Les cultures cellulaires bidimensionnelles n’imitent pas adéquatement la croissance tumorale in vivo. Pour améliorer, des procédures 3D ont été développées à l’aide de sphéroïdes. Notre analyse 3D à base de sphéroïdes du glioblastome est particulièrement bien adaptée pour étudier l’invasion de tumeurs cérébrales dans l’environnement sain des tumeurs cérébrales.
Les modèles de culture tridimensionnels peuvent être utilisés pour récapituler une architecture multicellulaire, l’hétérogénéité et l’état métabolique des tumeurs permettant une évaluation plus rigoureuse des effets des médicaments. Assurez-vous de ne pas toucher le fond du puits ou d’enlever complètement le surnatant, de garder le gel sur la glace et d’ajouter rapidement les cellules au gel. Pour générer des sphéroïdes tumoraux de taille uniforme, lavez d’abord la culture tumorale d’intérêt avec cinq millilitres de PBS et traitez les cellules avec 0,5 à un millilitre d’enzyme de dissociation.
Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction avec quatre à 4,5 millilitres de PBS et transférer les cellules détachées dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de croissance complet. Après comptage, résuspendez les cellules à une fois 10 à la sixième cellule par huit millilitres de milieu de croissance complet complété par deux millilitres de concentration de méthylcellulose de 2% et transférez la suspension dans un récipient stérile de système. Ajoutez ensuite 100 microlitres de cellules à chaque puits d’une plaque inférieure ronde de 96 puits et placez la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius pendant trois à quatre jours.
Pour effectuer un test d’invasion, lorsque les cellules tumorales ont formé des sphéroïdes de taille uniforme, transférer chaque structure cellulaire dans un tube de 500 microlitres et laver les sphéroïdes une fois avec 200 microlitres de PBS. Après le deuxième lavage, transférer soigneusement les sphéroïdes dans 100 microlitres de matrice de collagène fraîchement préparée et ajouter chaque suspension sphéroïde au centre de chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, ajouter 100 microlitres de milieu de croissance complet sur le gel de chaque puits.
Assurez-vous de placer tous les sphéroïdes au centre de chaque puits pour la meilleure imagerie de l’invasion cellulaire tumorale. Pour effectuer un test de migration, lorsque les cellules tumorales ont formé des sphéroïdes de taille uniforme, enrober une plaque de six puits de 0,2 milligramme par millilitre de Matrigel en milieu de croissance pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, retirer le Matrigel et ajouter deux millilitres de milieu de croissance complet à chaque puits.
Transférer les sphéroïdes de la plaque inférieure ronde en 50 volumes de microlitres dans les puits individuels de la plaque de six puits et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain, tachez les sphéroïdes avec 10 nanogrammes par millilitre de Hoechst pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pour l’acquisition d’images après une invasion ou un test de migration, placez la plaque sur la scène d’un microscope confocal Brightfield équipé d’une caméra vidéo et obtenez des images au cours de la période expérimentale appropriée.
Pour analyser les images de manière semi-automatisée, importez les images aux Fidji et cliquez sur Plugins, Macros, Interactive Interpreter. Copiez et coller la boucle violette adaptée. Gardez les phrases violettes et ajoutez les phrases vertes d’intérêt si nécessaire.
Ensuite, pour mesurer la zone de chaque sphéroïde, cliquez sur Analyser et mesurer. Pour mesurer l’hypoxie dans des zones distinctes de la structure sphérique, la coloration carbonique d’anhydrase IX peut être employée pour déterminer l’activité hypoxique. Dans cette analyse représentative, des cellules positives plus carboniques d’anhydrase IX ont été observées dans le centre sphéroïde.
Les cellules hypoxiques situées dans le noyau sphéroïde ont tendance à être plus glycolytiques que les cellules entourant le noyau. Les mitochondries peuvent être photographiées par microscopie électronique pour une analyse plus approfondie. Le diamètre des sphéroïdes est directement corrélé à la densité des cellules qui composent la structure cellulaire 3D et les macros fidjiennes peuvent être utilisées pour quantifier la prolifération, l’invasion ou la migration des cellules dans chaque sphéroïde ou la migration des cellules dans chaque sphéroïde.
Les augmentations du noyau sphéroïde reflètent la stimulation de la prolifération cellulaire. Sur l’inhibition du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale, la grande majorité de la production d’ATP dans les mitochondries est compromise réduisant la prolifération de 20% après 72 heures. Le traitement au chlorure d’hydrogène améliore l’invasion du collagène de type I sur une période de 24 heures, mais réduit la zone migratoire des sphéroïdes 1,5 fois par rapport aux sphéroïdes non traités.
Tels qu’évalués par imagerie en direct, les sphéroïdes démontrent une dynamique interne élevée et se déplacent rapidement. La taille des sphéroïdes doit être relativement uniforme et il faut prendre soin de manipuler les sphéroïdes au centre des puits pour obtenir les meilleurs résultats d’imagerie. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier la prolifération des cellules tumorales, la migration et la mort ainsi que l’expression de matrice extracellulaire, de récepteurs cellulaires ou de protéines intracellulaires d’intérêt.
Les sphéroïdes peuvent également être encapsulés et l’effet de l’augmentation de la tension de surface cellulaire peut être étudié lors de l’enlèvement des capsules.
