The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.

1. Préparation de la verrerie et des cultures <ol><li> Avant de procéder à cette expérience, préparer la gélose au sang de mouton à 5% (SBA) des plaques pour la culture SARM. Incuber les plaques SBA pendant 24 heures à 37 ° C. Après ce temps, simples, des colonies bien isolées doivent être présents à être utilisé pour des inoculations ultérieures dans des milieux liquides. Magasin strié plaques SBA avec des colonies isolées à 4 ° C pendant 1 à 2 mois. REMARQUE: Les plaques de gélose au sang de mouton viennent dans les paquets déjà créés contenant entre 20 à 25 plaques sur la base du fabricant, et sont généralement constitués d&#39;une base de gélose trypticase soja avec addition de 5% en poids / sang de v moutons. </li><li> Ajouter 500 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) supplémenté avec 1% de glucose et 0,1% de NaCl. Après cela, collecter et nettoyer deux tubes à essai en verre. Si couvercles autoclavables sont pas disponibles pour des tubes à essai, utiliser du papier d&#39;aluminium comme un bouchon. Autoclave TSB et des tubes à essai avec une boîte de 1 ml embouts de pipette. </li><li> Sous une enceinte de biosécurité ou près d&#39;une Bunsen brûleur, pipette 5 ml de TSB préalablement autoclave dans des éprouvettes autoclave. Soyez attentif à ce que suffisamment de temps a été donné de laisser le BST et des tubes à essai refroidir à température ambiante. De 5% précédemment plaque SBA strié, inoculer une seule colonie dans 6 ml de bouillon TSB. L&#39;une contiendra SARM, et le second tube de test sera utilisé comme contrôle négatif pour assurer la stérilité. </li><li> Prenez des tubes à essai du BST inoculés et les placer dans un incubateur réciproque pendant 24 heures à 37 ° C et à 200 tpm. Après cette période, la croissance microbienne doit être apparent dans le tube à essai de SARM alors qu&#39;aucune croissance doit avoir eu lieu dans l&#39;éprouvette de contrôle. </li><li> Prélever 1 ml de culture de 24 h à la pipette dans 6 ml de TSB frais. Incuber à 37 ° C pendant 6 heures à 200 tours par minute. </li><li> Pipette 1 ml de sous-culture 6 h dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger 3 min à 850 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml d&#39;H 2 O. désionisée Centrifugeuse, répéter, et remettre en suspension. </li></ol><ol><li> Prendre en acier inoxydable et les disques de l&#39;échantillon de l&#39;AFM d&#39;or (20 mm et 10 mm de diamètre, respectivement) et de nettoyer chaque côté avec 5 ml d&#39;eau désionisée 2 O. Tenez disques échantillons dans la main dominante avec une pince et utiliser la main sous-dominante à la pipette 5 ml de chaque côté de l&#39;échantillon disque. Après avoir lavé deux côtés, disques lieu de l&#39;échantillon dans un bêcher contenant 20 ml de H 2 O déminéralisée suivie par sonication pendant 1 min. </li><li> Après l&#39;utilisation des ultrasons pince pour retirer les disques de l&#39;échantillon du bécher. Placez les disques afin qu&#39;ils se penchent à un angle de 60 ° contre le bord d&#39;une boîte de Petri ouverte sur une serviette en papier. Utiliser le couvercle de la boîte de Petri pour couvrir les disques de séchage. Laissez sécher complètement avant disques procédure. Le temps de séchage peut varier entre 4-8 heures. </li><li> Une fois sec, utilisez une pince pour placer disques d&#39;échantillons dans une boîte de Petri. <ol><li> Eventuellement, fonctionnaliser les surfaces de disques de l&#39;échantillon de toutes matières (par exemple, le