Nous remercions Philipp Denninger de l&#39;aide pour la préparation et vidéo Bhavna Chaudhuri pour fournir des lignes de plantes exprimant FRET capteurs. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (MCB 1021677), le ministère de l&#39;Énergie (DE-FG02-04ER15542) à WBF, le National Institutes of Health, et le Howard Hughes Medical Institute à SRQGG a été soutenu par une longue EMBO terme de bourses. MM a été soutenu par la Fondation Alexander von Humboldt.

Remarque: Effectuez toutes les étapes étapes préparatoires dans des conditions stériles. 1. Préparation de cônes en plastique pour la germination des graines <ol><li> Remplir une boîte de Pétri 10 cm avec le milieu de croissance contenant de la gélose 1% à une épaisseur de 5 mm. Nous utilisons une force moitié modifiée Hoagland moyenne 4, mais la composition du milieu devrait être choisie en fonction de différents besoins expérimentaux. </li><li> Alors que le milieu est encore liquide, utiliser une pipette multi-canaux pour remplir 10 embouts de pipette ul avec 5 pi de milieu de la boîte de Pétri. </li><li> Conserver les conseils remplis dans la boîte de pointe de la pipette jusqu&#39;à ce que le support est solide, puis coupé à 4 cônes en plastique mm de long et à la verticale dans une boîte de Petri contenant un milieu de croissance solide. </li></ol> 2. Germination et croissance des semis <ol><li> Surface stériliser les graines dans NaOCl 5% pendant 5 min, laver trois fois avec de l&#39;eau stérile, puis placez une seule graine sur le dessus de chaque du cône moyen remplies. </li><li> Sceller le plat avec du ruban adhésif Micropore (3M) et conserver à 4 ° C pour synchroniser la germination. </li><li> Après trois jours, transférer les plaques à une chambre de croissance pour démarrer la germination. Nos conditions de croissance sont de 23 ° C à un cycle de 16h light/8h haute sombre (intensité de la lumière: 100 uE m -2 s -1). </li><li> Entre 5 et 7 jours après la germination, les semis devraient être prêts pour le transfert à l&#39;RootChip. A cette époque, des racines doivent être à proximité des points de fond des cônes en plastique. Vérifiez la santé des semis, la longueur des racines et, le cas échéant, l&#39;expression d&#39;un marqueur fluorescent sous une loupe binoculaire. </li><li> Marquez plants individuels pour le transfert sur la puce. Sélectionnez une dizaine de plants dans un cas est endommagé pendant le transfert. </li></ol> 3. Transfert de semis sur le RootChip <ol><li> Pour stériliser le RootChip à long terme des expériences, enveloppezl&#39;appareil dans du papier de soie, dans un plat en verre de Petri, et autoclave. </li><li> Une fois que le RootChip a refroidi, le couvrir avec un milieu de croissance liquide. Le RootChip doit être complètement immergé, mais le niveau du liquide ne doit pas être supérieure à 3 mm au-dessus de la surface RootChip. </li><li> Avec une pipette 20 ul, tirez moyenne à travers l&#39;entrée des racines et la chambre de sortie pour remplir la chambre d&#39;observation avec le milieu. </li><li> Cônes en plastique plug sélectionné à l&#39;étape 2.5 dans les entrées RootChip. Les cônes doit être bien ajusté dans les entrées. Depuis le RootChip est monté sur une fine couche de verre optique, ne s&#39;appliquent pas trop de pression à la puce. </li><li> Incuber la nuit RootChip en milieu liquide. Pour l&#39;empêcher de flotter, placez deux lames de verre sur la puce. Ajouter un barreau magnétique et fermer le plat. </li><li> Transférer l&#39;Assemblée à un agitateur magnétique et agiter doucement le milieu. </li><li> Le RootChip entrées se croisent les voies à un angle de 30 ° à l&#39;appareil normal de FACIlitate la croissance des racines dans les canaux (figure 1A). À soutenir la croissance en outre dans la direction souhaitée, basculer l&#39;ensemble légèrement en plaçant une lame de verre sous la boîte de Pétri sur le côté de la face puce des sorties. </li><li> Pour maintenir le cycle lumière / obscurité, la lumière sur les plants avec une lampe anneau (intensité de la lumière: 100 m uE -2 s -1) relié à une minuterie. </li></ol> 4. Raccordement de la RootChip au Transporteur <ol><li> Le lendemain, remplir un refermable, flacon sous pression avec le milieu de croissance liquide (figure 1B). </li><li> Inverser le support de puce et le placer sur une surface stable. Retirer l&#39;RootChip du milieu liquide et pour l&#39;insérer côté PDMS vers le bas dans l&#39;ouverture inférieure du support de puce. Orienter la puce de telle sorte que le côté contenant les entrées de commande de couche est tournée vers le côté de connecteurs de pression des tubes de ligne dans la paroi latérale de support. </li><li> Sécher le couvercle en verre sur lebas de la puce en tamponnant délicatement avec du papier absorbant. Fixez le RootChip au transporteur