Ce travail a été soutenu par le NIH subventions P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, à AMK Choi. S. Ryter a reçu l&#39;appui de salaire de l&#39;Institut Respiratoire Lovelace.

Note: Le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux à l&#39;Hôpital Brigham and / Harvard Medical School Zone de femmes a approuvé les procédures suivantes. Une. Cecal ligature et ponction Utilisez la souris de la même origine (C57BL / 6), de sexe masculin, âgé de 8-10 semaines. Des souris femelles sont plus résistantes que les hommes contre la létalité induite par le sepsis. Souris âgées de 8 semaines donnent des résultats moins variables que les souris plus jeunes en termes de survie après CLP. Environ n = 10 souris par groupe par rapport devraient être utilisés pour l&#39;analyse de la survie. N = 3-5 souris est suffisant pour les essais de l&#39;autophagie. <ol><li> Utilisez de petits instruments chirurgicaux stériles (à savoir de scalpel, ciseaux et des pinces anatomiques franches), qui devrait être approprié pour la chirurgie des rongeurs. </li><li> Préparer le mélange anesthésie: A 7,95 ml de PBS ajouter 150 ul de xylazine (injection AnaSed 100 mg / ml) et 700 ul de kétamine (Ketaset &#160; CIII, 100 mg / ml). </li><li> Pour assurer des conditions d&#39;asepsie au cours de la procédure, porter des gants, masque et blouse chirurgicale. </li><li> Peser les animaux. Anesthésier les injecter par voie intrapéritonéale (ip), le mélange mentionné dans l&#39;étape 3 dans un dosage de pl (10x de poids corporel en g). Par exemple, pour une souris de 22 g, gérer 10x22 = 220 ul du mélange anesthésique. Ainsi, les doses finales de xylazine et de kétamine est de 17 et 80 mg / kg de poids corporel, respectivement. Assurez-vous que l&#39;anesthésie est suffisante, pas de flexion du membre doit être produite après pincement de l&#39;orteil. Remarque: Utilisez pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. </li><li> Placer les animaux sur une surface de travail propre sur leur dos. Tails et les pattes postérieures sont orientés vers l&#39;enquêteur. Désinfectez la peau de l&#39;abdomen de l&#39;alcool (solution EtOH 70%) Note:. Zone chirurgicale doit être complètement rasé, pour éviter la contamination de la plaie par le contact avecfourrure. En outre, de façon optimale, un tampon de circulation d&#39;eau chaude doit être utilisée pour maintenir la normothermie de souris anesthésiées au cours de la chirurgie. </li><li> En utilisant un scalpel, faire une petite incision cutanée longitudinale parallèle et environ 1 cm à gauche de la ligne médiane. Ne pas pénétrer encore dans la cavité péritonéale. Utilisez de petits ciseaux pour prolonger l&#39;incision initiale. </li><li> Identifier les muscles abdominaux et les disséquer pour accéder dans la cavité péritonéale. </li><li> En utilisant des pinces anatomiques émoussés, identifier le caecum et le déplacer en dehors de la cavité péritonéale. Veillez à ne pas endommager les vaisseaux sanguins mésentériques (ce qui pourrait entraîner une hémorragie mortelle). </li><li> Ligaturer à 60% du caecum pour atteindre une septicémie à mi-pente. Ligaturer égale ou supérieure à 75% du caecum se traduit généralement par une septicémie à haute teneur, tandis que la ligature égale ou inférieure à 25% des résultats de caecum dans un sepsis de bas grade. Veillez à ne pas ligaturer la valvule iléo-colique (ce qui pourrait bloquer la continuité intestinale). </li><li> En utilisant un21 G aiguille, perforer le caecum par une ponction par-et-par (deux trous) à proximité de la ligature. La direction de la perforation doit être de la mésentérique à la face anti-mésentérique du caecum. Veillez à ne pas percer les vaisseaux sanguins mésentériques. </li><li> Retirez l&#39;aiguille. Appuyez doucement sur le caecum ligaturé pour confirmer la perméabilité à travers les deux trous, mais seulement une petite quantité de matières fécales doit être extrudé à travers eux. </li><li> Déplacez le caecum ligaturé et percé dans la cavité péritonéale. Note: Pour les souris de faux, sauter les étapes 01.10 au 01.12. </li><li> Utilisez soie sutures chirurgicales 6-0 à la fine aiguille pour fermer la musculature abdominale. Utilisez soie sutures chirurgicales 6-0 à la fine aiguille pour fermer la peau abdominale. </li><li> Injecter 1 ml préchauffé (37 ° C) ip de solution