collagène, l&#39;acide hyaluronique, des nano-particules d&#39;argent, etc.). </li><li> Pour cette expérience, on utilise la poly-L-lysine pour revêtir la surface du substrat. Pour la poly-L-lysine fonctionnalisation, une pipette de 200 à 400 ul de 0,1% de poly-L-lysine (en H 2 O) sur des disques de l&#39;échantillon, et laisser incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une boîte de Pétri. </li><li> Après 1 heure, utiliser une pince pour maintenir l&#39;échantillon disque, et laver avec 1 ml de H 2 O. déminéralisée Laisser sécher sur du papier absorbant comme décrit dans l&#39;étape 2.2. </li></ol></li><li> Prenez 2x cellules remises en suspension lavés et plaque de 200 à 400 pi sur des disques d&#39;échantillons dans une enceinte de sécurité biologique. Si les disques d&#39;échantillons sont revêtus de poly-L-lysine, incuber pendant 0,5 heures à température ambiante. </li><li> Après incubation de cellules sur les disques de l&#39;échantillon, laver disques échantillons doucement avec 1 ml de H 2 O. déminéralisée Laissez sécher une nuit avant de disques imagerie. </li></ol> 3. KPFM Imaging NOTE: Pour cette expérience,utiliser une série Agilent 5500 ILM-AFM. <ol><li> Pour commencer AFM, tourner sur l&#39;unité de l&#39;ordinateur avec le contrôleur HEB et MAC III de l&#39;AFM. Logiciel d&#39;imagerie Open AFM (par exemple, d&#39;Agilent PicoView). Veillez à sélectionner d&#39;abord ACAFM ou selon la désignation correcte est sur l&#39;AFM pour l&#39;imagerie en mode intermittent-contact. </li><li> En utilisant des pinces de l&#39;AFM dans la main dominante, et en maintenant le support du clip à ressort ouverte avec la main sous-dominante, placez un cantilever KPFM dans la pièce de tête. Soyez prudent lors de la manipulation et le transfert de la pièce de tête AFM à l&#39;AFM que cet appareil (au moins sur le 5500 ILM-AFM) contient l&#39;unité de cristal piézo fragile qui contrôle X, Y et directionnalités de numérisation Z. REMARQUE: Les cantilevers KPFM utilisés dans ce cas étaient Mikromasch conducteur DPE (à faible bruit) avec cantilevers fréquences de résonance moyenne de 80 kHz et de printemps constantes de 2,7 N / m. Cantilevers avec ces fréquences de résonance et les constantes de printemps ont été choisis en raison de leur facilité d&#39;utilisation.Cantilevers ayant des constantes de ressort et de plus grandes fréquences de résonance plus élevées peuvent également être utilisés pour l&#39;imagerie. </li><li> Charger soigneusement pièce de tête dans le AFM et brancher les fils appropriés (dans ce cas deux fils doivent être branché: la lumière laser et moteur de levage de la scène). </li><li> Aligner le laser sur la pointe du cantilever. Certaines unités contiennent une fonctionnalité de la caméra qui permet un alignement plus facile. Si la fonctionnalité de la caméra ne est pas présent sur l&#39;AFM, alignez sur la pointe cantilever comme décrit suivante: <ol><li> Tourner le bouton dans le sens horaire avant-arrière pour déplacer le laser overtop la puce en porte à faux. Lorsque le laser atteint la puce il sera bloqué et ne sera plus visible. Seulement tournez le bouton à quelques reprises. </li><li> Tournez le bouton avant-sens inverse des aiguilles jusqu&#39;à ce que le spot laser réapparaît. Le laser est maintenant au bord de la puce. </li><li> Tournez le bouton de gauche à droite pour positionner le laser sur le cantilever. Comme le laser passe au-dessus du cantilever il va disparaître et réapparaître in succession rapide. Le spot laser doit être visible dans le couvercle