avec du ruban adhésif et le droit toute l&#39;assemblée. </li><li> Raccords pour tuyaux sont fabriqués en coupant souple tube en plastique microbore (TYGON, 0,20 &quot;x 0,060 ID&quot; OD) en morceaux de 5 cm de long et en les reliant à des tubes en acier inoxydable microbore (la Nouvelle-Angleterre petit tube, 0.025 &quot;OD x 0,013&quot; ID x 0,75 &quot; longue). remplissage des connecteurs de tubes avec de l&#39;eau en utilisant une seringue et le bouchon chaque raccord de tubulure d&#39;admission dans la couche de commande correspondant sur la puce. l&#39;eau sera ultérieurement remplir les canaux de couche de contrôle et peuvent être utilisées pour transmettre la pression aux vannes micromécaniques. </li><li> Brancher les extrémités opposées des lignes dans le support ou le flacon de solution (s). Appliquer une pression sur le flacon de solution avec une seringue d&#39;air. La pression de l&#39;air a augmenté dans le flacon de solution va forcer le liquide dans les lignes. </li></ol> 5. Montage de la RootChip au microscope <ol><li> Placez le support sur le Microscstade de l&#39;OPE. Pour réduire la possibilité de déplacer l&#39;assemblée au cours de l&#39;expérience à cause des vibrations dans la salle, le transporteur doit correspondre exactement dans les encoches de l&#39;insert scène. </li><li> Les soupapes à puce et l&#39;écoulement de milieu à travers la puce sont commandés par la pression d&#39;air. Deux lignes avec les régulateurs sont bifurqué d&#39;une ligne de pression principale - un est utilisé pour contrôler l&#39;écoulement de fluide à travers les canaux, et l&#39;autre est reliée à soupapes à air électrovannes qui actionnent les soupapes de poussée jusqu&#39;à la couche de contrôle. Les électrovannes sont exploités à partir de l&#39;ordinateur via le contrôleur USB de soupape (développé par Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Fermez les deux régulateurs de pression avant de connecter la puce. </li><li> Ajouter quelques ml d&#39;eau dans les réservoirs du transporteur pour maintenir l&#39;humidité élevée dans l&#39;assemblée. Cette étape doit être répétée sur le parcours de plus d&#39;expériences pour conserver les plantes de se dessécher. Maintenez le volume faible pour minimiser til quantité de liquide pouvant être versé sur le microscope. Pour expériences à long terme, la sortie des points de vente de puces peut être guidé dans les réservoirs du transporteur en reliant les points de vente de puces pour les réservoirs avec un tube microbore (voir l&#39;étape 4.4). Sinon, la sortie qui s&#39;accumule sur la surface de la puce peuvent être collectées par pipetage. </li><li> Préparer les feuilles de carrés de plastique transparent à partir de feuilles protectrices (C-Line). Fixer le plastique transparent au transporteur par un adhésif double face pour maintenir une humidité élevée dans l&#39;assemblée. </li><li> Placez la lumière anneau sur la puce et de maintenir le cycle lumière / obscurité. La lampe circulaire doit être éteint avant le début de toute expérience qui utilise des marqueurs fluorescents, que l&#39;éclairage direct d&#39;interférer avec la collection d&#39;images. </li></ol> 6. Fonctionnement de la RootChip aide de l&#39;interface LabView Le contrôleur d&#39;interface RootChip pour la plate-forme logiciel LabView peutêtre téléchargé depuis notre site <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> Les soupapes sur la puce sont fermées par application d&#39;une pression à la couche de contrôle, dans ce cas par l&#39;ouverture des vannes d&#39;air électrovannes. Le contrôleur d&#39;interface permet l&#39;activation des soupapes en cliquant sur le bouton ci-dessous le numéro de la vanne. Le vert vif indique application d&#39;une pression et la fermeture d&#39;une vanne de puce (figure 2B). Activer tous les trois solutions d&#39;entrée vannes dans l&#39;interface du contrôleur avant d&#39;ouvrir les régulateurs de pression. Note: Le contrôleur d&#39;interface dispose d&#39;une boucle de rétroaction, qui permet de suivre l&#39;état du système. Cette fonctionnalité peut être activée en cliquant sur le &quot;relecture&quot; bouton dans l&#39;interface du contrôleur. </li><li> Ouvrez le régulateur de pression pour la couche de contrôle et initialement fixé à 15 psi, puis ouvrez le régulateur pour le débit de la couche et initialement fixé à 5 psi. Dépendancesding sur le débit souhaité, les pressions peut être ajusté ultérieurement. </li><li> Ouvrir la soupape d&#39;admission pour le milieu de croissance de choix pour rincer les chambres avec du milieu. </li><li> Vérifiez les chemins d&#39;écoulement sous le microscope. En règle générale, l&#39;air est emprisonné dans les canaux d&#39;écoulement et doit être retiré. En outre, les canaux de la couche de contrôle encore contenir de l&#39;air qui doit être chassé et remplacé par l&#39;eau des raccords de tubes (dead-end de remplissage). Deux tâches sont réalisés par jet de liquide de chacun des huit chambres à plusieurs reprises (5 psi) jusqu&#39;à ce que tout l&#39;air est forcé à partir des canaux dans le PDMS (&quot;dégazage&quot;). Remarque: L&#39;interface du contrôleur peut être programmé pour automatiser des expériences. Ces routines peuvent également être utilisés pour dégazer la puce. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Le but premier de l&#39;RootChip est de combiner une plate-forme d&#39;imagerie et un système de perfusion dans un seul appareil avec un haut niveau d&#39;intégration. Pour démontrer la manipulationdu microenvironnement des racines on tirait les chambres avec du colorant alimentaire noir (dilution 1:4 dans un milieu de culture hydroponique) et mesuré l&#39;échange de fluide à l&#39;intérieur des chambres. A la pression recommandée de 5 psi, nous avons mesuré un échange complet dans les 10 secondes à un débit calculé d&#39;environ 1,5 l / min (Figure 3). Nous avons également observé la croissance des racines des jeunes plants, dans ce cas augmenté dans l&#39;obscurité et fourni avec 10 mM de glucose comme source d&#39;énergie externe (Figure 4). Selon les conditions de croissance tels que la lumière et la composition du milieu, les plantes peuvent être observées dans le RootChip pour un maximum de trois jours. Le RootChip a été utilisé pour surveiller les niveaux de glucose intracellulaire et galactose dans les racines exprimant nanocapteurs génétiquement codés, sur la base de Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 5-7. Roots dans la puce ont été perfusés avec des impulsions carrées de glucose ou de solution de galactose ( <strong&gt; Figure 5). Les concentrations intracellulaires de sucres ont été surveillés et sont présentés ici exprimée comme un rapport de l&#39;intensité de la Citrine fluorophore accepteur de l&#39;intensité de l&#39;ECFP donateurs. La hausse du ratio indique l&#39;accumulation de sucre. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Principe RootChip. <ol class="ualpha"><li> Le RootChip dispose de huit chambres d&#39;observation pour la croissance et l&#39;imagerie des racines. Les premières graines germent dans des cônes en plastique - fabriqués à partir de pointes de pipette en plastique - qui sont remplis d&#39;un milieu solide. L&#39;extrémité de la racine se développe à travers le milieu et parvient dans la chambre où un flux continu de milieu liquide maintient les conditions dans la chambre de constante. Vannes micromécanique (rouge) de contrôler le flux. La puce est montée sur une vitre de protection optique. Le dessin n&#39;est pas à l&#39;échelle. (Adapté avec la permission de Grossmann et al., 2011 Plant Cell.) </li><li> Scheme d&#39;un flacon de solution sous pression à membrane (rouge). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Raccordement et montage de la RootChip. <ol class="ualpha"><li> Vue du haut de la RootChip entièrement connecté et le transporteur monté sur un microscope inversé. </li><li> Schéma illustrant le système de vannes et de l&#39;interface du contrôleur. Un exemple pour une soupape de réglage pour guider l&#39;écoulement de fluide à une chambre unique est représenté. Alors que les vannes 4 à 8 soupapes agissent comme simples, les vannes de 0 à 3 acte en groupes. Avec ce système, une chambre individuelle peut être adressée par l&#39;activation d&#39;une combinaison de vannes. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Échange de solutions dans le ch observationambres. visualisation de l&#39;échange de fluide dans une chambre d&#39;observation en utilisant une solution de colorant. L&#39;image est une superposition de champ lumineux et fausses couleurs intensité du signal de colorant. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. La croissance des racines sur puce. Observation d&#39;une racine unique de plus en plus l&#39;expression d&#39;un fluorescent FRET nanocapteur pour le glucose / galactose au cours de 20h. Format de l&#39;heure: hh: mm; barre d&#39;échelle: 100 um. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Mesurer le taux de sucre intracellulaires à l&#39;aide FRET nanocapteurs. <ol class="ualpha"><li> Le montant de la sonde est indiqué que l&#39;intensité de citrine dans le bout de la racine (à gauche). La réponse de l&#39;intracellulaire FRET nanocapteur à l&#39;application de glucose ou une solution de galactose est représenté sous forme d&#39;images ratiométriques. (Adapté avec la permission de Grossmann et al., 2011 PlaCellule nt) La barre d&#39;échelle:. 100 um. </li><li> Tracing FRET changements de rapport en réponse à trois répétées des impulsions carrées de glucose (vert) et le galactose (rouge). </li></ol>

