CR Harding a été pris en charge par la bourse d&#39;études WT086724 Wellcome Trust.

Une. Préparation de L. pneumophila de l&#39;infection <ol><li> Préparer le charbon de bois extrait de levure (CYE) des plaques (charbon de bois à 2 g / L actif, 10 g / L d&#39;extrait de levure, 13 g / L d&#39;agar-agar, 10 g / l de N-(2-acétamido)-2-aminothanesulfonic acide (ACES), une g / L α-cétoglutarate, 0,4 g / L de L-cystéine HCl et 0,25 g / l de pyrophosphate ferrique, pH 6,9). Remarque: Si nécessaire, ajouter de la kanamycine (25 pg / ml) et / ou le chloramphenicol (6 pg / ml) à Cye plaques. <ol><li> Effectuer tous L. travail pneumophila au niveau de confinement 2 biosécurité (BSL-2) dans une enceinte de sécurité microbiologique (MSC) dans le respect des règles locales. </li></ol></li><li> Série L. pneumophila partir de -80 ° C stocks de glycerol sur des plaques de CYE </li><li> Incuber les plaques pendant 4 jours à 37 ° C. Note: L&#39;incubation des plaques pendant 4 jours augmente considérablement la virulence de L. pneumophila dans G. mellonella sur incubation pendant 3 jours. </li><li> Un jour avant l&#39;infection, remettre en suspension un fu de bouclell de bactéries (contenant plusieurs colonies) dans 1 ml d&#39;préchauffé (37 ° C) ACES extrait de levure (AYE) de bouillon et de mesurer l&#39;absorbance à 600 nm (DO 600) à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. </li><li> Inoculer une culture 3 ml de AYE frais (avec des antibiotiques si nécessaire) à une DO finale 600 de 0,1. <ol><li> Inclure une des médias seulement contrôler pour garantir la stérilité des médias. </li></ol></li><li> Incuber à 37 ° C dans un incubateur à agitation par secousses à 200 tours par minute pendant 21 heures. Remarque: Les bactéries sont cultivées à la phase post-exponentielle de l&#39;infection 38. De plus en plus pendant 21 heures permet expériences pour être normalisés. Remarque: Si nécessaire pour induction de protéines, ajouter 0,5 mM isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) durant la nuit. </li><li> Mesurer la DO 600 (bactéries doivent être en phase de croissance post-exponentielle, OD 600 2,5-3). </li><li> Diluer la culture bactérienne pour donner 1 x 10 9 CFU / ml dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco stérile (D-PBS). Remarque: Sur la base des résultats antérieurs, une DO 600 de 1 correspond à 1 x 10 9 UFC / ml, mais cela doit être confirmé pour différentes L. souches pneumophila. Remarque: si l&#39;induction d&#39;une protéine à partir d&#39;un plasmide est nécessaire, ajouter de l&#39;IPTG 1 mM pour l&#39;inoculum. </li><li> Plaque de l&#39;inoculum comme décrit dans l&#39;article 9 comme un contrôle pour assurer la CFU attendu est présent dans l&#39;inoculum. </li></ol> 2. Préparation des larves <ol><li> Achetez suffisante G. mellonella larves d&#39;un fournisseur commercial. Les larves sont expédiés à l&#39;étape 5 e ou 6 e stade (environ entre 2-3 cm de longueur) et sont adaptés à l&#39;utilisation immédiatement. Note: Une méthode décrivant comment à l&#39;arrière larves a été décrit précédemment 39. Remarque: Les larves peuvent être entreposés à la température ambiante pendant jusqu&#39;à deux semaines, ce qui ne nécessite pas l&#39;alimentation. Jeter immédiatement les larves montrant des signes de la nymphose. </li><li> Préparer le contenant pour larve par plaction d&#39;un cercle de 10 cm de papier-filtre dans le fond d&#39;une boîte de Petri de 10 cm. </li><li> En utilisant des pinces à bout émoussé, placer dix larves saines de taille à peu près similaire dans la boîte de Pétri. Remarque: Jeter les insectes de couleur brune ou couperosées recherche malsaines. Larves saines sont uniformément de couleur crème avec des pas de zones de coloration foncée et sont capables de se redresser rapidement si remis. </li></ol> 3. Infection de G. mellonella larves <ol><li> Préparer la plate-forme d&#39;injection en collant un cercle de papier filtre sur la surface. </li><li> Fixez solidement la pointe d&#39;un P1000 horizontalement sur le papier filtre pour créer une plate-forme d&#39;injection. Cela n&#39;a pas besoin d&#39;être stérile. </li><li> Stériliser une seringue microtitration de 20 ul en aspirant 70% d&#39;éthanol et en incubant pendant au moins 10 min. <ol><li> Porter ponction preuve gants lors de l&#39;injection, </li></ol></li><li> Retirez tout éthanol résiduel par aspiration et l&#39;expulsion de l&#39;eau stérile à plusieurs reprises. </li><li> Using la seringue, aspirer 10 pi du L. pneumophila 1 x 10 9 UFC / ml suspension. </li><li> Prenez une larve et doucement mais fermement tourner sur le dos, penché sur la pointe de la P1000. </li><li> Placer l&#39;embout de la seringue sur le devant, fausse-patte droite de la larve. </li><li> Doucement, insérez la pointe de l&#39;aiguille dans la fausse-patte, en s&#39;assurant qu&#39;il est à l&#39;intérieur des larves, et en douceur injecter la totalité du contenu de la seringue. Remarque: Si la seringue est insérée correctement, il devrait être possible de ramasser les larves en utilisant