en verre dépoli, où l&#39;unité de photodiode tard asseoir. </li><li> Tournez le bouton avant vers l&#39;arrière vers la gauche pour déplacer le point en bas de la console vers la pointe jusqu&#39;à ce que la tache sur le verre dépoli disparaît. </li><li> Tourner l&#39;avant-à-dos dans le sens horaire que légèrement afin de positionner le laser de sorte qu&#39;il se trouve juste sur la pointe cantilever. Le spot laser réapparaîtra sur le verre dépoli. NOTE: Ce est la méthode de positionnement laser pour la plongée-pension cantilevers. Pour contreforts triangulaires, le processus d&#39;alignement diffère légèrement. </li></ol></li><li> Une fois que le laser est aligné, maintenez le moteur de levage d&#39;étape dans la position &quot;ouverte&quot; pendant 10 secondes afin d&#39;assurer suffisamment d&#39;espace entre le cantilever et de l&#39;échantillon lors de la fixation de l&#39;échantillon à l&#39;AFM. </li><li> Placez l&#39;échantillon sur la scène de l&#39;échantillon de KPFM. Rez de l&#39;échantillon en utilisant un fil de cuivre. Connecter les fils appropriés de l&#39;AFM à l&#39;étape de l&#39;échantillon. Connectez les sTage à l&#39;AFM. Dans la plupart des cas, la scène est maintenu en place grâce à des aimants. </li><li> Dans le logiciel de l&#39;AFM, syntonisez commencer le cantilever puis approche de la pointe cantilever à l&#39;échantillon. Assurez-vous que le temps de stabilisation est fixé à plus de 10 ms, et que les vitesses d&#39;approche ne dépasse pas 2,0 um / sec afin d&#39;éviter des dommages de pointe. </li><li> Une fois que l&#39;extrémité en porte à faux se trouve sur la surface de l&#39;échantillon, sélectionner une taille de la fenêtre de formation d&#39;image et la zone de formation d&#39;image idéale. Optimiser les gains I et P ainsi que le point de sorte que l&#39;imagerie topographique est optimisée de jeu en porte à faux. <ol><li> Une fois l&#39;imagerie topographique est optimisée, tourner sur le module KPFM (FM ou AM, ici, utiliser le mode FM). Il convient de noter que l&#39;imagerie KPFM est très difficile à l&#39;extérieur de 5 um fenêtre d&#39;imagerie x 5 pm. Aussi, pour l&#39;imagerie de KPFM optimale, utilisez une résolution 512 x 512 avec des vitesses de balayage lent (de 0,02 à 0,05 de lignes / sec). </li></ol></li><li> Pour les réglages FM-KPFM (non ACAFM paramètres), réglez le pour cent d&#39;entraînement entre 5 à 10%. Réglez le cantilever frequency comprise entre 1 - 5 kHz avec une largeur de bande de 2 kHz. Réglez I et P gains pour les réglages FM-KPFM à 0,3%. <ol><li> Variez la bande passante du signal et I et P gains entre les surfaces de l&#39;échantillon. Pour optimiser l&#39;imagerie de SP, ajuster encore la bande passante du signal et I et P gains pour obtenir des images optimales. La plage recommandée des gains I et P sont de 0,22 à 0,35%. </li></ol></li><li> Traiter et analyser les images recueillies KPFM aide d&#39;un logiciel de traitement post-image pour recueillir des données de SP. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

KPFM a été utilisé comme une nouvelle technique pour obtenir des données électriques de surface. Il a souvent été utilisé comme une méthode pour examiner la répartition de charge en chimie et n&#39;a que récemment commencé à appliquer pour l&#39;étude des systèmes biologiques sur le micro et nano-échelles. D&#39;après les données recueillies nous avons constaté que les microbes ne semblent pas attacher facilement pour nettoyer les surfaces en acier inoxydable et or, même après 3 heures d&#39;incubat...