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	<li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors:+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells.">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li><li>Loqu&#233;, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wir&#233;n, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake.">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li><li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors.">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li><li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants.">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li><li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip.">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Les principaux avantages de la croissance par rapport aux méthodes RootChip classiques sont la préparation peu invasive pour la microscopie, la capacité de façon réversible et à plusieurs reprises de modifier l&#39;environnement root, et la capacité d&#39;observation continue du tissu développemental compétent et physiologiquement sain sur une période de plusieurs jours. Auparavant, les plants ont été cultivés à la verticale sur des supports gélifiés et transféré à un système de perfusion immédiatement avant l&#39;expérience, ce qui a permis que la mesure de racines simples à un moment 8. Outils microfluidiques ont été utilisés pour Arabidopsis, mais à un niveau faible intégration 9 ou sans contrôle 10 perfusion. Le RootChip combine un niveau d&#39;intégration élevé avec la possibilité d&#39;automatiser des expériences par le biais des conseils précis du débit. Un autre avantage de cette plate-forme, caractéristique de tous les dispositifs microfluidiques 11, est que seules des quantités minimes de liquide sont tenus de fournir à la racine avec l&#39;écrou nécessaireRients, même pour les expériences de plusieurs jours. Le RootChip est actuellement conçu comme un dispositif à usage unique, mais puisque les coûts de production de puces sont faibles, les faibles quantités de réactifs consommés rend la puce reste très rentable. Il ya quelques étapes essentielles qui doivent être prises pour garantir la santé des plants: Le volume dans les cônes en plastique n&#39;est pl 3-4, qui va commencer à sécher lorsqu&#39;elle est exposée à l&#39;air. Par conséquent, il est essentiel que les cônes sont transférés sur la puce rapidement et l&#39;humidité est maintenue élevée jusqu&#39;à ce que les racines ont atteint les chambres d&#39;observation, qui leur fournissent suffisamment d&#39;eau. Étapes 4.2 à 4.5 doit être effectuée rapidement et sans interruption pour éviter le dessèchement des plants. Étapes 3.5 - 3.8 décrire l&#39;incubation de la puce dans des milieux liquides au cours de laquelle les racines se développent dans les chambres d&#39;observation. Cette étape peut être ignorée par le montage de la puce dans le carrier immédiatement et de départ de perfusion constante avec un milieu de croissance. Toutefois, nous recommandons le trempage dans un milieu de croissance pendant une nuit, comme il a quelques avantages: 1) il crée un environnement humide de sorte que les plants sont moins susceptibles de se dessécher à mesure qu&#39;ils grandissent dans la chambre d&#39;observation; 2) la puce est trempé dans un liquide, de sorte dégazage (étape 6.4) est plus rapide. Il est important d&#39;utiliser les médias avec de faibles concentrations de soluté. Des solutions plus concentrées peuvent précipiter et de boucher les canaux, surtout si la puce est utilisée sur plusieurs jours. Une fois que le terminal est connecté à la conduite de pression d&#39;air, le flux de milieu est contrôlée en changeant la pression hydraulique dans les vannes. Afin de garantir une bonne fermeture des vannes micromécaniques, il est important de choisir une pression de commande qui est environ trois fois plus élevé que la pression d&#39;écoulement. La pression d&#39;écoulement ne doit pas dépasser 15 psi que le fluide sera poussé sur les entrées de racines. Des pressions plus élevées may aussi causer la délamination de la puce, ce qui rend inutilisable le chip. Une limitation de la RootChip est que le PDMS est poreuse et hydrophobe. Alors que le matériau est pratiquement inerte à des solutions aqueuses, il peut absorber les composés organiques 12. Cela peut interférer avec un échange rapide de solutions que les composés organiques peuvent couler de la matière même lorsque l&#39;alimentation de ce composé a été arrêté à l&#39;entrée. En raison de la porosité, l&#39;utilisation de solvants organiques peut provoquer un gonflement du PDMS 12. On continuer à optimiser la RootChip et s&#39;étendent son utilité, par exemple avec des racines de plantes cultivées. Nous croyons que par l&#39;amélioration de l&#39;accès à la racine pour les traitements et d&#39;observation, les outils microfluidiques comme le RootChip va ouvrir de nouvelles dimensions de la recherche des racines.

