Ce travail a été soutenu par le NIH R21 CA143505 à Christina Voelkel-Johnson.

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinés et approuvés par la institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux Comité à l&#39;Université médicale de Caroline du Sud. Le protocole a été approuvé en vertu de l&#39;USDA catégorie D pour la douleur. Une. Cellule Implantation <ol><li> Deux jours avant d&#39;effectuer la procédure, la plaque 1 x 10 6 cellules MB49 en flacons T-25. Utilisation du DMEM élevé en glucose supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques (si on le souhaite). Un ballon est suffisante pour chacun des groupes de cinq souris à qui sera anesthésié et implanté en parallèle. </li><li> Le jour de l&#39;intervention, pour préparer la trypsine instillation en diluant stérile à 0,25% de la culture tissulaire de qualité de la trypsine à 0,125% avec un milieu de base DMEM stérile (dilution 1:2). 1,2 ml suffit pour 10 souris. Placer dans un bain-marie à 37 ° C à l&#39;équilibre. </li><li> Préchauffer un coussin chauffant et le positionner sous les pointes coniques du système d&#39;anesthésie qui seront utilisés pour fournir isoflurane. Placer un tampon absorbant propre sur le coussin chauffant. </li><li> Placez la souris dans la chambre de l&#39;induction du système d&#39;anesthésie et induire une anesthésie avec 3% d&#39;isoflurane. Lorsque les souris ont perdu connaissance, ce qui est vérifié par la perte du réflexe orteil-pincement, les transférer aux coiffes. Assurez-vous que chaque animal est en décubitus dorsal et correctement placé sur le bloc de chauffage pour maintenir la température du corps. </li><li> Réduire la concentration d&#39;isoflurane à 2% pour maintenir l&#39;anesthésie. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique à deux yeux pour éviter le dessèchement. </li><li> Étape facultative: Enlever les poils abdominale. Cheveux sur le bas de l&#39;abdomen doit être retiré si vivo bioluminescence imagerie sera effectué. <ol><li> Appliquer une généreuse couche de crème dépilatoire, comme Veet, au plus bas dans 1 carré de fourrure sur le ventre, en prenant soin de ne pas communiquer avec les organes génitaux externes. Attendre 3 min. </li><li> Enlever les poils en frottant la surface avec une éponge sèche, et ensuite utiliser une éponge humide pour nettoyer la peau. Répéter une fois, si nécessaire. </li></ol></li><li> Cathétériser la vessie <ol><li> Lubrifier une nouvelle stérile 24 G cathéter veineux, pédiatrique avec un gel lubrifiant non irritant tel que KY. Retirez et jetez l&#39;aiguille. En cas de fuite de liquide autour du cathéter est un problème commun, c&#39;est à dire. il se produit plus souvent que dans l&#39;un des dix souris, des cathéters plus larges de l&#39;alésage (20 g) peuvent être utilisées. Cela peut être une considération importante chez les souris âgées de 8 semaines. </li><li> Tenir le moyeu du cathéter, utiliser le pouce et l&#39;index de votre main opposée à répartir les pattes postérieures de la souris et exposer le méat urétral. Insérez délicatement le cathéter dans l&#39;urètre à un angle de 45 °, de changer l&#39;angle de l&#39;un parallèle avec le banc d&#39;insérer pleinement. </li><li> Après insertion complète, soulevez délicatement le cathéter, gardant parallèle au banc, et vérifier visuellement qu&#39;il est placé dans l&#39;urètre et non le vagin, ce qui est en dessous. Si elle est correctement placé, le cathéter pourra être enentièrement insérée depuis le vagin est plus courte que l&#39;urètre. </li><li> Réduire la concentration de l&#39;isoflurane à 1%. </li></ol></li><li> Fixer un embout à une pipette P200 et enlever l&#39;urine de la vessie en appliquant une aspiration à l&#39;extrémité externe du cathéter. Retirer l&#39;urine restant dans le moyeu du cathéter. Jeter l&#39;urine et laisser le cathéter en place. </li><li> Pipeter avec soin 80 ul de solution de trypsine à 0,125% dans le moyeu du cathéter, en évitant les bulles d&#39;air. Attacher une seringue remplie d&#39;air 1 ml de l&#39;embout de cathéter et enfoncer lentement le piston de 0,1 au 0,2 ml de livrer la trypsine dans la vessie. </li><li> Laissez la seringue et l&#39;assemblage de cathéter en place pendant 15 min. Répéter les étapes 1.8 à 1.11 pour l&#39;un des souris anesthésiées restants (jusqu&#39;à quatre). Passez à l&#39;étape suivante au cours de la période d&#39;attente. ASTUCE: Initialement, il peut être utile d&#39;avoir quelqu&#39;un d&#39;autre à préparer les cellules (étape 1.12). </li><li> Préparer des cellules pour implantation MB49. Les cellules ont été étalées à 1 x 10 6 par T-25 ballon 48 heures avant l&#39;implantation (étape 1.1). <ol><li> Retirez le support et ajouter 500 ul de trypsine à 0,25% dans le ballon. Lorsque les cellules se détachent ajouter 5 ml de DMEM complet à remettre les cellules. Supprimer une aliquote de 50 ul à compter, et centrifuger le reste à 1000 rpm pendant 5 min. Au cours de l&#39;étape de centrifugation à continuer les étapes 1.12.2 et 1.12.3. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Calculer les cellules / ml. Ensuite, on calcule le volume nécessaire pour amener le culot de cellules à 4 x 10 6 cellules / ml (2 x 10 5 cellules par 50 pi). </li><li> Décanter le surnageant de cellules centrifugées et remettre en suspension le culot dans du milieu de base DMEM en utilisant le volume nécessaire de suspendre les cellules à 4 x 10 6 cellules / ml (tel que calculé à l&#39;étape 1.12.2). Maintenir les cellules à température ambiante. </li></ol></li><li> Lorsque le point de temps de 15 min pour le traitement à la trypsine des vessies est atteinte, retirer la seringue remplie d&#39;air à partir du cathéter en laissant le cathéter en place. Trypsine passé sera normalement refluer à travers le cathéter. Retirez toute la trypsine restant de la vessie par aspiration avec la pipette P200 comme dans l&#39;étape 1.9 ci-dessus et le jeter. </li><li> Pipeter immédiatement 50 pi de suspension cellulaire MB49 dans le moyeu du cathéter. Fixer la seringue de 1 ml rempli d&#39;air sur le moyeu du cathéter et délivrer les cellules de la vessie en appuyant doucement sur le piston de 0,1 à 0,2 ml. Répéter cette étape jusqu&#39;à quatre fois supplémentaires pour implanter l&#39;ensemble des cinq souris. Jeter les cellules inutilisées. </li><li> Sortant de l&#39;ensemble cathéter-seringue en place, permettent aux cellules de demeurer dans la vessie pendant 50 min. </li><li> Retirer délicatement le cathéter seringue de l&#39;urètre. Tournez la concentration de l&#39;isoflurane à zéro et déplacer chaque souris d&#39;un pouce ou deux de la coiffe de récupérer sur le coussin chauffant. </li><li> Quand une souris a retrouvé son réflexe de redressement, retourner dans sa cage. </li></ol> 2. Livraison intravésicale d&#39;adénovirus (8 jours après l&#39;implantation de cellules) </p&gt; ATTENTION: Cette partie du protocole utilise adénovirus, qui est un agent infectieux et doit être manipulé conformément aux directives BSL2 strictes (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/). Toutes les procédures effectuées par des agents infectieux ont été approuvés par le comité institutionnel de biosécurité de l&#39;Université médicale de Caroline du Sud. <ol><li> Huit jours après l&#39;implantation des souris avec des cellules MB49, vérifiez hématurie. Ramassez les animaux individuels sur un morceau de papier blanc absorbant et appuyez doucement sur l&#39;abdomen pour effacer gouttes d&#39;urine sur le papier. Urine qui est rose à rouge indique une hématurie et est un signe que les tumeurs ont établi. taux d&#39;utilisation de la tumeur est d&#39;au moins 80% et avec une excellente technique peut être aussi élevé que 100%. </li><li> Décongeler actions adénoviral sur la glace et diluer à 10 9 PFU/50 pi (2 x 10 10 PFU / ml) dans stérile, la température ambiante PBS. </li><li> Anesthésier les souris comme décrit dans les étapes 1.3 à 1.6 ci-dessus. </li><li> Sonder les souris comme décrit dans les étapes 1,8 et enlever l&#39;urine comme dans l&#39;étape 1.9 </li><li> Après urine est enlevé, pipeter immédiatement 50 pi de suspension de virus dans le moyeu du cathéter. Fixer la seringue de 1 ml rempli d&#39;air sur le moyeu du cathéter et de fournir le virus de la vessie en appuyant doucement sur le piston de 0,1 à 0,2 ml. </li><li> Sortant de l&#39;ensemble cathéter-seringue en place, permet le virus de demeurer dans la vessie pendant 40 min. </li><li> Retirer délicatement le cathéter seringue de l&#39;urètre, et jeter dans une solution d&#39;eau de Javel à 10% pour inactiver tout virus restant. </li><li> Tournez la concentration de l&#39;isoflurane à zéro et déplacer chaque souris d&#39;un pouce ou deux de la coiffe de récupérer sur le coussin chauffant. </li><li> Quand une souris a retrouvé son réflexe de redressement, retourner dans sa cage. </li><li> Marquer les cages pour indiquer que les souris ont été inculqué par l&#39;adénovirus. Virus sera versé dans la litière de la cage pendant plusieurs jours et toutes les cages et de la literie doit êtremanipulés et désinfectés de façon appropriée. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La principale méthode décrite dans ce protocole est cathétérisme de vessies de souris, qui a de larges applications pour instillation de cellules ou un agent destiné à la distribution locale de l&#39;épithélium de la vessie. Le protocole spécifique décrite ci-dessus a été optimisé pour les études à court terme (~ 10 jours). Implanter le nombre exact de cellules est critique, car un certain nombre de cellules plus élevée entraîne une croissance plus rapide de la tumeur et, éventuellement, la perte de l...

