Les auteurs remercient Chalid Ghadban pour son excellente assistance technique, Andreas Wodarz et Stephan Heermann pour leurs conseils techniques concernant la microscopie confocale et time-lapse. Il n&#39;y a pas de conflit d&#39;intérêts pour l&#39;un des auteurs. Ce travail est financé par le Conseil de recherches en allemand (DFG) dans le projet 2 de Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), par les Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Allemagne) et par le Programme de recherche de la Faculté de médecine, Georg-Août-Université de Göttingen, en Allemagne.

Ce nouveau modèle est une adaptation d&#39;une approche organotypique hippocampe de tranches de cerveau déjà publié 9-12. Modifications et ajouts ont été introduites pour optimiser les interactions du tissu des cellules cancéreuses du cerveau et à garantir la reproductibilité. L&#39;étude a été examiné et approuvé par le comité d&#39;éthique local. Les animaux ont été traités avec soin selon les lignes directrices pour les soins des animaux à la médecine de l&#39;Université de Göttingen. La tranche de cerveau organotypique co-culture peut être subdivisé en deux étapes. La première étape est la préparation du cerveau organotypique. La deuxième étape comprend la préparation de cellules tumorales et de dépôt dans le modèle de co-culture. Une. Organotypique tranche de cerveau <ol><li> Préparer le milieu de dissection constitué par un milieu essentiel minimum (MEM) additionné de glutamine de 0,2 mM, 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine et 4,5 mg / ml de glucose. </li><li> Décapiter la souris de toute souche de souris entre le jour postnatalsix et huit (P6-8). </li><li> Retirer le cerveau du crâne rapidement dans des conditions aseptiques et le transférer à un milieu de dissection glacée. </li><li> Retirer le pôle frontal et le cervelet à partir de la section de cerveau entier. </li><li> Fixer et stabiliser le cerveau sur une scène avec de la colle cryo et 5% d&#39;agarose. </li><li> Couper les coupes de cerveau horizontalement à une épaisseur de 350 um en utilisant un vibratome. </li><li> Recueillir quatre à six tranches de cerveau entier à partir d&#39;un cerveau de souris unique, selon l&#39;espèce et l&#39;âge. </li><li> Préparer le milieu de culture constitué de 50% MEM, une solution saline équilibrée de 25% de Hanks (HBSS), 25% de sérum de cheval normal (NHS), mM de glutamine 0,2, 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine (Sigma, Munich, Allemagne), et 4,5 mg / ml de glucose. </li><li> Mettre chaque tranche de cerveau organotypique um sur un polycarbonate Transwell insert de membrane de 0,4 dans une plaque à six puits avec 1 ml de milieu de culture dans le puits inférieur. </li><li> Culture organotypique tranches de cerveau pendant la nuit dans un humidified atmosphère à 5% de CO2 à 37 ° C incubateur. </li></ol> 2. Le modèle Slice Coculture <ol><li> Incorporer 10 de 5 tumeur de la GFP-transfecté ou d&#39;autres cellules (par exemple cellules MCF-7-GFP) dans 20 ul de matrice de gel, consistant en 15% de milieu RPMI et ECM gel de 85%. </li><li> Placer le mélange matrice MCF-7-gel dans une entretoise métallique stérile (diamètre 3,8 mm) directement adjacente à la région corticale du cerveau organotypique et incuber pendant 2 heures. </li><li> Retirer l&#39;entretoise et laissez le sphéroïde tumeur 3D à co-culture avec la tranche organotypique de 24-96 heures. </li><li> Changer le milieu de culture tous les jours. </li></ol> 3. Immunofluorescence des astrocytes et la microglie dans le cerveau organotypique de tranche Coculture <ol><li> Fixer la tranche de cerveau organotypique co-culture avec du paraformaldéhyde 4% pendant 8 heures à 4 ° C. </li><li> Laver la co-culture de la tranche avec du PBST (PBS avec 0,5% de Triton X-100) pendant 5 min. </li><li> Bloquer les sexemples avec du sérum de chèvre normal dans du PBST (01:20) à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Colorer les astrocytes en incubant la co-culture de section de cerveau avec fibrillaire gliale anti-acide d&#39;anticorps monoclonal de protéine (GFAP, 1:200 dans PBST) pendant 36 heures à 4 ° C suivi d&#39;anticorps de chèvre anti-souris-TRITC (1:100 dans PBST) coloration pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver avec du PBST les échantillons à trois reprises pendant 5 min. </li><li> Colorer les cellules microgliales avec ILB 4 Alexa Fluor 647 (1:100 en PBS) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Contre-colorer la tranche de cerveau coculture avec du DAPI (1:1000) pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Mont et lamelle la tranche de cerveau co-culture avec DAKO fluorescent milieu de montage. </li><li> Évaluer la qualité de l&#39;invasion de la tumeur sur la base du système de notation suivant: 0 = aucune des cellules; + &lt;1/3; + + = 1/3-2/3; + + + ≥ 2/3 des cellules envahies (première mesurer la longueur de la section de contact entre la prise de la tumeur et la tranche, puis mesurer le fractionnementn contact détectable par les cellules envahissantes). </li></ol> 4. Imagerie en direct de l&#39;interaction entre les cellules gliales et cellules tumorales <ol><li> Effectuer l&#39;expérience dans un Leica inversé DMI 6000B microscope à 10X lentille de grossissement et un Leica DFC 350 FX caméra CCD. </li></ol>