<table border="1"><tbody><tr><td> Articles </td><td> Source </td><td> Informations </td></tr><tr><td> Support de puce, de logiciels et d&#39;autres informations. </td><td> Carnegie Institution - DPB </td><td> Des fichiers de CAO et CNC pour la fabrication de support, logiciel de commande et de plus amples informations sont disponibles pour téléchargement sur ​​le site <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip~~HEAD=NNS</a> transporteurs peuvent également être commandés à partir de ce site. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Stanford Fonderie </td><td> Dessins de masques et de protocoles de fabrication sont disponibles sur demande. Prêt-à-utiliser RootChips peut être commandé auprès <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Contrôleur de carte à puce </td><td> -Maison construite-</td><td> Le système de vanne automatique de contrôleur a été initialement développé par Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab. Une instruction détaillée comment construire votre propre contrôleur de vanne actionné peut être trouvé à <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse fluorescence imaging of arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the rootchip

Les fonctions des racines que l&#39;ancre physique de l&#39;usine et est l&#39;organe responsable de l&#39;absorption d&#39;eau et les nutriments minéraux tels que des éléments d&#39;azote, de phosphore, de sulfate et de trace que les plantes acquièrent à partir du sol. Si nous voulons développer des approches durables pour la production de rendement des cultures à haute, nous avons besoin de mieux comprendre comment se développe la racine, prend place un large éventail de nutriments, et interagit avec des organismes symbiotiques et pathogènes. Pour atteindre ces objectifs, nous devons être en mesure d&#39;explorer les racines dans le détail microscopique sur des périodes allant de quelques minutes à plusieurs jours. Nous avons développé le RootChip, un polydiméthylsiloxane (PDMS) - basé dispositif microfluidique, qui nous permet de grandir et de racines d&#39;image à partir de plants d&#39;Arabidopsis en évitant tout stress physique aux racines lors de la préparation pour l&#39;imagerie 1 (figure 1). Le dispositif contient une structure de canal bifurqué avec vannes micromécaniques pour guider l&#39;écoulement du fluideà partir des entrées de solution à chacun des huit chambres d&#39;observation 2. Ce système de perfusion permet le microenvironnement root pour être contrôlé et modifié avec précision et rapidité. Le volume des chambres est d&#39;environ 400 nl, ce qui nécessite que des quantités minimes de la solution d&#39;essai. Ici nous fournissons un protocole détaillé pour étudier la biologie racine sur le RootChip en utilisant l&#39;imagerie des approches fondées sur la résolution en temps réel. Les racines peuvent être analysés sur plusieurs jours en utilisant la microscopie laps de temps. Les racines peuvent être perfusés avec des solutions nutritives ou des inhibiteurs, et jusqu&#39;à huit plants peuvent être analysés en parallèle. Ce système a le potentiel pour une large gamme d&#39;applications, y compris l&#39;analyse de la croissance des racines dans la présence ou l&#39;absence de produits chimiques, basé sur la fluorescence d&#39;analyse de l&#39;expression génique et l&#39;analyse des biocapteurs, par exemple FRET nanocapteurs 3.