uniquement la seringue pour le placer dans la chambre. <ol><li> Après l&#39;injection, observer les larves pendant quelques secondes. Les larves se met à ramper au bout de quelques secondes, mais ne devrait pas excréter fluide. </li></ol></li><li> Observer brièvement les larves de quelques heures après l&#39;infection, l&#39;infection de 10 7 UFC L. pneumophila 130b ne provoque pas de symptômes dans le premier 5-8 h pi Par conséquent, si les larves sont en train de gris / noir avant ce point, til l&#39;expérience doit être interrompu. Remarque: L&#39;inoculation de larves avec 1 mM d&#39;IPTG n&#39;affecte pas la viabilité des larves au cours de l&#39;expérience. </li><li> De la même façon, injecter un total de 10 larves par 10 larves état comprenant une injection de D-PBS pour servir de contrôle pour analyser la mortalité des larves. </li><li> Bande des boîtes de Pétri fermées et placer dans un confinement secondaire. </li><li> Incuber dans un incubateur bactérien standard à 37 ° C, pendant toute la durée de l&#39;expérience. </li></ol> 4. Le prétraitement des larves avec un inhibiteur chimique <ol><li> Avant l&#39;infection, préparer les larves pour injection comme décrit dans la section 3.1 à 3.6. </li><li> Injecter 10 ul d&#39;une solution 100 uM de cytochalasine D à l&#39;avant, fausse-patte de 10 larves poste. Remarque: Inhibiteur est injecté dans une fausse-patte différente de la suspension bactérienne pour réduire les blessures aux larves. </li><li> Injecter 10 ul de DMSO à 10 larves de témoin. </li><li> Incuber larves à37 ° C pendant 4 heures. </li><li> Injecter larves prétraité comme décrit dans l&#39;article 3 à l&#39;avant, à droite Proleg avec soit 1 x 10 7 UFC de WT L. pneumophila ou un contrôle PBS. </li></ol> 5. Analyse de la mortalité des larves <ol><li> À 18 h post infection (pi), d&#39;examiner toutes les larves infectées de la mortalité. </li><li> Pour vérifier la mortalité, utiliser des pinces à bout émoussé de remettre les larves et regarder pour le mouvement des jambes, les larves saines devrait se redresser rapidement. Pigmentation indique une réaction immunitaire à l&#39;infection. S&#39;il ya un mouvement, compter aussi vivant. </li><li> Un nombre record de larves mortes et vivantes. </li><li> Répétez ce processus à tous les autres points de temps choisis. Remarque: Si l&#39;incubation est poursuivie pendant plus de trois jours, les nymphes peut être vu. Retirez tout pupes et euthanasier par congélation à - 20 ° C, avant la métamorphose peut se produire. </li></ol> 6. Extraction de l&#39;hémolymphe <ol><li> Choisir au hasard troisles larves et les placer dans un tube de 14 ml à des moments choisis, tels que 5 et 18 heures pi, </li><li> Placer ce tube sur de la glace pendant 5 à 10 min, jusqu&#39;à ce que aucun mouvement des jambes de la larve peut être observée. </li><li> Placer les larves anesthésiés sur une boîte de Petri et, à l&#39;aide d&#39;un scalpel, une incision entre les deux segments proches de la queue de la larve. </li><li> Pressez les larves dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse stérile pour recueillir l&#39;hémolymphe. <ol><li> Piscine hémolymphe d&#39;au moins trois personnes. Un larves donne entre 15-50 ul d&#39;hémolymphe selon la taille. Remarque: Au cours de l&#39;extraction de l&#39;hémolymphe il est très facile de perturber l&#39;intestin, entraînant une contamination des échantillons. Réduire la contamination en réduisant les larves près de la queue (loin de l&#39;intestin), cependant, le choix des antibiotiques sera toujours nécessaire lorsque l&#39;étalement de la bactérie. Remarque: Pour éviter l&#39;hémolymphe de brunir et de coagulation, processus dans l&#39;hémolymphe 10 min après la collecte. </li></ol></li><li> Jeter le corps de la larve dans un nouveau 14 ml tube Falcon, joint et au lieu de - 20 ° C pendant la nuit pour assurer les larves sont morts. </li><li> Autoclave larves mortes et éliminer conformément aux réglementations locales. </li></ol> 7. Détermination de la viabilité hémocytaire <ol><li> Extraire hémolymphe comme décrit ci-dessus. </li><li> Mélanger 20 ul d&#39;hémolymphe a extrait avec 20 ul de 0,02% (v / v) de bleu trypan dans du PBS dans un puits d&#39;une plaque à 96 puits. </li><li> Incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Charge de 10 ul d&#39;hémolymphe sur un hémocytomètre et compter les cellules viables (pas bleu). </li><li> Comptez chaque échantillon en trois exemplaires pour réduire les erreurs. </li></ol> 8. Traitement des Extrait hémocytes pour immunofluorescence Microscopie <ol><li> Mélanger l&#39;hémolymphe mis en commun extraite à partir d&#39;au moins trois des larves et la pipette sur une lamelle de verre de 10 à 15 mm dans une plaque à 24 puits. Remarque: Lamelles de ne nécessitent pas de traitement comme hémocytes peut adhérer au verre. </li><li> Ajouter 0,5 ml de D-PBS et bien mélanger par aspiration et refoulement. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 10 min à 500 x g à la température ambiante (RT) en utilisant un support de plaque de la centrifugeuse étanche aux aérosols. </li><li> Examiner chaque puits en utilisant un microscope inversé à vérifier que les hémocytes ont adhéré. </li><li> Retirer soigneusement le surnageant et laver les cellules trois fois en ajoutant 0,5 ml de D-PBS à la paroi du puits, en faisant tourner la plaque 2 à 3 fois et à éliminer le D-PBS avec une pipette. </li><li> Fixer les cellules par addition de 0,5 ml de 4% (v / v) de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS. </li><li> Incuber les cellules pendant entre 20 à 30 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du D-PBS, comme précédemment. </li><li> Ajouter 0,5 ml de 15 mM de NH 4 Cl dans une solution PBS pour étancher PFA résiduel et incuber à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du D-PBS. Remarque: A ce stade, les lamelles peuvent être stockées pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Ajouter 0,5 ml de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS et incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour perméabiliser les cellules. </li&gt; <li> Bloc pendant 1 heure avec une solution de blocage (2% (p / v) de BSA dans du PBS). </li><li> Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité avec l&#39;anticorps primaire dilué dans la solution de blocage à la dilution indiquée par le fabricant. </li><li> Laver 3 fois avec PBS. </li><li> Incuber pendant 1 heure avec l&#39;anticorps secondaire et du DAPI pour la visualisation des bactéries comme ci-dessus. </li><li> Laver 3 fois avec PBS. </li><li> Monter les lamelles à l&#39;aide d&#39;une goutte de réactif de montage sur des lames de verre. </li><li> Incuber une nuit dans l&#39;obscurité à la température ambiante pour sécher complètement la solution de montage. </li><li> Image en coulisse sur un microscope à fluorescence. </li></ol> 9. Quantification des bactéries UFC <ol><li> Ajouter 100 ug / ml de spectinomycine pour Cye plaques pour éviter la contamination par la flore intestinale. L. souche pneumophila 130b est naturellement résistant à la spectinomycine 40. </li><li> Avant l&#39;extraction de l&#39;hémolymphe, peser 1,5 ml tubes de centrifugation. </li><li> Extrait hémolymphe comme décrit dans l&#39;article 6 et placer dans un t peséubes, ajouter 1 pl de 5 mg / ml digitonine, bien mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante pour lyser hémocytes. </li><li> Peser à nouveau le tube avec l&#39;hémolymphe et déterminer le poids de l&#39;hémolymphe extrait. </li><li> Effectuer dix dilutions en série de pliage de l&#39;hémolymphe dans les médias de AYE stérile. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un stylo, diviser la base d&#39;une plaque de CYE en six secteurs et étiquette égales. </li><li> Plate trois gouttes de 25 ul de chaque dilution (en commençant par la plus diluée) dans chaque section de la plaque. </li><li> Incuber les plaques avec les couvercles UPMOST nuit à 37 ° C. </li><li> Une fois que les gouttes ont séché complètement, tournez la plaque sur et incuber à 37 ° C pendant au moins deux jours supplémentaires. </li><li> Quantifier les bactéries extraites par comptage des colonies à chaque dilution et pour normaliser au poids de l&#39;hémolymphe extrait. </li></ol> 10. Détermination de l&#39;indice de compétition (IC) <ol><li> Vérifiez que les deux souches se développent aussi bien dans le bouillon de culture et sur des plaques d&#39;agar CYE prior de tenter l&#39;indice de compétitivité. </li><li> Préparer des suspensions bactériennes mutantes résistantes WT ou kanamycine comme décrit dans la section 1 et mélanger dans un rapport de 1:1. <ol><li> Plate dilutions en série de l&#39;inoculum sur CYE spectinomycine (100 ug / ml) et CYE spectinomycine / kanamycine </li></ol></li><li> Infecter les larves et extrait hémolymphe à des points de temps appropriés tels que décrits ci-dessus. </li><li> Déterminer les numérations viables par extraction hémolymphe et étalant des dilutions en série sur CYE spectinomycine et CYE spectinomycine / kanamycine. </li><li> Calculer l&#39;indice concurrentiel (CI) comme suit: CI = (sortie mutant sortie / WT) / (inoculum mutant / WT inoculum). </li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Modèle larvaire La Galleria de Legionella pneumophila infection est un outil utile pour les études in vivo de la pathogenèse. Ici, il est indiqué qu&#39;un certain nombre d&#39;aspects de l&#39;infection des macrophages peut être récapitulé dans le G. modèle de mellonella, y compris le rôle de la Dot / Icm T4BSS dans la virulence et la réplication bactérienne et la localisation de la Dot / Icm effecteur SIDC. De plus, nous démontrons que un inhibiteur chimique de polymérisation de l&#39;actine réduit significativement la mortalité des larves, mimant les résultats obtenus dans macophages 47 et les preuves que l&#39;internalisation des bactéries est nécessaire pour provoquer la mortalité des larves. Auparavant, il a été démontré que les variations de virulence entre L. souches pneumophila vu dans d&#39;autres modèles d&#39;infection peuvent être