saline normale pour remplacer la chaleur et l&#39;hydratation perdue au cours de la procédure. Placez la souris sous une lampe chauffante jusqu&#39;à leur réanimation. Remarque: Dans l&#39;idéal, un dispositif de réchauffement plus sûr (such comme un tampon d&#39;eau chaude circulant) peut être utilisé à la place d&#39;une lampe de chaleur. </li><li> Après l&#39;opération injecter buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel sc.) Pour obtenir une analgésie. Remarque: Un animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;elle ait repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Un animal qui a subi un traitement chirurgical ne doit pas être retourné à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à ce que complètement rétabli. </li><li> Placez animaux retour dans leurs cages avec un accès illimité à la nourriture et de l&#39;eau. Souris seront euthanasiés quand ils deviennent moribonds (indiqué par des signes cliniques tels que le défaut de se déplacer quand on les touche ou cyanose). Vérifiez souris toutes les 4 heures pour éviter d&#39;avoir mourir avant l&#39;euthanasie. </li></ol> 2. Tissu de récolte et de fixation <ol><li> Préparer un paraformaldéhyde 4% (PFA) solution: Pour 889 ml de PBS ajouter 111 ml de 37% de PFA. </li><li> Sacrifier des souris en utilisant soit CO 2 narcose induite ou kétamine / xylazine slution dans un dosage élevé. </li><li> Immobiliser la souris sur une surface de travail propre. Pulvériser la peau abdominale et thoracique avec une solution de EtOH à 70% pour la désinfecter. </li><li> Utilisation d&#39;un scalpel et de petits ciseaux pour enlever la peau abdominale et thoracique, ainsi que la peau recouvrant la région de la trachée. </li><li> Révéler la trachée en enlevant ses tissus environnants (muscles et du tissu conjonctif). </li><li> Placez un fil de suture (sans aiguille coupe) autour de la trachée. Ne serrez pas encore. </li><li> Utilisez un petit cathéter veineux périphérique (20 G) de la trachée &quot;de intubate. Soyez prudent lors de l&#39;insertion du cathéter pour éviter la déchirure de la trachée. A noter que le plus grand diamètre de la trachée est juste au-dessous du cartilage cricoïde. </li><li> Serrer la suture autour de la trachée / cathéter. Retirer l&#39;aiguille ne laissant que la canule en matière plastique du cathéter dans la trachée. Aiguille servi comme un guide-fil pour l&#39;insertion de la canule en plastique. </li><li> Après s&#39;être assuré de la canule en plastique dans la trachée, couper ee musculature abdominale, ouvrir l&#39;abdomen et de révéler la membrane. </li><li> En utilisant une aiguille, la perforation de la membrane pour produire un pneumothorax (c.-à-insertion de l&#39;air dans la cavité pleurale). Poumons doivent ensuite être réunis. </li><li> L&#39;utilisation de petits ciseaux, enlever le diaphragme, couper le long du sternum (sternotomie), enlever la cage thoracique et de révéler le cœur et les poumons. </li><li> Grâce à la canule en matière plastique inséré dans la trachée, les poumons fixer avec la solution de formaldéhyde de moins de 30 cm H 2 à la pression d&#39;entrée-sortie. </li><li> Retirez les poumons et les placer dans la PFA 4% pendant 24 heures et ensuite en solution à 70% EtOH jusqu&#39;à la transformation. </li><li> Identifier et éliminer cœur, le foie et les reins. De la même manière, placez-les dans le PFA 4% pendant 24 heures et ensuite en solution à 70% EtOH jusqu&#39;à la transformation. </li></ol> 3. Souris GFP et visualisation de GFP Diapositives <ol><li> Effectuer CLP et une intervention chirurgicale fictive sur des souris GFP-LC3 comme décrit à l&#39;étape 1, et la procédure post-opératoires comme décrit à l&#39;étape 2 du protocole. </li><li> Incluez les tissus (notamment les poumons, le cœur, le foie et les reins) dans de la paraffine et les couper en série 5 sections um. </li><li> Lorsqu&#39;il est prêt pour la GFP coloration, laisser incuber à 60 ° C pendant 30-60 min jusqu&#39;à ce que des masses fondues de paraffine et de tissu translucide apparaît. </li><li> Déparaffiner avec la série standardisé et calibré de xylène ou substituts de xylène, 5 min xylène 1, 2, xylène et le xylène 3 puis 3 min incubations en série graduée de EtOH: 100%, 95%, 75%, puis rincer à l&#39;eau distillée. Remarque: Après déparaffinage éviter la dessiccation du