Notre protocole fournit au scientifique un outil puissant pour marier plusieurs micro-paramètres au niveau d’une seule cellule à partir de l’IPS humain et de leurs neuro et dérivés clairs. Ces protocoles permettent la gaieté des paramètres mitochondriaux, à la fois au niveau total et au niveau spécifique par volume mitochondrial, en utilisant la cytométrie de flux. Cette technique peut être appliquée à plusieurs types de cellules, y compris celles d’autres maladies neurodégénératives.
Ainsi, il peut ainsi aider à donner un aperçu des mécanismes derrière ces types de maladies et aussi potentiellement aider au dépistage thérapeutique. Pour commencer, ensemencez les cellules séparément dans quatre puits dans une plaque de six puits et incuber les cellules jusqu’à ce que la confluence soit atteinte de 50 à 60%. À la fin de la période de culture, préparer cinq solutions de coloration individuelles contenant différentes combinaisons de milieu de culture, FCCP, TMRE, MTG et mito sock spread.
Ajoutez-les dans les puits respectifs et incuber les cellules comme décrit dans le manuscrit. Ensuite, aspirez le milieu de tous les puits et lavez avec du PBS. Pour le décollement cellulaire, incuber les cellules avec un millilitre de réactif de dissociation cellulaire à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Neutraliser le réactif de dissociation cellulaire avec un millilitre de DMEM, complété par 10%FBS. Ensuite, recueillez le contenu du puits dans un tube chronique de 15 millilitres. Enduire les cellules par centrification et laver la pastille de cellule avec du PBS une ou deux fois.
Aspirer tout le surnageant, en laissant environ 100 microlitres dans le tube. Re-suspendre les granulés de cellule dans 300 microlitres de PBS. Après avoir transféré la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, maintenez le tube dans l’obscurité à température ambiante.
Analysez les cellules à l’aide du cytomètre en flux avec les paramètres de filtre passe-bande décrits dans le manuscrit texte. Détacher environ 1 million de cellules à l’aide du réactif de dissociation cellulaire et enduire les cellules comme démontré précédemment. Neutralisez la suspension cellulaire avec DMEM plus 10% FBS et recueillez la suspension dans un tube de 15 millilitres.
Fixez les cellules avec un millilitre de paraformaldéhyde à 1,6% à température ambiante pendant 10 minutes. Perméabolisez les cellules avec un millilitre de méthanol glacé à 90% froid à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, bloquez les échantillons dans un millilitre de tampon de blocage et lavez les cellules par centrifugation avec du PBS, comme démontré.
Pour détecter différents complexes et sous-unités mitochondriaux, incuber les cellules pendant 30 minutes avec les anticorps primaires respectifs décrits dans le manuscrit. Après avoir lavé les cellules une fois avec PBS, incuber les cellules avec un anticorps secondaire pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, laver et remettre en suspension les cellules et le PBS comme démontré.
Transférez la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, conservé dans l’obscurité sur de la glace. Ensuite, analysez les cellules du cytomètre en flux et détectez les signaux et filtrez-en un à l’aide d’un filtre passe-bande 5 30/30. Pour chaque sous-population cellulaire, sélectionnez un histogramme et analysez l’intensité médiane de fluorescence ou MFI des différents canaux filtrants.
Calculer les niveaux d’EMRT, les valeurs spécifiques pour la sous-unité complexe ROS MMP et TFAM, comme décrit dans le manuscrit textuel. La cytométrie en flux et les cellules vivantes ont été utilisées pour étudier le volume mitochondrial MMP et les niveaux de ROS. Dans les neurones POLG DA, une MMP spécifique inférieure et un ROS spécifique plus élevé ont été observés, tandis qu’aucun changement dans le volume mitochondrial, la MMP totale et le ROS.
Les astrocytes POLG avaient une diminution de la MMP, mais aucun changement dans le volume mitochondrial et les ROS. La cytométrie en flux et les cellules fixes ont été utilisées pour étudier le niveau de sous-unité complexe MRC et TFAM. Les neurones DA ont montré une augmentation du complexe un et de la TFAM par rapport au contrôle, mais aucun changement dans le niveau complexe deux.
Les astrocytes POLG ont montré une réduction du complexe un quatre et TFAM spécifique. Comme la densité cellulaire peut également influencer la MMP et la relation entre la fluorescence MTG et MMP, cela est spécifique à la cellule. L’adaptation de ce protocole à d’autres types de cellules nécessitera probablement une optimisation Après cette procédure, l’ASIS microscopique, par exemple la microcopie confocale, peut être effectuée, fournissant des détails supplémentaires sur les structures mitochondriales.
Ainsi, bien que cette stratégie détecte le dysfonctionnement mitochondrial dans les neurones DA et les astrocytes d’une maladie mitochondriale connue, ces techniques peuvent également être appliquées pour explorer la fonction mitochondriale dans tout type de cellule et de maladie.
