Les sphéroïdes tumoraux 3D ont remplacé la technique conventionnelle de monocouche 2D en tant que référence pour la recherche in vitro sur le cancer. Ces modèles permettent la co-culture de plusieurs types de cellules qui reflètent l’hétérogénéité du microenvironnement tumoral et permettent l’exploitation d’interactions spatiales. Les avantages de l’utilisation de la méthode des gouttelettes suspendues pour générer des sphéroïdes 3D sont le manque d’interaction cellule-plastique et la facilité d’étudier l’interaction entre les cellules tumorales et les cellules non tumorales.
Cette technique fournit également un moyen reproductible et rentable de modéliser l’interaction tumeur-stromale. Les tumoroïdes 3D sont des modèles précliniques précieux et sont souvent utilisés comme outil de dépistage de drogues. Cette méthode peut être appliquée pour étudier les effets pharmacologiques de plusieurs composés sur la croissance tumorale et le microenvironnement environnant.
Le processus de formation des sphéroïdes est convivial et nécessite un équipement de laboratoire de culture cellulaire conventionnel. Les sphéroïdes peuvent être imagés à l’aide de n’importe quel microscope à lumière inversée de paillasse, et l’analyse de la taille et de la forme des sphéroïdes peut être effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images en ligne largement disponible. Pour commencer, retirez les lignées cellulaires tumorales Huh7 et Hep3B HCC et les lignées cellulaires de fibroblastes COS-7 et LX2 de leur rack de stockage dans de l’azote liquide et décongérez-les rapidement.
Après décongélation, diluer les cellules décongelées avec deux millilitres de milieu de culture frais. Centrifuger les cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de culture chaud et frais.
Ensuite, ensemencez les cellules dans des flacons de culture cellulaire T75 et incubez-les dans un incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les cellules atteignent 60 à 70 et confluence. Pour la collecte des cellules, aspirer le milieu de culture et laver les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, pour détacher les cellules adhérentes du fond des flacons, ajoutez deux millilitres de trypsine préchauffée et incubez à 37 degrés Celsius.
Après quatre minutes, inactiver la trypsine en ajoutant quatre millilitres de milieu de culture complet et recueillir la suspension cellulaire, puis centrifuger les cellules et jeter le surnageant avant de remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de culture frais. Enfin, ajoutez trois millilitres supplémentaires de milieu de culture frais. Pour compter les cellules, vortexez doucement la suspension cellulaire.
Ensuite, à l’aide d’une pipette de 10 microlitres, mélangez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec 10 microlitres de bleu trypan et pipetez doucement le mélange de haut en bas quatre fois pour assurer une coloration complète de la surface externe de la cellule avec le colorant. Ensuite, placez un couvercle sur la zone de comptage de l’hémocytomètre. Placez ensuite l’embout de la pipette contenant le mélange de cellules à côté du bord du couvercle et expulsez doucement le contenu de la pointe dans la glissière de comptage.
Après avoir attendu quelques minutes que la boue se dépose, fixez l’hémocytomètre sur la scène du microscope et comptez les cellules chevauchant la règle supérieure ou droite tout en évitant celles qui chevauchent la règle inférieure ou gauche. Enfin, calculez le nombre total de cellules à l’aide de cette formule. Après avoir aspiré le milieu de culture, lavez les cellules LX2 trois fois avec du PBS.
Détachez les cellules à l’aide de trypsine comme démontré précédemment et centrifugez-les. Après avoir compté les cellules comme démontré précédemment, ensemencez une fois 10 à la sixième cellule LX2 dans des plats de 10 centimètres cubes et incubez à 37 degrés Celsius. Après 48 heures, recueillir le milieu conditionné par les fibroblastes et centrifuger pour granuler les cellules flottantes.
Filtrer le milieu conditionné à l’aide d’un filtre de 0,22 micron attaché à une seringue de 20 millilitres. Ensuite, aliquotez le média dans deux tubes millilitres pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Ajouter 10 millilitres de PBS stérile au fond d’une antenne de 10 centimètres cubes pour fournir des conditions humides aux sphéroïdes.
Ensuite, suspendez 1 500 cellules HCC HuH7 avec 1 500 cellules de fibroblastes de mammifères COS-7 dans des gouttelettes suspendues pour former des sphères. Inverser le couvercle du plat pour permettre au milieu, y compris la suspension cellulaire, de pendre au-dessus d’un environnement humide. Après trois jours, pour prendre des images des sphéroïdes, mettez le plat sur la scène d’un microscope inversé et ajustez le grossissement à cinq fois.
Ensuite, ouvrez le logiciel de microscope sur l’ordinateur connecté et ajustez sa mise au point pour avoir une image claire de chaque sphéroïde. Utilisez ensuite l’outil d’accrochage du logiciel de microscope pour acquérir les images et enregistrer les images acquises. Ajouter 10 millilitres de PBS stérile au fond d’un plat de 10 centimètres cubes.