<ol>
	<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs.">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+inflammation.">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis.">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li><li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells.">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752 (2013).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li><li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies.">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+and+neuronal+damage:+differential+effects+of+THC,+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures.">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).</li><li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li><li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site.">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way.">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li><li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Histologiques précédentes de métastases cérébrales ont montré des changements rapides et drastiques des cellules gliales résidentes, en particulier des astrocytes et la microglie 13. Pour étudier ces changements et les interactions avec les cellules de carcinome, ce nouveau système de co-culture est bien adapté. D&#39;autres domaines de recherche ont déjà une expérience de longue date avec des tranches de cerveau organotypiques d&#39;hippocampe. Un avantage est que les cultures d&#39;hippocampe de tranches de cerveau organotypiques sont viables et efficacement conservée pendant plusieurs jours à plusieurs semaines, ce qui convient pour des expériences à long terme. Depuis l&#39;introduction de Stoppini du système de coupe d&#39;hippocampe organotypique en 1991, il a été largement utilisé, par exemple dans la recherche des maladies dégénératives. Ainsi, ce système de co-culture de innover représente une modification d&#39;une approche bien établie avec une gamme d&#39;applications de la biologie de la tumeur 9,11. La modification nous a offert un modèle reproductible pour évaluer la qualité de l&#39;invasion tumorale afet ensuite précieusement cultures cultivées par le procédé d&#39;interface sont parfaitement adaptées pour des expériences qui nécessitent une structure tridimensionnelle. Plusieurs techniques ont été utilisées pour co-cultiver des tranches hippocampiques organotypiques avec d&#39;autres cellules. Ceux-ci comprennent un système indirect entre les cellules macrophages et le cerveau organotypique 14, et une co-culture directe des deux tranches différentes de la région hippocampique 15. agrégats de gliome ont aussi été co-cultivées avec des tranches de cerveau 16. Ces modèles peuvent être utilisés pour analyser les événements cellulaires et moléculaires dans les tranches de cerveau, mais ne permettent pas, contactez physiologique directe entre les cellules tumorales, la microglie et le parenchyme cérébral. En outre, ce procédé permet l&#39;observation de la microglie, sans contamination de la moelle osseuse dérivées des monocytes / macrophages périphériques. L&#39;utilisation du modèle de souris transgénique CCR2 et CX3CR1 constitue une amélioration essentielle en raison du fait qu&#39;il est difficile de distinguer la microglie résidente d&#39;envahir les monocytesen fonction de leurs propriétés similaires 17,18,19. Bien que l&#39;injection intracérébrale de cellules de carcinome permet d&#39;instruction progression de la tumeur, il ne peut pas dire autant que de savoir si les cellules de type macrophage entouré proviennent de la population de la microglie du cerveau-résident ou de dérivées de moelle osseuse périphériques monocytes / macrophages 17. L&#39;équipe de Kettenmann introduit un modèle de tranche de cerveau organotypique qui a impliqué l&#39;inoculation des cellules de gliome dans des tranches de cerveau avec un micromanipulateur 20. Toutefois, les gliomes malins primaires diffèrent à bien des égards de carcinomes métastatiques. Tout d&#39;abord, les gliomes malins sont d&#39;origine mésenchymateuse, ne métastasent pas en dehors du système nerveux, et migrent / envahir les cellules comme simples sans frontière entre la tumeur et le tissu cérébral. En revanche, la croissance d&#39;infiltration est une caractéristique pathologique typique, et les carcinomes généralement migrer / envahir que les cohortes. Deuxièmement, les carcinomes essaient souvent de reconstruire les structures épithéliales dans le cerveau, tandis que les cellules glialesessayer de séparer la tumeur à partir du tissu cérébral par une (pseudo) capsule. Considérant les caractéristiques biologiques et morphologiques, gliome malin et les métastases des cancers ne sont pas vraiment comparables. Pour ces raisons, nous avons modifié et développé un système de co-culture où nous n&#39;avons pas coculture injectons mais un bouchon de cellules de carcinome à côté de la tranche de cerveau. En outre, nous avons observé microgliale et astrocytaire accumulation à la frontière de la fiche de la tumeur, ce qui signifie que les microglies pénètrent dans le bouchon de la tumeur et peuvent être facilement détectés par microscopie sur fond clair et par la suite ont confirmé par microscopie confocale. Les cellules cancéreuses envahissent dans la tranche de cerveau, ce qui est comparable au réel de la situation in vivo et à une observation faite par Baumert et ses collègues, qui ont trouvé une zone d&#39;infiltration dans 63% des cas d&#39;autopsie avec métastases cérébrales 21. En raison de la perfusion sanguine manquant, il n&#39;y a que résident macrophages / microglie dans cette culture. En outre, en raison de la mcellules T Issing et, par conséquent, en l&#39;absence allo-réactivité, les cellules de carcinome humain pourraient être utilisés pour co-culture, même avec des tranches de cerveau de souris ou de rats immunocompétents (IRM, B6, ou Wistar). Cela pourrait servir d&#39;alternative au modèle de souris nude. Etant donné que quatre à cinq tranches peuvent être obtenus à partir de chaque souris, un nombre significativement réduit d&#39;animaux sont tenus, en comparaison avec les modèles existants d&#39;injection. De plus, les animaux ne souffrent pas pendant une longue période de la maladie métastatique et qu&#39;ils ne subissent pas d&#39;interventions chirurgicales à répétition 22. Avec ce système de co-culture, nous avons démontré l&#39;activation de la microglie par les cellules cancéreuses et la capacité de promouvoir l&#39;invasion des cellules cancéreuses. En outre, c&#39;est la première fois, à notre connaissance, la microglie ont été trouvés pour transporter activement des cellules de carcinome 23. Malgré tous ces avantages, le système de co-culture a, en effet, aussi les limites. Il est encore in vitromodéliser les étapes manquantes de métastases avant la colonisation. En raison de l&#39;absence de perfusion, il n&#39;est pas possible d&#39;étudier l&#39;extravasation. Ainsi, la voie alternative pour étudier l&#39;extravasation est d&#39;utiliser soit le modèle in vivo par injection ou le système de chambre de Boyden modifiée avec la matrice extracellulaire, des astrocytes et des cellules HUVEC pour imiter la barrière hémato-encéphalique 22,24. La méthode de co-culture de section de cerveau est encore un modèle fiable et reproductible avec de nombreux avantages et un potentiel pour une grande variété d&#39;applications, telles que l&#39;analyse de la colonisation, en particulier en mettant l&#39;accent sur le rôle des cellules résidentes. La combinaison avec d&#39;autres techniques établies (comme l&#39;immunohistochimie, microscopie confocale et la microscopie time-lapse) prend en charge l&#39;étude des interactions directes de cellule à cellule. C&#39;est une alternative et la complémentation des autres techniques facile et offre un accès à l&#39;enquête sur les indices et les effets comme imposées par le microenvironnement métastatique.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