cancer de la vessie est le deuxième cancer le plus fréquent de l&#39;appareil génito-urinaire, avec près de 75 000 nouveaux cas et 15 000 décès attendus en 2012 1. Les taux élevés de récidive exigent vie suivi, ce qui rend le cancer de la vessie l&#39;un des cancers les plus coûteuses à traiter. Cancer de la vessie qui a envahi la couche musculaire peut se métastaser dans le foie, le poumon ou l&#39;os par l&#39;intermédiaire du système lymphatique. Thérapie multimodale de tumeurs avancées résultats en seulement 20-40% de survie après 5 ans. Par conséquent, les stratégies de traitement efficaces visant à réduire la récidive et de progression du cancer superficiel de la vessie ainsi que l&#39;amélioration des résultats thérapeutiques chez les patients ayant une maladie avancée sont nécessaires d&#39;urgence. Développement de nouveaux produits thérapeutiques nécessite des modèles précliniques pour évaluer l&#39;efficacité suite à l&#39;évaluation initiale in vitro. Le microenvironnement de la tumeur peut influencer de manière significative le développement du cancer et la réactivité, ce qui souligne la nécessité d&#39;précliniquemodèles al dans lequel les tumeurs surviennent ou peuvent être établis dans l&#39;organe d&#39;origine. Une approche est le développement de modèles transgéniques dans lesquels les tumeurs apparaissent spontanément ou peut être induite de manière spécifique à un organe. Un excellent protocole d&#39;un modèle de cancer de la vessie transgénique a été récemment publiée 2. L&#39;inconvénient de modèles transgéniques est que les tumeurs ont tendance à se développer lentement et avec moins d&#39;uniformité que souhaité. En outre, le coût de l&#39;entretien d&#39;une colonie d&#39;élevage doit être considérée. Une alternative aux modèles transgéniques est implantation orthotopique de cellules tumorales, ce qui a l&#39;avantage de courts délais de mise en place de la tumeur chez des souris disponibles dans le commerce. Alors que certaines lignées de cellules de cancer de la vessie humaines peuvent être cultivées de manière orthotopique (nous avons utilisé avec succès UM-UC-3), il peut être souhaitable d&#39;établir des tumeurs chez des souris immunocompétentes. Deux lignées cellulaires de cancer de la vessie murin orthotopique, qui se développent sont MBT-2 et 3 MB49. Depuis MBT-2 cellules sont contaminés par la réplicationrétrovirus de type C 4, nous avons choisi cellules MB49 pour nos études. Il est important de noter que MB49 cellules ont été isolées à partir d&#39;une souris mâle et orthotopique implantations sont effectuées pour des raisons anatomiques chez des souris femelles. Ceci a l&#39;avantage de faciliter l&#39;identification des cellules implantées par marqueurs du chromosome Y, mais la disparité entre les sexes peut être un inconvénient pour les études immunologiques. L&#39;épithélium de la vessie est bordée par une (GAG) couche de glycosaminoglycanes, qui fonctionne comme une barrière à l&#39;infection par des microorganismes. Cette barrière peut également interférer avec l&#39;implantation des cellules tumorales et plusieurs méthodes ont été développées pour surmonter cette difficulté (tableau 1). Bistouri électrique a été largement utilisé comme un moyen physique pour perturber la couche de GAG 5-13 et une électrocoagulation démontrant de protocole a été récemment publié dans JoVE 14. Toutefois, si une unité d&#39;électrocoagulation ne pas être disponibles, des moyens chimiques pour détruire le GAG couche tel que le nitrate d&#39;argent ou de poly-L-lysine peut également être utilisé de 15 à 24. Les tumeurs sont