vérifiés dans G. mellonella et que l&#39;induction de facteurs de virulence en phase de croissance post-exponentielle est requis pour la virulence bactérienne <sup&gt; 36, ce qui confirme que G. mellonella est un modèle adapté à L. infection d&#39;pneumophila. La détermination de la CFU de L. pneumophila de larves infectées soit seuls, soit dans les infections mixtes accroît fortement l&#39;utilité du modèle. Auparavant, plusieurs facteurs ont été découvertes qui ont des effets subtils sur la replication bactérienne dans un ou plusieurs modèles d&#39;infection 29,48-51. Bien que les larves ne possèdent pas de système immunitaire adaptatif, la présence de la réponse immunitaire innée sélection fournit plus forte par rapport à eux seuls les macrophages, qui peuvent servir à amplifier les phénotypes subtiles. Par conséquent, il est possible que, bien que ces souches ne seront probablement pas affecter de manière significative la mortalité des larves, ils peuvent démontrer diminué réplication bactérienne ou remise en forme dans le G. modèle de mellonella. Ainsi que la réplication de L. pneumophila dans les larves, nous avons montré un appauvrissement important hémocytaire la fin de l&#39;infection. Comme L.pneumophila est prévu pour lyser des cellules hôtes, à la fin de son cycle de replication, la mesure de l&#39;épuisement hémocytes peuvent également servir de mesure indirecte de la replication bactérienne. Hémocyte épuisement a déjà été corrélée à la mortalité des insectes dans l&#39;infection 3,52, bien que des résultats récents suggèrent que cette situation est plus complexe que la première belived 37. Récemment, il a été montré que la famine de larves entraîne une augmentation de la susceptibilité à l&#39;infection par une suppression des réponses immunitaires 53. Dans les essais décrits ici, les larves n&#39;ont pas été nourris pendant la durée de l&#39;étude et on ne sait pas à quel point larves nourries répondrait à L. infection d&#39;pneumophila. L&#39;un des avantages de G. mellonella en tant qu&#39;organisme modèle est la facilité d&#39;extraction et la quantification des hémocytes de larves infectées. Vidéos antérieures ont montré diverses méthodes pour extraire les hémocytes d&#39;insectes 54,55 Cependant, le METhod présenté ici est simple et approprié pour un traitement immédiat. Une fois extrait, hémocytes peuvent être facilement quantifiés, utilisés pour l&#39;immunofluorescence, microscopie électronique à transmission 36 ou 56 cytométrie de flux ou de culture et infectées ex vivo 3 permettant la réponse des cellules à l&#39;infection à étudier en détail. Ceci augmente considérablement la souplesse du modèle. Une mise en garde à l&#39;immunofluorescence dans G. mellonella est l&#39;offre limitée d&#39;anticorps validé contre G. protéines mellonella. Cependant, des études ont démontré la création d&#39;anticorps contre les protéines larvaires 57 et des anticorps dirigés contre des protéines immunitaires liées humains ont été trouvés à reconnaître G. protéines mellonella 11 démontrant la possibilité d&#39;immunofluorescence sur G. hémocytes de mellonella. La facilité de G. infection mellonella permet écrans de débit rapide, moyenne qui pourraitêtre utilisé pour comparer la virulence de diverses espèces et souches de Legionella et pourrait être utilisé pour analyser en outre des facteurs de virulence identifiés précédemment telles que des molécules d&#39;adhérence ou 58 le système de sécrétion de type 2 59 qui sont requis pour la virulence dans d&#39;autres modèles. En outre, l&#39;utilisation de ce modèle permet en outre l&#39;identification et la caractérisation de nouveaux facteurs de virulence, y compris des protéines effectrices sécrétées et une translocation. Récemment, il a été montré que l&#39;activité de la phospholipase C L. pneumophila a un rôle dans G. mellonella virulence 60 et que le point / Icm protéine effectrice SDHA est requis pour la virulence 37. En outre, nous avons récemment démontré qu&#39;il existe une corrélation entre les phénotypes observés dans G. mellonella et dans la souche de souris A / J 37. Cela souligne la valeur cet outil pour compléter protozoaire environnement et hôte unicellulaire et murimodèles d&#39;infection de ne. Le G. modèle de mellonella deviendra encore plus précieux à l&#39;avenir, une fois la séquence génomique larvaire sera disponible et des outils génétiques sont plus en place. Mesures dans ce sens comprennent la récente publication des détails du transcriptome lié au système immunitaire 61 et la formation d&#39;une initiative visant à faire progresser l&#39;inactivation de gène chez les Lépidoptères spp 62. En utilisant G. larves de mellonella, nous avons un certain nombre de lectures simples et rapides de la virulence bactérienne qui peuvent être utilisés pour étudier la pathogenèse de L. pneumophila. Mise en place de ces tests et le dépistage plus large de L. souches pneumophila sérogroupe et d&#39;accroître l&#39;utilité de ce nouvel outil et contribueront à notre compréhension de L. pneumophila pathogenèse.