Les biofilms produites sur les surfaces de l&#39;équipement et dans les plaies cutanées présentent un problème pour l&#39;industrie médicale que les biofilms sont récalcitrantes à l&#39;enlèvement et peuvent conduire à une augmentation des taux de transmission de la maladie et de la résistance aux antimicrobiens. L&#39;attachement est la première étape dans la formation de biofilm et est l&#39;étape la plus critique en raison de sa réversibilité 3.1. caractéristiques de la surface du substrat jouent un rôle crucial sur l&#39;attachement microbienne. On a montré que des facteurs tels que la dureté de surface, porosité, rugosité, et pour effectuer la fixation hydrophobicité microbienne; Cependant, peu d&#39;études sur le rôle de potentiel de surface de substrat (SP) sur l&#39;adhérence microbienne a été fait 4,5. Les surfaces chargées négativement empêcher la fixation de spores de Bacillus thuringiensis à mica, du silicium, de l&#39;or et 6. Les changements dans le potentiel de membrane cellulaire indiquent des changements dans l&#39;attachement et la motilité cellulaire 5,7. Il a été observé que hom électriquementsurfaces ogeneous plus facilement promouvoir microbienne adhérence 5. Caractérisation du potentiel de surface des bactéries à l&#39;échelle nanométrique peut fournir une nouvelle façon de comprendre la cinétique d&#39;adhérence des bactéries à diverses surfaces, et peut ainsi aider à l&#39;élaboration de stratégies anti-encrassement biologique. Contrairement à d&#39;autres méthodes utilisées pour caractériser les cinétiques électro de bactéries, telles que la diffusion électrophorétique de lumière, le potentiel zêta, et isoélectrique détermination du point, Kelvin microscopie à force de la sonde (KPFM) permet l&#39;examen de cellules individuelles au lieu de cultures entières 8-11. Cela est bénéfique quand on veut comparer cellule-cellule ou biofilm caractéristiques électriques avec une grande précision et de précision. KPFM est un module de microscopie à force atomique (AFM). AFM a été développé comme une conséquence directe de la microscope à effet tunnel (STM) 12. Les premières images publiées en utilisant STM ont été faites par Gerd Binnig et Heinrich Rorhrer en 1982 12 </sup&gt;. Leur invention a pu résoudre structures atomiques par balayage tramé une pointe conductrice forte sur une surface conductrice dans l&#39;air. Les implications de la réalisation des images haute résolution des biologistes qui ont rapidement tenté d&#39;utiliser STM images échantillons séchés de l&#39;ADN, des protéines et des virus 12 excité. STM peut aussi être fait dans les liquides à l&#39;aide de pointes de sonde spécialisés 13. Ceci a été démontré par Lindsay et al., Qui a utilisé STM et AFM de molécules d&#39;ADN d&#39;image dans HClO 4 mM et 10 dans l&#39;eau, sur des électrodes en or 13. KPFM a été démontrée pour déterminer les potentiels de surface des ADN et des protéines et analyse des biomolécules 25 interaction avec des ligands 26. KPFM fonctionne en mesurant la différence de potentiel de contact (CPD) entre une pointe d&#39;AFM cantilever conducteur et un échantillon idéalement conductrice (Figure 1, i) 14,15. Les échantillons ne doivent pas nécessairement être conducteur (ce est-sampl biologiques). L&#39;imagerie peut être effectuée sur le mica, le verre, et des surfaces de silicium (non conductrices) aussi longtemps que la surface non-conductrice est mince et il ya une matière conductrice sous-jacente 6,7. Le DPC est équivalente à la tension potentiel de surface et peut être décrit comme la différence dans les fonctions de travail entre la pointe (pointe de φ) et l&#39;échantillon (échantillon de φ), divisé par la charge de l&#39;électron négatif (- e). Quand une pointe AFM conducteur est amené à proximité d&#39;une surface de l&#39;échantillon (séparés par la distance d), une force électrostatique (F ES) est généré en raison de la différence des énergies de Fermi (figure 1, II, a) 15. À ce stade, les énergies à vide de la pointe et l&#39;échantillon (E v) sont en équilibre et alignés. Sur la pointe apportant plus près de la surface de l&#39;échantillon, la surface de la pointe et l&#39;échantillon entrent en contact électrique et d&#39;agir comme des