établies de manière efficace par une brève exposition de la vessie à un faible volume de nitrate d&#39;argent (10.5 pl, 0,15 à 1,0 M, ~ 10 sec) ou plus en contact avec la poly-L-lysine (100 ul de 0,1 mg / ml pendant 20 min) (Tableau 1). Ici, nous décrivons une méthode qui utilise la trypsine afin de faciliter l&#39;implantation de cellules MB49. Dans une tentative pour améliorer les approches thérapeutiques pour le cancer de la vessie, la thérapie génique a attiré une attention considérable. D&#39;un point de vue clinique, le cancer de la vessie est une cible idéale pour la thérapie génique grâce à l&#39;accessibilité facile de l&#39;organe et la capacité à fournir localement la charge utile. Les vecteurs viraux qui ont été explorées pour la thérapie génique du cancer de la vessie comprennent un virus de l&#39;herpès simplex oncolytique 25, 26 retrovirus, le virus de la variole du canari 27, le virus de la vaccine, AAV, et adenovirus 28. Dans la seconde partie de notre protocole, nous décrivons un procédé pour la livraison virale qui est pratiquement identique à l&#39;instillation de cellules tumorales. D&#39;intérêt dans notre laboratoire est le développement de nouvelles approches en matière de délivrance de gènes, dont nous évaluons par bioluminescence en utilisant un vecteur adénovirus exprimant un transgène luciférase. Cependant, la méthodologie de cathétérisme de la vessie peut être utilisé pour la livraison de divers agents et a une large applicabilité donc.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			Name of reagent
			</td>
			<td style="height:25px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			Catalog number
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:40px;">
			6-8 week old female mice
			</td>
			<td style="height:40px;">
			Jackson Laboratories
			</td>
			<td style="width:188px;height:40px;">
			Strain Name: C57BL/6J
			Stock Number: 000664
			</td>
			<td style="width:193px;height:40px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			Trypsin*
			</td>
			<td style="height:25px;">
			MediaTech
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			MT25-053-CI
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			DMEM*
			</td>
			<td style="height:25px;">
			MediaTech
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			MT10-017-CV
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			FBS
			</td>
			<td style="height:25px;">
			Hyclone
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			SH30071.03
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Heat-inactivated
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:25px;">
			T25 flasks*
			</td>
			<td style="height:25px;">
			Corning Costar
			</td>
			<td style="width:188px;height:25px;">
			Corning No.:3056
			Fisher: 07-200-63
			</td>
			<td style="width:193px;height:25px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:42px;">
			MB49 cells
			</td>
			<td style="height:42px;">
			N/A
			</td>
			<td style="width:188px;height:42px;">
			N/A
			</td>
			<td style="width:193px;height:42px;">
			Obtained from Dr. Boehle (see reference11)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:46px;">
			Puralube Vet Ointment*
			</td>
			<td style="height:46px;">
			Pharmaderm
			</td>
			<td style="width:188px;height:46px;">
			Henry Schein Company
			No.:036090-6050059
			Fisher: NC9676869
			</td>
			<td style="width:193px;height:46px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:53px;">
			Depilatory cream: Veet
			</td>
			<td style="height:53px;">
			local pharmacy
			</td>
			<td style="width:188px;height:53px;">
			
