Ce protocole permet l’imagerie en temps réel à l’échelle de l’usine de l’activité du système de signalisation systémique de la plante grâce à la surveillance de la dynamique du glutamate de calcium et apoplasique en réponse à la blessure. Cette méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante fournit un outil robuste pour comprendre la dynamique des signaux rapides et à longue distance dans les plantes, combinant une résolution temporelle spatiale élevée et une facilité d’utilisation. Ce protocole offre le potentiel de fournir un nouvel aperçu des caractéristiques spatiales et temporelles de la signalisation du calcium du système dans les réponses au stress biotique et abiotique chez d’autres espèces végétales.
Takuya Uemura, un post-doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par allumer le stéréomicroscope fluorescent motorisé, équipé d’un objectif 1X et d’une caméra sCMOS. Configurez les paramètres de l’appareil pour irradier avec une lumière d’excitation centrée sur 470 nanomètres, sélectionnée à l’aide d’un filtre qui transmet la lumière entre 450 et 490 nanomètres.
Acquérir de la lumière d’émission à l’aide d’un filtre qui transmet entre 510 et 560 nanomètres. Retirez le couvercle de la parabole contenant la plante et placez-le sous la lentille de l’objectif. Vérifiez le signal fluorescent de la plante.
Attendez ensuite environ 30 minutes dans l’obscurité jusqu’à ce que les plantes soient adaptées aux nouvelles conditions environnementales. Ajustez la mise au point et le grossissement pour voir la plante entière dans le champ de vision. Définissez ensuite les paramètres d’acquisition pour détecter les signaux fluorescents à l’aide du logiciel d’imagerie des microscopes.
Définissez la durée d’enregistrement sur 11 minutes. Image pendant cinq minutes avant de commencer l’expérience pour acclimater la plante à l’irradiation de la lumière bleue du microscope, puis commencez à enregistrer. Pour déterminer la fluorescence de base moyenne, enregistrez au moins 10 images avant la blessure ou l’application de glutamate.
Pour l’imagerie en temps réel des changements de concentration en calcium cytosolique induits par la plaie et du glutamate apoplasique, coupez le pétiole ou la région médiane de la feuille L1 avec des ciseaux. Pour l’imagerie en temps réel du glutamate déclenché des changements de calcium cytosolique, couper environ un millimètre de l’extrémité de la feuille L1 à travers la veine principale avec des ciseaux. Après au moins 20 minutes, appliquez 10 microlitres de glutamate de 100 millimolaires sur la surface coupée de la feuille.
Pour l’analyse de l’intensité de la fluorescence au fil du temps, définissez une région d’intérêt à l’endroit où l’intensité de la fluorescence doit être analysée. Définissez deux ROIs pour le calcul de la vitesse de l’onde de calcium. Dans le logiciel d’imagerie, cliquez sur mesure du temps, définissez et encerclez.
Mesurez la distance entre les deux régions en cliquant sur annotations et mesure, longueur et ligne simple. Mesurez les valeurs de florescence brutes dans chaque roi au fil du temps en cliquant sur la mesure, puis exportez les données brutes vers un tableur, pour convertir le signal fluorescent en nombres à chaque point de temps. Déterminer la valeur de fluorescence de base, qui est devinée F zéro, en calculant le F moyen sur les 10 premières trames dans les données enregistrées, puis normaliser les données F comme décrit dans le manuscrit de texte.
Pour l’analyse des ondes de vitesse du calcium, définissez un point de montée de signal significatif au-dessus des valeurs pré-stimulées comme représentant la détection d’une augmentation du calcium dans chaque retour sur investissement. Calculer la différence de temps dans l’augmentation du calcium entre les deux ER et la distance entre eux pour déterminer les vitesses de toute onde de calcium. La propagation d’un changement blessure-déclenché des concentrations de l’ion cytosolique de calcium et du glutamate apoplastic est montrée ici.
Couper le pétiole d’une feuille dans les plantes exprimant GCaMP-3 a conduit à une augmentation significative du calcium. Il a été induit localement et puis écarté dans toute la vascularisation. Le signal s’est rapidement propagé aux feuilles voisines en quelques minutes.
En coupant une feuille et des plantes exprimant le renifleur de base de colle de la chitinase I, on a observé une augmentation apoplasique rapide de glutamate autour de la région de coupe. En quelques minutes, le signal s’est également propagé à travers la vascularisation. Pour l’imagerie en temps réel de la propagation du signal de calcium déclenchée par l’application de glutamate, le bord d’une feuille dans les plantes exprimant CCaMP-3 a été coupé.
Ceci a causé une augmentation cytosolique locale de concentration en ions de calcium, mais le signal a disparu en quelques minutes. Après environ 10 minutes, le glutamate a été appliqué sur la surface coupée, provoquant une augmentation locale rapide de la concentration de calcium cytosolique, puis la propagation de ce signal aux feuilles distales. Pour mesurer les changements à l’intérieur d’une concentration solide de calcium induite par la blessure dans la feuille systémique, le changement de cours de temps de l’intensité du signal GCaMP-3 a été mesuré dans deux régions d’intérêt.
Des changements apoplastiques de concentration en glutamate en réponse aux dommages mécaniques ont été mesurés aussi bien. La signature de glutamate a montré un pic simple à approximativement 100 secondes après blessure. Cette expérience devrait être menée dans des conditions contrôlées par la température et l’humidité, car elles sont élevées par les changements dans ces conditions environnementales.
Ce protocole offre un potentiel pour fournir des informations sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la signalisation à longue distance en utilisant des mutants que les éléments défectueux et putatifs du système de signalisation de laboratoire.