Les patients atteints de métastases cérébrales de carcinomes ont un mauvais pronostic. Cependant, le processus sur le site métastatique a été à peine étudié, en particulier le rôle du résident (stromales) cellules. Des études chez des carcinomes primaires démontrent l&#39;influence du microenvironnement sur ​​les métastases, même sur le pronostic 1,2. En particulier les macrophages associés aux tumeurs (TAM) migration de soutien, l&#39;invasion et la prolifération 3. Fait intéressant, les principaux sites cibles de la métastase possèdent des macrophages spécifiques d&#39;un tissu, telles que les cellules de Kupffer dans le foie ou la microglie dans le SNC. En outre, les sites métastatiques possèdent également d&#39;autres cellules spécifiques d&#39;un tissu, comme les astrocytes. Récemment, les astrocytes ont été démontrées pour favoriser la prolifération et la persistance des cellules cancéreuses 4,5. Par conséquent, les fonctions de ces types de cellules spécifiques d&#39;un tissu semblent être très important dans le processus de métastase cérébrale 6,7. En dépit de ces observations,Toutefois, jusqu&#39;à présent, il n&#39;y a pas convenable modèle in vivo / in vitro à la disposition de visualiser directement les réactions gliales lors de la formation de métastases cérébrales, en particulier par microscopie en champ clair. Récente imagerie in vivo en direct de cellules de carcinome démontré leur comportement de colonisation cérébrale 8. Cependant, cette méthode est très laborieux, coûteux et techniquement complexe. En outre, ces sortes d&#39;expériences sur des animaux sont limitées à de petites séries et sont livrés avec une contrainte importante pour les animaux (par l&#39;implantation de la plaque de verre, l&#39;injection de cellules tumorales, l&#39;anesthésie répétitif et la fixation à long terme). Par ailleurs, l&#39;imagerie in vivo est limitée à ce jour à la visualisation des cellules de carcinome, alors que des interactions avec des cellules résidentes n&#39;ont pas encore été illustrée. Enfin, les enquêtes sur les cellules de carcinome humain dans les animaux immunocompétents sont impossibles 8. Pour ces raisons, nous avons établi un système de consi coculturepiqûre d&#39;une tranche de cerveau de souris et des cellules épithéliales organotypique intégré dans matrigel (sphère de cellules 3D). Les sphères carcinome de cellules 3D ont été placées directement à côté du bord de section de cerveau afin d&#39;étudier l&#39;invasion du tissu cérébral voisin. Cela nous permet de visualiser les changements morphologiques et les interactions entre les cellules gliales et les cellules de carcinome par fluorescence et même par microscopie en champ clair. Après l&#39;expérience de co-culture, les tissus cérébraux ou les sphéroïdes de cellules 3D peuvent être collectées et utilisées pour d&#39;autres analyses moléculaires (par exemple qRT-PCR, IHC, ou immunoblot) ainsi que pour les enquêtes par microscopie confocale. Cette méthode peut être appliquée pour surveiller les événements dans un tissu cérébral vivant pour les jours sans effets préjudiciables sur les tranches de cerveau. Le modèle permet également la suppression sélective et le remplacement des cellules résidentes par les cellules d&#39;un tissu du donneur afin de déterminer l&#39;impact distinct d&#39;un génotype donné. Enfin, le modèle de co-culture est une alternative possible,pour les approches in vivo lors de l&#39;essai manipulations pharmacologiques ciblées.