Suspendez ensuite 3 000 cellules Hep3B HCC dans les gouttelettes suspendues pour former des sphères et inverser le couvercle du plat permettant aux gouttelettes de pendre au-dessus d’un environnement humide pendant trois jours. Ensuite, transférez les sphéroïdes Hep3B dans 20 microlitres de milieux frais provenant de cellules LX2 dans des gouttelettes suspendues. Ensuite, inversez le couvercle du plat sur lequel les sphéroïdes sont formés et fixez le couvercle sur la scène d’un microscope optique.
Ajustez la mise au point fine du microscope pour rendre chaque sphéroïde visible comme démontré précédemment. Après avoir appuyé sur le bouton du piston pour vider soigneusement l’air de la micropipette, insérez l’embout de la pipette dans la gouttelette contenant le sphéroïde à transférer. Approchez-vous très près du sphéroïde sans le toucher avec la pointe.
Ensuite, relâchez doucement la pression sur le bouton du piston pour permettre l’aspiration du sphéroïde dans la pointe de la micropipette dans deux microlitres de média. Ensuite, transférez le sphéroïde dans une nouvelle gouttelette suspendue à un nouveau plat de 10 centimètres cubes. Prenez des images des sphéroïdes à un grossissement de cinq fois à l’aide d’un microscope inversé du jour du transfert jusqu’au septième jour de culture dans le milieu conditionné LX2.
Pour analyser les images des sphéroïdes en croissance, ouvrez chaque image sphéroïde dans un logiciel d’analyse d’images et utilisez l’outil de sélection à main levée pour décrire chaque sphéroïde. Ensuite, à partir du bouton déroulant analyse, sélectionnez Définir la mesure, puis la zone et appuyez sur OK. Ensuite, dessinez manuellement un cercle autour de chaque sphéroïde et une fois la sphère encerclée, appuyez sur Ctrl M pour permettre au programme de calculer la zone sphéroïde en pixels. Convertissez ensuite la zone du sphéroïde en volume à l’aide de cette formule.
Enfin, calculez la variation du volume sphéroïde par rapport à son volume le premier jour de la capture de l’image. Lors de l’optimisation de la densité cellulaire pour la formation de sphéroïdes, des densités d’ensemencement plus élevées de 12 000 et 6 000 cellules ont donné des sphéroïdes de forme asymétrique, tandis qu’une densité d’ensemencement de 3 000 cellules a donné un sphéroïde 3D arrondi parfait. Ainsi, 3 000 sphéroïdes de densité cellulaire ont été adaptés pour d’autres expériences.
L’évaluation longitudinale de l’impact prolifératif de la co-culture de lignées cellulaires tumorales et fibroblastiques a montré qu’à partir du quatrième jour, les sphéroïdes hétérotypiques se développaient dans une forme ronde idéale par rapport aux sphéroïdes homotypiques. Les sphéroïdes hétérotypiques ont d’abord montré une phase de croissance rapide à partir du quatrième au septième jour, suivie d’une phase plus lente au huitième jour. Le volume sphéroïde a ensuite diminué aux neuvième et 10 jours, reflétant peut-être l’épuisement des nutriments ou un noyau hypoxique et la mort cellulaire.
En revanche, les sphéroïdes homotypiques ont présenté une courbe de croissance relativement statique jusqu’au cinquième jour, suivie d’une augmentation progressive de leurs courbes de croissance à partir du sixième jour. Le taux de croissance plus élevé des sphéroïdes hétérotypiques suggère que le contact direct entre la tumeur et les fibroblastes augmente la taille des sphéroïdes tumoraux. Lorsque des sphéroïdes homotypiques Hep3B âgés de trois jours ont été cultivés dans des milieux frais, les cellules ont formé des sphéroïdes parfaitement arrondis après trois jours et ont montré une prolifération continue jusqu’au septième jour.
Le taux de croissance a été amélioré lorsque les sphéroïdes ont été maintenus dans des milieux conditionnés LX2, suggérant une prolifération de sphéroïdes tumoraux induite par les fibroblastes. Il est crucial de s’assurer que le BBS stérile est ajouté au fond de la vaisselle pour maintenir une condition humide appropriée pour la formation de sphéroïdes. Aussi, soyez prudent lors de l’inversion du couvercle afin que les sphéroïdes et les gouttelettes ne soient pas perturbés.
Les sphéroïdes tumoraux 3D peuvent être fixés ou congelés et stockés pour des applications futures telles que l’immunochimie ou l’immunofluorescence, ainsi que l’extraction d’ARN pour l’analyse transcriptomique. Les sphéroïdes hétérotypiques avec des cellules prémarquées peuvent être imagés et suivis pour fournir des informations sur les interactions cellule-cellule dans le microenvironnement tumoral.