Des modèles animaux de l&#39;infection sont avérés extrêmement précieux dans la détermination des facteurs de virulence bactérienne. Cependant, les modèles d&#39;invertébrés ont gagné une attention accrue comme une alternative viable aux modèles traditionnels de mammifères de l&#39;infection. Les larves de la fausse teigne Galleria mellonella est de plus en plus utilisé pour étudier un certain nombre d&#39;agents pathogènes humains importants, y compris les bactéries Gram-positives et Gram-1 négatifs 2,3 et plusieurs champignons pathogènes 4,5. En utilisant un modèle d&#39;insecte possède un certain nombre d&#39;avantages par rapport aux modèles de mammifères traditionnelles, un invertébré, G. mellonella n&#39;est pas soumis aux limitations éthiques de modèles de mammifères. En outre, les larves peuvent être facilement maintenue, infecté par injection sans anesthésie, subit un traitement préalable avec des inhibiteurs chimiques 6 et à maintenir l&#39;incubation à 37 ° C 7. Fait intéressant, une bonne corrélation entre le pouvoir pathogène de plusieurs micro-organismes dans G. mellonella et modèles de mammifères de l&#39;infection a été créé 2,8. La compréhension accrue du système immunitaire de G. mellonella a également contribué à la caractérisation de cet organisme modèle. Bien que les insectes n&#39;ont pas un système immunitaire adaptative que l&#39;on trouve chez les mammifères, ils ont les défenses cellulaires et humérus sophistiqués, y compris la production de peptides antimicrobiens 9. Hémocytes sont le principal médiateur de défenses cellulaires et sont les plus nombreux types de la cellule trouvée dans l&#39;hémolymphe (ou de sang) de G. mellonella 10, Ces cellules sont des phagocytes professionnels et exercent des fonctions analogues à des macrophages et des neutrophiles humains à la fois prenant et bactéries dégradant dans un compartiment de phagocytose lysosomale 10,11 et formant des nodules autour de l&#39;invasion des bactéries, limiter physiquement la réplication bactérienne 12. Legionella pneumophila est un agent pathogène respiratoire qui entraîne pneumoni graveun (maladie du légionnaire) dans les populations sensibles comme les personnes âgées ou immunodéprimées 13. Legionella se trouve ubiquitaire dans les sources d&#39;eau à la fois l&#39;environnement et l&#39;homme, où il est un agent pathogène de diverses espèces de frais amibes d&#39;eau 14,15. Legionella survit et reproduit dans ces phagocytes professionnels en utilisant un complexe multi-protéique appelé Dot / Icm (défectueux dans le trafic des organites de multiplication / intracellulaire) de type 4 système de sécrétion (T4SS) permettant de transférer plus de 275 protéines effectrices dans la cellule hôte 16-20. Ces protéines servent à contourner les voies phagocytaires de la cellule hôte normales, conduisant à la création de la Legionella contenant des vacuoles (LCV). Le LCV évite la fusion avec les lysosomes et recrute réticulum endoplasmique place (ER) des vésicules dérivées, résultant dans un compartiment spécialisé qui ressemble le RE rugueux 21,22. L. pneumophila est considéré comme un chemin humaine accidentelledu fibrinogène; les mêmes stratégies qui lui permettent de se répliquer au sein des amibes, permettent également la réplication dans les macrophages alvéolaires humains 23. Hôtes mammifères ont été caractérisés comme des modèles d&#39;infection humaine Legionella y compris les souris et les cobayes 24,25. Cependant, la majorité des souches de souris résistantes à l&#39;infection à Legionella 26 à l&#39;exception de l&#39;albinos consanguine souris A / J, qui développe une auto-limitation de l&#39;infection bénigne 24. Bien que le modèle Guinée de porc ressemble davantage à la maladie humaine 25, le manque de mutants et augmentation des coûts décourage leur utilisation 27. En outre, plusieurs modèles d&#39;invertébrés ont été développés pour Legionella pneumophila infection y compris Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 et plusieurs espèces d&#39;amibes 30-32. Cependant, ces modèles ont des faiblesses, de la virulence de la C. elegans </em&gt; Système n&#39;est pas Dot / Icm-dépendante 28, ce qui limite l&#39;utilité de ce modèle. Le modèle drosophile a prouvé son efficacité dans l&#39;étude des facteurs de virulence bactérienne 29 et semble prometteuse cependant, ce modèle n&#39;a pas été pleinement caractérisé. Amibes unicellulaires sont les hôtes de l&#39;environnement de L. pneumophila et sont idéales pour l&#39;étude de l&#39;action de facteurs de virulence au niveau moléculaire 33 manquent cependant plusieurs médiateurs importants de la réponse de la cellule hôte de mammifère à une infection telle que caspases 34. Les faiblesses des modèles existants, ainsi que le coût élevé et les préoccupations éthiques liées à l&#39;expérimentation de mammifère, a conduit à la recherche d&#39;autres organismes modèles appropriés 29,35. Nous avons récemment démontré que G. mellonella est un modèle adapté à L. pneumophila pathogenèse 36,37. Ce protocole détaille les techniques expérimentales utilisées pour infectertion G. larves de mellonella, analyse morale larvaire, l&#39;extraction hémocytes pour le comptage et l&#39;immunofluorescence et la détermination de la réplication par UFC viable compte de larves infectées.