Tout d&#39;abord, toutes les cellules de carcinome utilisées (humaines: MCF-7 et murins: 410,4) ont envahi le cerveau organotypique de la souris. L&#39;invasion était donc espèces indépendants (figure 1A), ce qui indique un large éventail d&#39;applications de manière indépendante de l&#39;espèce. En outre, la microglie ainsi que les astrocytes accumulées à l&#39;interface, comme décrit précédemment in vivo et dans des échantillons de patients 13. Imagerie time-lapse sur une longue période de temps, non seulement révélé la viabilité de la tranche, mais a également offert une bonne plate-forme pour observer les interactions cellulaires. Par des expériences time-lapse, les cellules microgliales ont été enregistrés à entrer dans la sphère 3D de la cellule tandis que, à son tour, les cellules cancéreuses ont également envahi la tranche de cerveau (figures 1B1-B2). De plus, nous avons précédemment montré la capacité de la microglie pour transporter des cellules de carcinome par un mécanisme encore énigmatique pour aider de ce fait dans l&#39;invasion de carcinome. En utilisant des techniques de marquage par immunofluorescence, nousdécrit des co-localisations de cellules tumorales et des cellules stromales (par exemple, la microglie et les astrocytes), à la fois dans les tissus du cerveau et dans le bouchon de la cellule tumorale (Figures 1C-D), ce qui suggère une interaction étroite entre ces cellules au cours du processus d&#39;invasion. Des résultats comparables ont été obtenus lorsque des tranches de cerveau de souris ont été co-cultivées soit avec (figures 1D1-D3) des cellules de carcinome humain (figures 1C1-C3) ou murine - montrant la large gamme d&#39;applications pour l&#39;étude des cellules de différentes espèces, génotypes et souches. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> Figure 1. Tranche de cerveau modèle de co-culture avec un sphéroïde 3D ​​de souris et des cellules de carcinome humain. A) La quantification de l&#39;invasion de cellules cancéreuses dans des co-cultures organotypiques ensemble de tranches de cerveau avec un cancer du sein de la sourisLignée cellulaire 410.4 ou d&#39;une lignée cellulaire de cancer du sein humain MCF-7. Les données représentent le pourcentage de la mesure de l&#39;invasion de cellules dans le cerveau tranche dans chaque groupe avec n ≥ 38. Il n&#39;y avait pas de différence significative entre ces deux groupes (test de Kruskal-Wallis). B) images de time-lapse de organotypiques entiers co-cultures de tranches de cerveau avec des cellules MCF-7-GFP et des images représentatives de day2 (B1) et le jour 5 (B2) ont été montré. CD) confocale images de microscopie ont montré cohortes de carcinomes, les astrocytes et la microglie. Double coloration des astrocytes (anti-GFAP-TRITC, rouge) et la microglie (ILB4-Alexa Fluor 647, violet) de l&#39;ensemble de co-culture avec le 350 um d&#39;épaisseur tranche de cerveau organotypique et le bouchon de la cellule tumorale GFP transfectées (vert): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) et 3D-410.4-GFP (D1-D3). Des traits blancs ont montré le bord de la tranche de cerveau et le front de l&#39;invasion tumorale. Barres d&#39;échelle représentent 50 um. Microglies, des astrocytes unee tumeurs colocalisations (C1 et D1), les astrocytes-tumeurs colocalisations (C2 et D2) et colocalisations microglie-tumorales (C3 et D3) dans la co-culture de la tranche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a>

