les TMS des particules à l&#39;aide: MA = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Tracer les TMS de chaque particule: figure ma.plotMSD </li><li> Combinez les trajectoires des particules d&#39;autres vidéos du même categery (par exemple des particules intégrées dans microcolonies de type sauvage au jour 3) en répétant 3.5.1.1 à 3.5.1.4). </li><li> Tracer la moyenne de l&#39;ensemble ou de la moyenne sur toutes les courbes: ma.plotMeanMSD Changez le Y et l&#39;axe x de linéaire à échelle logarithmique. Au temps de latence longs, les courbes de TMS deviennent bruyant à cause de manque de statistiques à plus longue échéance. Les courbes de TMS peuvent également augmenter fortement en raison d&#39;une erreur dynamique. Ces régions de la courbe peuvent être retirés à l&#39;aide de l&#39;outil pinceaupour sélectionner la fin de la courbe et en sélectionnant «brossage»&gt; «Retirer non gratté» dans le menu Outils. </li></ol></li><li> Télécharger EzyFit au <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> et ajoutez EzyFit à un dossier appartenant à la voie Matlab (par exemple C: Documents and Settings &lt;Nom d&#39;utilisateur&gt; Mes Documents Matlab). Installez le menu EzyFit en tapant dans Matlab espace de travail efmenu installation. Redémarrez MATLAB avec le menu EzyFit dans la fenêtre de figure. Monter les courbes MSD à la loi de puissance en sélectionnant dans le menu EzyFit &#39;Show Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; étaient n est l&#39;exposant de diffusion α estimé. REMARQUE: msdanalyzer nécessite l&#39;ajustement de courbe Toolbox dans Matlab pour le montage de courbes MSD. EzyFit est une alternative du logiciel libre et qui peut effectuer l&#39;ajustement de courbe. </li><li> Les trajectoires des particules actuelles clair et TMS pour calculer de nouvelles TMS de particules d&#39;autres endroits ou le temps: clair </li&gt; <li> Après le calcul des diverses courbes moyennes de TMS de particules dans un milieu (contrôle), et microcolonies et zones indifférenciées de diverses souches, copier et coller les courbes dans un graphique pour la comparaison. Raideur échantillon et réticulation augmentation avec des valeurs inférieures de TMS. Courbes plat inférieurs α et l&#39;échantillon est plus élastique que les courbes raides avec plus α. </li><li> Sélectionnez la courbe et cliquez sur &quot;Outils&quot; de regarder les données statistiques, telles que la médiane et la gamme. La MSD de la bille est proportionnelle à la compliance de fluage, J (t) de la matière dans laquelle est noyée la bille en fonction de la relation, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> où J = respect de fluage, d = diamètre de particule, k B = constante de Boltzman, T = température et t = temps. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Microrhéologie est un outil utile pour les mesures rhéologiques locales dans les systèmes hétérogènes, tels que les biofilms microbiens. Il est une technique non destructive, ce qui permet la surveillance en temps réel des changements rhéologiques sein d&#39;un même échantillon biologique sur plusieurs points temporels. Dans ce protocole, microrhéologie de traces de particules a été appliqué à Pel et mutants exopolysaccharide Psl afin d&#39;enquêter sur la façon dont ils affectent l&#39;élasticité et ...