<table border="1">
 <tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material/ Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ACES yeast extract (AYE) broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g &alpha;-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* 
		 *add sterile ingredients after autoclaving</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6526 </td>
			<td>0.6 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile cysteine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td>3.3 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>G. mellonella (waxworms)</td>
			<td>Livefood UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Legionella LPS</td>
			<td>Cambridge Biosciences</td>
			<td>PA1-7227 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG Alexa488</td>
			<td>Jackson Immunoreach</td>
			<td>711-485-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Biomol International</td>
			<td>BML-T109-0001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td>[header]</td>
 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microtiter Syringe</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24544</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell counter, double, Improved Neubauer </td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0926</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifuging plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viable cell counting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puncture-proof glove</td>
			<td>Turtleskin </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
 </tbody>
 </table>

use of galleria mellonella as a model organism to study legionella pneumophila infection

Legionella pneumophila, l&#39;agent causal d&#39;une pneumonie sévère nommé la maladie du légionnaire, est un important agent pathogène humain qui infecte et se réplique dans les macrophages alvéolaires. Sa virulence dépend du système Dot / Icm de type IV de la sécrétion (T4SS), ce qui est essentiel pour établir une vacuole permissive de réplication connu sous le nom de Legionella contenant des vacuoles (LCV). L. infection pneumophila peut être modélisée chez la souris mais la plupart des souches de souris ne sont pas permissive, ce qui conduit à la recherche de nouveaux modèles d&#39;infection. Nous avons récemment montré que les larves de la fausse teigne Galleria mellonella sont adaptés pour l&#39;étude de L. infection d&#39;pneumophila. G. mellonella est de plus en plus utilisé comme un modèle d&#39;infection par des agents pathogènes humains et une bonne corrélation existe entre la virulence de plusieurs espèces bactériennes chez l&#39;insecte et dans des modèles de mammifères. Un élément clé de défenses immunitaires, les larves sont hémocytes, professionphagocytes al, qui prennent et détruisent les envahisseurs. L. pneumophila est capable d&#39;infecter, former un LCV et se répliquer dans ces cellules. Ici, nous démontrons protocoles d&#39;analyse L. pneumophila dans la virulence G. modèle de mellonella, y compris la façon de cultiver L. infectieuse pneumophila, prétraiter les larves avec des inhibiteurs, infecter les larves et comment extraire les cellules infectées pour la quantification et la microscopie d&#39;immunofluorescence. Nous décrivons également comment quantifier la réplication bactérienne et remise en forme dans les analyses de la concurrence. Ces approches permettent la sélection rapide de mutants pour déterminer des facteurs importants en L. pneumophila virulence, décrivant un nouvel outil pour aider notre compréhension de ce pathogène complexe.