condensateurs de plaques parallèles (Figure 1, ii, b </strong&gt;) 14,15. Au point, les énergies de Fermi de la surface de la pointe et l&#39;échantillon se alignent, atteignant un équilibre stationnaire (Figure 1, ii, b). La surface de la pointe et l&#39;échantillon sera prélevé et un DPC de V se former à cause d&#39;une différence de E fonctions de v et de travail. Un actes F es sur la zone de contact électrique en raison de la CPD formé de V. Cette force est ensuite annulé par l&#39;application d&#39;un courant continu V externe à l&#39;extrémité qui a la même grandeur que le CPD formé de V (figure 1, ii, c). Cette tension appliquée DC élimine charge de surface dans la zone de contact électrique, et la quantité de V DC nécessaire pour éliminer les es F de V CPD est égal à la différence dans les fonctions de travail entre le SAsurface de mple les pourboires 15. Il convient de noter que la fonction de travail de la pointe est connu et il est fourni par les fabricants. Dans toutes les méthodes de KPFM, une tension alternative (V AC, environ 100 à 500 mV) est également appliqué à la pointe afin de générer des forces électriques oscillants entre la pointe et l&#39;échantillon 14. Cette offre une meilleure résolution lors de la mesure des changements dans V CPD et / ou F es. À cet égard, les changements dans la fréquence ou l&#39;amplitude de l&#39;oscillation électrique peuvent être corrigées par V DC, et la surface cartes de potentiel peuvent être générés. Les données provenant des domaines spécifiques de ces cartes peuvent être analysés plus de fournir des informations sur les caractéristiques topographiques électriques spécifiques. KPFM peut fonctionner en trois modes: (1) Mode de levage, (2) le mode de modulation d&#39;amplitude (AM), et (3) la modulation de fréquence (FM) en mode 14,16. mode Ascenseur était la première incarnation de KPFM. Ascenseur mode se appuie sur une méthode en deux passes dans lequel une pointe oscille est traîné à travers la surface pour obtenir une image topographique. Pour la deuxième passe de la pointe est soulevé une distance préréglée dessus de l&#39;échantillon (de 10 à 100 nm) et numérisé en arrière à travers la même zone. En raison de ce procédé en deux passes, en mode de levage, et par rapport à AM- FM-KPFM, prend le plus long temps d&#39;acquisition d&#39;images. Augmenter la pointe loin de la surface assure que seul longue portée F es est mesurée. En outre, la diaphonie entre la topographie de surface et des mesures de potentiel est découplée au détriment de la résolution latérale et une sensibilité accrues. AM-KPFM améliore la résolution et la sensibilité latérale en utilisant deux fréquences pour mesurer simultanément la topographie de l&#39;échantillon et le potentiel de surface (de balayage en un seul passage) 14. Dans le mode AM, le cantilever est mécaniquement oscille, généralement 5% en dessous de la première fréquence de résonance (f 0), et oscille électriquement (trâce un AC V) à sa deuxième fréquence de résonance (f 1). Changements dans l&#39;amplitude de f 0 conduisent à la production de données topographiques, tandis que les changements dans l&#39;amplitude de f 1, en ​​raison de changements dans es F et V CPD, donnent données de mesure potentiels de surface. f 0 et f 1 du cantilever sont séparés par des fréquences importantes et les énergies qui signalent diaphonie est réduite au minimum 14. Le boîtier électronique de la tête (HEB) de l&#39;AFM sépare les deux signaux pour donner à la fois topographique et données de surface potentiels simultanément dans une analyse. FM-KPFM améliore la résolution encore plus loin que AM-KPFM sur des surfaces biologiques 14. FM-KPFM fonctionne différemment que AM-KPFM en ce qu&#39;elle mesure les changements dans les gradients de force électrostatiques plutôt que force électrostatique (F ES) 15. Comme mode AM, le mode FM utilise deux fréquences et un singlmécanisme de balayage e-passe d&#39;obtenir des données topographiques et la surface potentiels simultanément 14. En mode FM, le cantilever est mécaniquement oscillait à f 0 et oscillait électriquement à une basse fréquence modifiée (f mod, généralement 1-5 kHz). Sur interactions électrostatiques, f 0 et f mod mix pour produire