La plupart des cellules bactériennes sont en mesure d&#39;employer planctoniques (sans vie) et (sessiles) modes de croissance de 1 attaché de surface. Dans le mode de croissance fixé en surface, les cellules bactériennes sécrètent et se envelopper dans de grandes quantités de substances polymériques extracellulaires (EPS) à former des biofilms. Les EPS se compose principalement de protéines, de l&#39;ADN, exopolysaccharide extracellulaire et est essentielle à la formation de biofilm 2. Il sert d&#39;échafaudage physique par lequel les bactéries peuvent utiliser pour différencier spatialement et protège les bactéries de conditions environnementales nuisibles et les réponses de l&#39;hôte. Différents composants de l&#39;EPS ont des rôles distincts dans la formation de biofilm 3 et les changements dans l&#39;expression des composants EPS peut considérablement remodeler les structures de biofilm 4. Composants EPS peuvent également fonctionner comme des molécules de signalisation 5, et des études récentes ont montré certains composants EPS qui interagissent avec des cellules microbiennes pour guider leurs diff de migration et de biofilmérentiation 6-8. La recherche sur l&#39;EPS a considérablement avancé, basé sur les analyses morphologiques des biofilms produites par mutants défectueux dans un composant spécifique des EPS 9,10. En outre, l&#39;EPS est généralement caractérisée à la macro-échelle (caractérisation vrac) 11. Morphologique analyse ne peut cependant manquer de précision quantitative et la caractérisation vrac, qui retourne des valeurs moyennes, perd le détail qui existe au sein de l&#39;hétérogénéité du biofilm. Il ya maintenant une tendance croissante à progresser à la caractérisation en temps réel des propriétés mécaniques des EPS à la micro-échelle. Ce protocole montre comment particule de suivi microrhéologie est capable de déterminer les effets spatio-temporelle des composants de la matrice et des exopolysaccharides Pel Psl sur la viscoélasticité et la réticulation efficace de biofilms de Pseudomonas aeruginosa 4. Microrhéologie passive est une rh simple et peu coûteuxméthode de eology qui fournit le plus haut débit de l&#39;échantillonnage microrhéologiques spatiale d&#39;un matériau à ce jour 12,13. Dans microrhéologie passif, des sphères de sondes sont placés dans l&#39;échantillon et leur mouvement brownien, grâce à des énergies thermiques (k B T) est suivie par microscopie vidéo. Plusieurs particules peuvent être suivis en même temps, et les coordonnées dépendantes du temps des particules suivent une marche aléatoire classique. Par conséquent, en moyenne, les particules restent à la même position. Cependant, l&#39;écart-type des déplacements ou le déplacement quadratique moyenne (MSD) des particules, est non nulle. Depuis fluides visqueux coulent, la particule MSD dans un fluide visqueux croît linéairement avec le temps. Par contre, la réticulation polymérique viscoélastique trouve dans ou substances élastiques aider à résister à l&#39;écoulement, et les particules deviennent limitées dans leur déplacement, ce qui conduit à des plateaux de la courbe MSD (figure 1A). Cette observation suit la relation MSDαt <sup&gt; α, où α est l&#39;exposant de diffusion qui est le rapport des contributions élastiques et visqueuses de la substance liée. Pour les particules se déplaçant dans des fluides visqueux a = 1, en ​​des substances viscoélastiques 0 &lt;α &lt;1, et dans des matières élastiques α = 0. Le TMS peut également être utilisée pour calculer la compliance de fluage, qui est la tendance du matériau à se déformer de manière permanente sur Estimation du temps et avec quelle facilité les écarts matériels. La chimie taille, la densité et la surface de la particule sont essentiels à l&#39;application correcte de l&#39;expérience microrhéologiques et sont choisis par rapport au système étudié (dans ce cas, les polymères de la matrice du biofilm, voir figure 1B). Tout d&#39;abord, la mesure de la rhéologie des particules de la substance avec des structures qui sont beaucoup plus petites que la particule elle-même. Si les structures de la substance sont d&#39;ampleur similaire à la particule, le mouvement de la nominaleticle est perturbé par la forme et l&#39;orientation des structures individuelles. Toutefois, si les structures environnantes de la particule sont beaucoup plus petits, cet effet est faible et moyenne, à présenter un environnement homogène à la particule (figure 1B). D&#39;autre part, la densité de la particule doit être similaire à la moyenne (1,05 g ml -1 pour les médiums à base d&#39;eau) de manière que la sédimentation est évitée et les forces d&#39;inertie sont négligeables. La plupart des particules avec treillis polystyrène répondent aux critères ci-dessus. Idéalement, la particule ne pas interagir avec les polymères de la matrice du biofilm que l&#39;interprétation rhéologique de MSD de particules est valable uniquement si le mouvement est aléatoire, entraînée par l&#39;énergie thermique et de collision avec les structures de la substance. Ceci peut être observé en vérifiant si la particule sonde tend à lier ou rebondir sur la surface d&#39;un biofilm pré-adulte. Toutefois, malgré le manque d&#39;attirance pour le biofilm, les particules doivent pouvoir être incorporés dans la matrice.De plus, l&#39;hétérogénéité physico-chimique du biofilm peut se traduire par des particules différentes étant mieux adaptée en tant que sondes dans les différentes régions du biofilm. Ainsi, des particules de différentes tailles et la chimie de surface devraient être appliqués au biofilm. En tant que tel, le MSD particule est en mesure de fournir des informations utiles sur la façon dont différents composants contribuent à la rhéologie et la propagation du biofilm. En outre, l&#39;utilisation de différentes sondes permet d&#39;obtenir des informations sur l&#39;hétérogénéité spatiale physico-chimique du biofilm. Ce procédé peut être utilisé pour tester l&#39;effet d&#39;un traitement antimicrobien sur les propriétés mécaniques du biofilm, ou appliqué sur les biofilms d&#39;espèces mélangées pour étudier la façon dont les propriétés mécaniques du film biologique sont modifiés à partir de l&#39;introduction d&#39;une autre espèce. Particules TMS peut aussi être utile pour la caractérisation de la dispersion du biofilm. Ces études seraient utiles dans notre compréhension des biofilms, potentiellement améliorer les traitements des biofilms une génie des biofilms pour des activités utiles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-8821</td>
			<td>1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07523-80</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Chambers</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear polypropylene plastic connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06365-83</td>
			<td>1/16 in. (1.588 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder Clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To clamp tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482;</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L Storage/Media Bottles</td>
			<td>VWR&#174;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolley</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hold biofilm setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Les propriétés viscoélastiques locaux du biofilm dans différentes régions du biofilm, qui comprenait les vides (moyennes au-dessus du biofilm), des plaines (couche de cellules indifférenciées plat) et microcolonies (voir les étiquettes de la figure 2A) ont été étudiés. Les changements temporels de propriétés viscoélastiques de la maturation du biofilm pendant 3 jours à 5 ont également été déterminés. La MSD des particules dans les vides a été utilisé comme témoi...

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In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

9.6K vues.  Nanyang Technological University. Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparamétrique cartographie optique du Cœur lapin perfusé de Langendorff

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Recherche

Bio-ingénierie

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

Déclenchement à distance magnétique de sondes micrométriques pour<em&gt; In situ</em&gt; Cartographie 3D de biofilms bactériens Propriétés physiques

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Étude de la séparation d’écoulement tridimensionnelle induite par un polype de pli vocal modèle

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Un système de test en flexion millimètre pour mesurer les propriétés mécaniques des Spicules d’éponges marines

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...