			</td>
			<td style="width:193px;height:53px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:53px;">
			Lubricant:
			K-Y Jelly
			</td>
			<td style="height:53px;">
			local pharmacy
			</td>
			<td style="width:188px;height:53px;">
			
			</td>
			<td style="width:193px;height:53px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:72px;">
			Catheters*
			</td>
			<td style="height:72px;">
			Exel International
			</td>
			<td style="width:188px;height:72px;">
			Exel International
			No.:26751;
			Fisher: 14-841-21
			</td>
			<td style="width:193px;height:72px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:45px;">
			Isoflurane
			</td>
			<td style="height:45px;">
			Terrell
			</td>
			<td style="width:188px;height:45px;">
			NDC 66794-011-25
			</td>
			<td style="width:193px;height:45px;">
			Obtained though hospital pharmacy
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:52px;">
			1 ml slip tip TB syringes
			</td>
			<td style="height:52px;">
			Becton Dickinson
			</td>
			<td style="width:188px;height:52px;">
			BD309659
			Fisher:14-823-434
			</td>
			<td style="width:193px;height:52px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">
			D-Luciferin
			</td>
			<td style="height:27px;">
			Gold Biotechnologies
			</td>
			<td style="width:188px;height:27px;">
			L-123-1
			</td>
			<td style="width:193px;height:27px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:76px;">
			Ad-CMV-Luc
			</td>
			<td style="height:76px;">
			VectorBiolabs
			</td>
			<td style="width:188px;height:76px;">
			1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use
			</td>
			<td style="width:193px;height:76px;">
			Infectious agent that requires BSL2 containment
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:76px;">
			Steady-Glo&#160;Luciferase Assay System
			</td>
			<td style="height:76px;">
			Promega
			</td>
			<td style="width:188px;height:76px;">
			E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)
			</td>
			<td style="width:193px;height:76px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*available through multiple vendors