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Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

La co-culture organotypique de tranche de cerveau avec des cellules de carcinome permet la visualisation des changements morphologiques par fluorescence, ainsi que champ lumineux (vidéo) microscopie pendant le processus d&#39;invasion cellulaire de carcinome du tissu cérébral. Ce système permet également de modèle pour change de cellule et de réapprovisionnement des approches et offre une grande variété de manipulations et analyses.

Système de co-culture avec un cerveau organotypique et 3D sphéroïde de cellules de carcinome

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

20.5K vues.  University of Göttingen.  La co-culture organotypique de tranche de cerveau avec des cellules de carcinome permet la visualisation des changements morphologiques par fluorescence, ainsi que champ lumineux (vidéo) microscopie pendant le processus d'invasion cellulaire de carcinome du tissu cérébral. Ce système permet également de modèle pour change de cellule et de réapprovisionnement des approches et offre une grande variété de manipulations et analyses. 

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Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

Transplantation mammaires de cellules stromales et les cellules de carcinome chez les souris C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Recherche

Médecine

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modèle de souris orthotopique de cancer de la thyroïde anaplasique

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Évaluation de Cancer de l&#39;ovaire Spheroid attachement et l&#39;invasion des cellules mésothéliales en temps réel

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Une tumeur au cerveau / organotypiques Slice système de co-culture pour l&#39;étude des tumeurs Microenvironnement et ciblée Thérapies de drogue

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Un modèle de culture de coupe organotypique du glioblastome humain pour l&#39;étude de la migration des cellules tumorales et des effets spécifiques des patients contre les médicaments anti-invasifs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

Symmetric Bihemispheric Postmortem cerveau de coupe pour étudier en santé et états pathologiques du cerveau chez les humains

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

Organotypic Slice Cultures as Preclinical Models of Tumor Microenvironment in Primary Pancreatic Cancer and Metastasis

Realistic preclinical models of primary pancreatic cancer and metastasis are urgently needed to test the therapy response ex vivo and facilitate personalized patient treatment. However, the absence of tumor-specific microenvironment in currently used models, e.g., patient-derived cell lines and xenografts, only allows limited predictive insights. Organotypic slice cultures (OTSCs) comprise intact multicellular tissue, which can be rapidly used for the spatially resolved drug response testing.
This protocol describes the generation and cultivation of viable tumor slices of pancreatic cancer and its metastasis. Briefly, tissue is casted in low melt agarose and stored in cold isotonic buffer. Next, tissue slices of 300 &#181;m thickness are generated with a vibratome. After preparation, slices are cultured at an air-liquid interface using cell culture inserts and an appropriate cultivation medium. During cultivation, changes in cell differentiation and viability can be monitored. Additionally, this technique enables the application of treatment to viable human tumor tissue ex vivo and subsequent downstream analyses, such as transcriptome and proteome profiling.
OTSCs provide a unique opportunity to test the individual treatment response ex vivo and identify individual transcriptomic and proteomic profiles associated with the respective response of distinct slices of a tumor. OTSCs can be further explored to identify therapeutic strategies to personalize treatment of primary pancreatic cancer and metastasis.

This protocol describes the preparation of organotypic slice cultures (OTSCs). This technique facilitates the ex vivo cultivation of intact multicellular tissue. OTSCs can be used immediately to test for their respective response to drugs in a multicellular environment.