Ici il est démontré que G. mellonella est une réponse appropriée, facile à utiliser modèle pour étudier L. infection d&#39;pneumophila. Auparavant, il a été montré que L. virulence pneumophila dans les macrophages, les amibes et les modèles de mammifères est dépendante de la présence du système de sécrétion de Dot / Icm 41 à 43. G. larves de mellonella ont été infectées comme décrit ci-dessus et la virulence de la souche sauvage (WT) et une souche de point / Icm déficiente comparée. Infection à 10 7 UFC de L. souche pneumophila 130b entraîné une mortalité de 100% dans les 24 heures post-infection (pi). Cependant, le L. souche pneumophila Δ DotA, qui ne dispose pas d&#39;un système fonctionnel de la sécrétion Dot / Icm T4SS, était virulent dans cet essai (Figure 1). Ceci démontre que L. pneumophila virulence dans G. mellonella dépend de la translocation des effecteurs Dot / Icm, faisant de ce modèle adapté pour la caractérisation desla fonction de ces protéines. Récemment, il a été montré que l&#39;inhibition de la phagocytose par traitement de la cytochalasine augmenté susceptibly des larves à l&#39;infection par des levures Candida albicans 6. Comme L. pneumophila est un pathogène intracellulaire, il a été décidé de déterminer si l&#39;absorption de la bactérie est crucial dans la pathogénie dans ce modèle. Les larves ont été prétraitée avec 10 ul de 100 uM de cytochalasine D (CyD) pendant 4 h à 37 ° C, puis infectées avec 10 7 CFU de L. WT pneumophila 130b et la mortalité suivie à 24 h pi traitement avec l&#39;inhibiteur seul n&#39;a pas d&#39;incidence sur la survie des larves. Toutefois, préalablement traité, les larves infectées affiché survie significativement plus importante (p = 0,0066, test t non apparié) par rapport à du DMSO-traitée, les insectes infectés (Figure 2). L&#39;effet du traitement a été abolie par CyD 48 h pi (résultats non présentés), ce qui peut être dû à la demi-vie du médicament dans G.mellonella. Ceci démontre que l&#39;absorption de L. pneumophila dans G. mellonella hémocytes est un aspect crucial de la virulence bactérienne. Afin de valider l&#39;expression et de déterminer la localisation subcellulaire d&#39;une protéine effectrice dans G. mellonella, hémocytes ont été extraites et traitées pour la microscopie d&#39;immunofluorescence. Les larves ont été infectées par le WT et Δ Dota L. pneumophila 130b expression d&#39;un fragment de l&#39;effecteur T4SS bien définie, SIDC 41-918, fusionné à 4 étiquettes N-terminaux HA. Cette effecteur a été démontrée pour lier le LCV via un domaine phospho-4-phosphate liaison 44. Utilisant des anticorps anti-HA (rouge) et anti-légionelles (vert) anticorps, 4HA-SIDC 41-918 localisée au LCV dans les hémocytes infectés (Figure 3). Cette localisation a été démontré précédemment dans la amibes Dictyostelium discoideum et dans les macrophages de mammifères 44,45 confirmant la comparability de ce modèle. L&#39;importance des protéines de virulence est généralement déterminée en comparant la cinétique de type sauvage et mutantes de bactéries croissance. Afin de suivre la cinétique de réplication bactérienne au cours de l&#39;infection, trois larves ont été sacrifiés à chaque point de temps (0, 5, 18, et 24 h pi), l&#39;hémolymphe recueilli et mis en commun et la CFU/0.1g d&#39;hémolymphe extrait déterminé. Après une baisse initiale à 5 h pi, l&#39;UFC des bactéries WT augmente jusqu&#39;à 24 h pi Toutefois, la souche Δ Dota subit pas de réplication et est effacé à 18 h pi (Figure 4). La capacité de L. pneumophila pour provoquer la lyse des macrophages de manière T4SS dépendant depuis longtemps documenté 46, mais pas d&#39;études similaires ont été réalisées in vivo. La concentration des hémocytes circulants a été déterminée à 5, 18, et 24 h pi larves ont été infectées par le WT ou Δ <em&gt; Dota L. pneumophila 130b, hémocytes extraits d&#39;insectes infectées et les cellules viables comptées en utilisant la méthode d&#39;exclusion au bleu trypan. À 5 h pi pas de différence de nombre de hémocytes entre les souches pourrait être considéré (Figure 5). Cependant, à 18 h pi il y avait une baisse significative de la concentration en hémocytes dans WT, mais pas Δ DOTA, larves infectées. Cette différence a persisté à 24 h pi La baisse du nombre d&#39;hémocytes, combinée à la présence de bactéries intracellulaires comme on le voit par immunofluorescence, suggère que L. pneumophila réplique à l&#39;intérieur hémocytes puis les lyse, permettant aux bactéries de se soumettre à plusieurs cycles de réplication. <img alt="Figure 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;infection par L. pneumophila induit Dot / Icm dépendant mortalité larvaire. 10 larves ont été infectées avec du PBS seul ou 10 <sjusqu&#39;à&gt; 7 CFU de type sauvage (WT) ou Δ Dota L. pneumophila 130b, incubées à 37 ° C pendant 72 heures et l&#39;heure de la mort des larves enregistrée. Toutes les larves infectées par le WT a succombé à l&#39;infection dans les 24 heures post-infection (pi), mais pas de mortalité a été observée chez les larves inoculées avec du PBS seul ou la souche Δ DOTA. Les résultats sont la moyenne de trois expériences distinctes, ± écart-type. <img alt="Figure 2" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" /> Figure 2. La mortalité dépend de l&#39;internalisation bactérienne. 10 L. pneumophila larves ont été prétraités avec 10 pi de 100 uM cytochalasine D (CyD) pour 4 heures à 37 ° C alors infecté par 10 7 WT et la mortalité suivie à 24 h pi larves prétraité démontré de façon significative (P = 0,0066, test t apparié) réduit mortalité. Les résultats représentent la mean de quatre expériences indépendantes ± écarts-types avec 10 larves par état. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" /> Figure 3. imagerie par immunofluorescence des protéines effectrices dans les hémocytes extraits. hémocytes ont été extraites à partir de larves infectées par L. pneumophila 130b WT ou Δ Dota exprimer 4HA-SIDC 41-918 à 5 h cellules pi ont été colorées en utilisant anti-HA (rouge) et anti-légionelles (vert) et DAPI anticorps tache d&#39;ADN (bleu) pour visualiser les noyaux. 4HA-SIDC 41-918 a été observée WT environnante, mais pas Δ DOTA, les bactéries. La barre d&#39;échelle 5 um. <img alt="Figure 4" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" /> Figure 4. L. pneumophila reproduit dans G. mellonella manière Dot / Icm-dépendante. larves ont été infectés par pneumophila WT ou Δ Dota L. et à 0, 5, 18, ​​et 24 h pi l&#39;hémolymphe de trois insectes infectés communs, plaqué sur des plaques de CYE et la CFU déterminé et normalisée à l&#39;inoculum et à la masse de l&#39;hémolymphe extrait. WT L. pneumophila répliqué au cours de l&#39;expérience alors que la souche Δ DotA a été autorisé dans les 18 h Résultats pi sont la moyenne de trois expériences distinctes ± écart-type. <img alt="Figure 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;infection par le WT L. résultats pneumophila dans la destruction des hémocytes importante. hémocytes ont été extraites à 5, 18, ​​et 24 h pi de larves infectées par pneumophila WT ou Δ Dota L. et cellules viables comptés en utilisant un hémocytomètre. Aucune différence dans l&#39;nombre de cellules a été observée à 5 h pi entre les souches mais à 18 h pi seulement environ 15% des hémocytes rester chez les larves infectées par la souche WT par rapport à la souche Δ DOTA. Les résultats sont la moyenne de trois expériences distinctes, ± écart-type.