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Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Cet article fournit un protocole pour la culture de jeunes plants d&#39;Arabidopsis dans le RootChip, une plate-forme d&#39;imagerie qui combine microfluidique de contrôle automatisé des conditions de croissance avec un suivi racine microscopique et FRET basée sur la mesure de niveaux intracellulaires de métabolites.

Time-lapse d&#39;imagerie par fluorescence de la croissance racinaire d&#39;Arabidopsis avec la manipulation rapide de l&#39;environnement root en utilisant le RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

time-lapse-fluorescence-imaging-arabidopsis-root-growth-with-rapid

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19.5K vues.  Carnegie Institution for Science. Cet article fournit un protocole pour la culture de jeunes plants d'Arabidopsis dans le RootChip, une plate-forme d'imagerie qui combine microfluidique de contrôle automatisé des conditions de croissance avec un suivi racine microscopique et FRET basée sur la mesure de niveaux intracellulaires de métabolites.

Vidéo: Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

Démonstration des utilisations du spectromètre force gravitationnelle roman de s&#39;étirer et de mesurer les protéines fibreuses

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

Recherche

Bio-ingénierie

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Or Nanostar synthèse avec une méthode de graines Silver croissance Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture cellular behaviors involved in developmental processes.&#160; The ability to track and follow cell movements is limited by sample movements that occur due to drift of the sample or, in some cases, growth during image acquisition. Tracking cells in datasets affected by drift and/or growth will incorporate these movements into any analysis of cell position. This may result in the apparent movement of static structures within the sample. Therefore prior to cell tracking, any sample drift should be corrected. Using the open source Fiji distribution 1 &#160;of ImageJ 2,3 and the incorporated LOCI tools 4, we developed the Correct 3D drift plug-in to remove erroneous sample movement in confocal datasets. This protocol effectively compensates for sample translation or alterations in focal position by utilizing phase correlation to register each time-point of a four-dimensional confocal datasets while maintaining the ability to visualize and measure cell movements over extended time-lapse experiments.

Time-lapse microscopy allows the visualization of developmental processes. Growth or drift of samples during image acquisition reduces the ability to accurately follow and measure cell movements during development. We describe the use of open source image processing software to correct for three dimensional sample drift over time.

Exemple de correction de la dérive Après 4D confocale imagerie time-lapse

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Mesure continue du bruit biologique chez Escherichia Coli à l’aide d’une microscopie en accéléré

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

Réplication biomimétique de la microstructure de surface racine à l’aide de l’altération de la lithographie douce

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imagerie du flux sanguin avec Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...