des bandes latérales f 0 ± f mod. Ces bandes latérales sont très sensibles aux variations de la force électrostatique, et peuvent être séparées de f 0 par l&#39;intermédiaire du HEB de l&#39;AFM. Depuis FM-KPFM mesure les changements dans les gradients de force électrostatiques, la forme sommet de conseils et de son entretien / l&#39;intégrité jouent un rôle critique dans l&#39;ensemble surface de résolution potentielle 14, 15. Surface résolution potentielle en utilisant les modes AM et FM sont de l&#39;ordre de 1 nm latéralement 14 -16. Il convient de noter que l&#39;imagerie KPFM peut être fait dans les liquides non polaires, et plus récemment, a été montré à faire (&lt;10 mm) des liquides polaires faiblement ionique (enKPFM modes en boucle ouverte qui ne nécessitent pas une rétroaction de polarisation, ce qui évite l&#39;application d&#39;une polarisation en courant continu), comme l&#39;eau MilliQ; Toutefois, l&#39;imagerie KPFM n&#39;a pas encore été fait sur ​​des cellules vivantes dans des solutions polaires 17-20. Défis supplémentaires associés à l&#39;imagerie de SP dans un liquide est que les solutions couramment utilisés pour les cellules de maintien (ce est à dire, le tampon phosphate salin) ont des concentrations élevées d&#39;ions mobiles, ce qui conduirait à des réactions de Faraday, la dynamique de la charge induite préjugés, et la diffusion d&#39;ions / redistribution 20. Ainsi, pour cette expérience, des mesures ont été prises à partir de cellules de SARM secs et morts sur acier inoxydable et or surfaces fonctionnalisés poly-L-lysine dans des conditions ambiantes. L&#39;imagerie peut être effectuée dans des conditions atmosphériques ou sous vide sur des échantillons biologiques qui ont été préalablement séchés ou immobilisées sur des surfaces 20. Conditions humides ont également été démontré que l&#39;incidence imagerie KPFM des surfaces 6. Dans cette étude, nous avons utilisé FM-KPFMAFM et d&#39;examiner le rôle de la SP sur la fixation du Staphylococcus aureus résistant à la méticilline USA100 (SARM) les surfaces en acier inoxydable et or fonctionnalisés poly-L-lysine. SARM a récemment valu le statut de multi-résistante (MDR) &quot;superbactérie&quot; en raison de sa résistance naturelle sélectionnée à de nombreux antibiotiques β-lactamines et les céphalosporines 21. Les infections à SARM sont maintenant plus difficile, difficile, et formidable pour traiter, conduisant à l&#39;utilisation des antimicrobiens plus sévères tels que la vancomycine ou oxazolidinones qui ont des niveaux plus élevés de toxicité chez l&#39;homme, et donc ne peut pas être utilisé comme traitements à long terme 22. L&#39;acier inoxydable a été choisi en raison de sa pertinence médicale et l&#39;utilisation commune comme matière dans les aiguilles hypodermiques, les bassines, les poignées de porte, des éviers, etc. L&#39;or a été utilisé comme un métal comparative. FM-KPFM a été utilisé pour examiner si microbienne SP de la membrane change lors de la fixation des substrats.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5500ILM Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9435S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AFM/STM Metal Specimen Discs</td>
			<td style="width:71px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:119px;">#16219</td>
			<td>Stainless steel sample discs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes</td>
			<td style="width:71px;">Mikromasch</td>
			<td style="width:119px;">#HQ:DPE-XSC11</td>
			<td>There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.&#160; We utilized cantilever B for experiments.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs</td>
			<td style="width:71px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:119px;">#16218-G</td>
			<td>Gold sample discs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PicoView Software</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9797B</td>
			<td>5500ILM Atomic Force Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pico Image Software (Pico Image Basic)</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9797AU-1FP</td>
			<td>5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#91201513</td>