EQUIPMENT
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:97px;">
			Material name
			</td>
			<td style="width:114px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:330px;">
			Catalog number
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:97px;">
			Anesthesia system
			</td>
			<td style="width:114px;">
			E-Z Systems, Euthanex Corporation
			</td>
			<td style="width:330px;">
			Anesthesia system: EZ7000
			5-port mouse rebreathing device: EZ109
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Obtained through Fisher
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:97px;">
			Xenogen IVIS 200
			</td>
			<td style="width:114px;">
			Caliper Life Sciences
			</td>
			<td style="width:330px;">
			http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:97px;">
			FLUOstar Optima
			</td>
			<td style="width:114px;">
			BMG Labtech
			</td>
			<td style="width:330px;">
			http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies

cancer de la vessie est le deuxième cancer le plus fréquent de l&#39;appareil génito-urinaire et de nouvelles approches thérapeutiques qui peuvent réduire la récidive et la progression sont nécessaires. Le micro-environnement de la tumeur peut influencer de manière significative le développement de la tumeur et la réponse thérapeutique. Il est donc souvent souhaitable de cultiver les cellules tumorales dans les organes dont ils sont issus. Ce protocole décrit un modèle orthotopique de cancer de la vessie, dans laquelle les cellules de carcinome de la vessie murin MB49 sont instillées dans la vessie par l&#39;intermédiaire d&#39;un cathétérisme. Implantation réussie de cellules tumorales dans ce modèle nécessite la rupture de la couche de glycosaminoglycane protectrice, qui peut être réalisé par des moyens physiques ou chimiques. Dans notre protocole de la vessie est traitée avec de la trypsine avant l&#39;instillation de la cellule. Le cathétérisme de la vessie peut également être utilisé pour délivrer la thérapeutique une fois que les tumeurs sont établies. Ce protocole décrit la fourniture d&#39;un produit de construction adenoviral qui exprime un gène rapporteur de la luciférase. Alors que our protocole a été optimisé pour les études à court terme et se concentre sur la livraison de gènes, la méthodologie de la souris cathétérisme de la vessie a de larges applications.

Hématurie est observée dans presque toutes les souris dans les 8 jours après l&#39;implantation de 200.000 MB49 cellules. Comme le montre la figure 1, le poids de la vessie a plus que doublé, passant de 34,7 ± 3,3 mg (gamme 31-37 mg, n = 4) non tumorales chez des souris porteuses de 87,5 ± 19,2 mg (gamme de 77 à 120 mg, n = 10) chez des souris ont été implantés avec des cellules MB49. En termes de délivrance de gènes, nous avons constaté que l&#39;imagerie souris 24 heures après l&#39;inst...

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An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

L&#39;implantation de cellules cancéreuses dans l&#39;organe d&#39;origine peut servir de modèle préclinique utile pour évaluer de nouvelles thérapies. Des cellules de carcinome de la vessie MB49 peuvent être cultivées à l&#39;intérieur de la vessie après l&#39;instillation intravésicale. Ce protocole illustre le cathétérisme de la vessie de la souris dans le but d&#39;implantation de la tumeur et la livraison adénoviral.

Un modèle de cancer de la vessie orthotopique d&#39;études livraison Gene

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K vues.  Medical University of South Carolina.  L'implantation de cellules cancéreuses dans l'organe d'origine peut servir de modèle préclinique utile pour évaluer de nouvelles thérapies. Des cellules de carcinome de la vessie MB49 peuvent être cultivées à l'intérieur de la vessie après l'instillation intravésicale. Ce protocole illustre le cathétérisme de la vessie de la souris dans le but d'implantation de la tumeur et la livraison adénoviral. 

Vidéo: An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Culture ex vivo des tissus du patient et l&#39;examen de la livraison de gènes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Recherche

Médecine

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modèle orthotopique de cancer de la vessie murin

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

La radiothérapie combinée à un modèle de tumeur de cerveau de souris orthotopique

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Un modèle de la vessie orthotopique tumorale et l&#39;évaluation de Sarna traitement intravésicale

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modèle de souris orthotopique de cancer de la thyroïde anaplasique

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Modèle Orthotopique bioluminescente la progression du cancer du pancréas

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

Minimalement invasive Création d&#39;murin orthotopique de la vessie xénogreffes

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.