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Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

La larve de la fausse teigne Galleria mellonella a récemment été créé comme un modèle in vivo pour étudier Legionella pneumophila infection. Ici, nous démontrons techniques fondamentales pour caractériser la pathogenèse de Legionella dans les larves, y compris l&#39;inoculation, la mesure de la virulence bactérienne et la réplication ainsi que l&#39;extraction et l&#39;analyse des hémocytes infectés.

Utilisation d&#39;<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Comme un organisme modèle pour l&#39;étude<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Maladies infectieuses

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

40.0K vues.  Imperial College London.  La larve de la fausse teigne Galleria mellonella a récemment été créé comme un modèle in vivo pour étudier Legionella pneumophila infection. Ici, nous démontrons techniques fondamentales pour caractériser la pathogenèse de Legionella dans les larves, y compris l'inoculation, la mesure de la virulence bactérienne et la réplication ainsi que l'extraction et l'analyse des hémocytes infectés. 

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Recherche

Immunologie et infection

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

L&#39;utilisation de moyen d&#39;expectoration artificielle pour tester l&#39;efficacité des antibiotiques contre<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

L&#39;insecte<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Comme un modèle d&#39;infection puissant pour étudier la pathogenèse bactérienne

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Cecal ligature et ponction induite Sepsis comme un modèle pour étudier autophagie chez les souris

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilisation d&#39;<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Pour étudier les interactions de l&#39;autophagie cytosquelette

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of nitrate to nitrite by gut and salivary bacteria. However, in other mammalian studies, high nitrite levels do not cause birth defects, although they can lead to poor reproductive outcomes. Thus, the teratogenic potential of nitrite is not clear. It would be useful to have a vertebrate model system to easily assess teratogenic effects of nitrite or any other chemical of interest. Here, we demonstrate the utility of zebrafish (Danio rerio) to screen compounds for toxicity and embryonic defects. Zebrafish embryos are fertilized externally and have rapid development, making them a good model for teratogenic studies. We show that increasing the time of exposure to nitrite negatively affects survival. Increasing the concentration of nitrite also adversely affects survival, whereas nitrate does not. For embryos that survive nitrite exposure, various defects can occur, including pericardial and yolk sac&#160;edema, swim bladder noninflation, and craniofacial malformation. Our results indicate that the zebrafish is a convenient system for studying the teratogenic potential of nitrite. This approach can easily be adapted to test other chemicals for their effects on early vertebrate development.

Exposure to teratogens may cause birth defects. Zebrafish are useful for determining the teratogenic potential of chemicals. We demonstrate the utility of zebrafish by exposing embryos to various levels of nitrite and also at different times of exposure. We show that nitrite can be toxic and cause severe developmental defects.

Poisson zèbre comme modèle pour évaluer le potentiel tératogène de nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila membrane externe Vésicules: Isolement et analyse de leur potentiel pro-inflammatoire sur Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...