			<td>Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#221261</td>
			<td>Pre-made plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#257107</td>
			<td>Comes as a dry powder.&#160; Instruction on how to make come on the container.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface potential measurement of bacteria using kelvin probe force microscopy

potentiel de surface est une caractéristique physique souvent négligé qui joue un rôle dominant dans l&#39;adhérence des micro-organismes à des surfaces de substrat. Kelvin microscopie à force de sonde (KPFM) est un module de microscopie à force atomique (AFM) qui permet de mesurer la différence de potentiel de contact entre les surfaces à l&#39;échelle nanométrique. La combinaison de KPFM avec AFM permet la génération simultanée de potentiel de surface et des cartes topographiques d&#39;échantillons biologiques telles que des cellules bactériennes. Ici, nous employons KPFM pour examiner les effets de potentiel de surface sur l&#39;adhésion microbienne des surfaces médicalement pertinents, tels que l&#39;acier inoxydable et or. Surface cartes potentiels ont révélé des différences de potentiel de surface pour les membranes microbiennes sur des substrats différents matériels. Un graphe étape hauteur a été généré pour montrer la différence de potentiel de surface à une zone frontière entre la surface du substrat et des micro-organismes. Les variations de potentiel de surface de la membrane cellulaire ont été liés au changements dans le métabolisme cellulaire et la motilité. Par conséquent, KPFM représente un outil puissant qui peut être utilisé pour examiner les changements de potentiel de surface de la membrane microbienne sur l&#39;adhérence à diverses surfaces de substrat. Dans cette étude, nous démontrons la procédure pour caractériser le potentiel de surface des cellules individuelles de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline USA100 sur l&#39;acier inoxydable et l&#39;or en utilisant KPFM.

La capacité de mesurer SP utilisant KPFM repose sur le principe que tant la surface de l&#39;échantillon et la pointe de cantilever sont conducteurs dans une certaine mesure. Acier inoxydable et or ont agi comme des surfaces conductrices à laquelle SARM étaient attachés. KPFM images ont été prises de 15 cellules de SARM sur les deux faces avec 512 x 512 résolutions, et des zones de numérisation allant de 5 x 5 um à 10 um x 10. Balayage a été réalisé avec des vitesses de ligne allant de 0,02 lignes / s à 0...

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Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.6K vues.  University of Guelph. Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces. 

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Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. For example, they play an important role in directing cell migration during wound healing. Here we describe the manufacture and use of ultrasensitive vibrating probes for measuring extracellular electric currents. The probe is an insulated, sharpened metal wire with a small platinum-black tip (30-35 &mu;m), which can detect ionic currents in the &mu;A/cm2 range in physiological saline. The probe is vibrated at about 200 Hz by a piezoelectric bender. In the presence of an ionic current, the probe detects a voltage difference between the extremes of its movement. A lock-in amplifier filters out extraneous noise by locking on to the probe's frequency of vibration. Data are recorded onto computer. The probe is calibrated at the start and end of experiments in appropriate saline, using a chamber which applies a current of exactly 1.5 &mu;A/cm2. We describe how to make the probes, set up the system and calibrate. We also demonstrate the technique of cornea measurement, and show some representative results from different specimens (cornea, skin, brain).

The manufacture, calibration and use of non-invasive vibrating probes to measure bioelectric current in various biological systems is described.

Mesure du courant bioélectrique avec une sonde vibrante

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Mesure de la cohésion globale par tensiométrie surface du tissu

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...