tissu, ce qui augmente l&#39;échantillon fond. </li><li> Effectuer la récupération de l&#39;antigène en utilisant un tampon d&#39;acide citrique (10 mM d&#39;acide de citrate de sodium, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), par micro-ondes pendant 10 à 20 min. Soyez prudent de remplacer périodiquement tampon pour éviter la dessiccation du tissu. </li><li> Laisser refroidir la solution pendant 20 min sur le banc pour compléter la recherche d&#39;antigène. </li><li> Lavez 2-3x avec PBS. Enlever l&#39;excès de tampon et transfer glisse de grille à une position horizontale dans une boîte de glissement ou autre chambre humide pour éviter la dessiccation. </li><li> Bloquer 45 à 60 min à température ambiante avec 10% de sérum d&#39;âne normal (également 5% d&#39;albumine de sérum bovin, ou de préférence du sérum de l&#39;animal dans lequel l&#39;anticorps secondaire a été généré) dans du PBS. </li><li> Incuber les échantillons à l&#39;anticorps primaire de la GFP à une dilution de 1:100 dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C en chambre humide. Appliquez doucement de petits morceaux de Parafilm sur le tissu avec un anticorps pour favoriser le contact homogène avec le tissu et éviter l&#39;évaporation. Note: Les étapes restantes sont effectuées à température ambiante. </li><li> Laver 5x avec du PBS pour éliminer l&#39;anticorps primaire excès. Incuber avec l&#39;anticorps secondaire 1:500-1:1,000 dans du PBS pendant 1 à 2 h à température ambiante. </li><li> Laver 5x avec du PBS pour éliminer l&#39;anticorps secondaire excès. Si on le désire, contre-colorer les lames à cette étape. </li><li> Si en utilisant un anticorps secondaire fluorescent, incuber 0,1% de noir du Soudan dans EtOH à 70% fou de 15 à 20 min afin de réduire l&#39;autofluorescence. Essuyez l&#39;excès de noir du Soudan du monde tissu et laver 5x avec PBS pendant 20 min. </li><li> Montez échantillon avec lamelle et stocker horizontalement, jusqu&#39;à ce que la solution de montage a mis. </li></ol> 4. Alternative Protocole: Détection directe de la GFP-LC3 <ol><li> Cathétériser et gonfler les poumons avec un ~ 500 ml de 50/50 v / v octobre PBS. </li><li> Incluez dans l&#39;OCT en mettant une petite quantité de l&#39;OCT dans le fond d&#39;un cryomoule. </li><li> Placez délicatement le complexe du poumon disséqué dans le moule. </li><li> Geler lentement sur methylbutane refroidis avec de la glace sèche. </li><li> Ajouter plusieurs PTOM jusqu&#39;à ce que le tissu est complètement couvert et gelé. Garder sur la glace sèche et conserver à -80 ° C. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cryomicrotome, couper 5-10 um sections épaisses qui protègent les sections de la lumière. sections de magasins et le reste de tissus à -80 ° C. </li><li> Pour préparer des diapositives pour l&#39;imagerie, retirez la section du congélateur et appliquer immédiatement une baisse de PBS pour éviter la dessiccation. </li><li> Fixer pendant 30 min à 4% PFA. Laver avec du PBS. </li><li> Appliquer DAPI / Hoechst pendant 10 min. Laver 3 fois avec PBS. </li><li> Montez échantillon avec lamelle et stocker horizontalement, jusqu&#39;à ce que la solution de montage a mis. </li><li> Image à l&#39;aide épifluorescence ou microscope confocal. Conserver les échantillons à 4 ° C pour jusqu&#39;à un mois. </li></ol> 5. Préparation des tissus pour la microscopie électronique <ol><li> Couper les tissus en environ 1 mm cubes pour la fixation. </li><li> Fixer le tissu dans 2% de formaldehyde, 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon 0,1 M de cacodylate de sodium, pH 7,4. </li><li> Laver avec un tampon de cacodylate de sodium à 0,1 M pendant 1-2 heures. Remarque: le tissu fixe peut être stockée dans 0,1 M de cacodylate de sodium à 4 ° C. </li><li> Poster correctif dans 1% de tétroxyde d&#39;osmium dans de sodium 0,2 M tampon cacodylate pendant 1 heure. </li><li> Rincer dans du tampon cacodylate de sodium 0,2 M pendant 10 mn 3x. </li><li> Déshydrater dans EtOH à 70%, 20 min 2x. Déshydrater dans 90% EtOH, 10 min 2x. Déshydrater dans EtOH à 100%,2x 20 min. </li><li> Incuber avec l&#39;oxyde de propylène (époxy propane) pendant 10 min 2x. </li><li> Incuber avec le mélange de résine d&#39;oxyde de propylène / époxy (50:50) pendant 1 heure. Le mélange de résine époxy est: Agar 24 g de résine de 100, 13 g de l&#39;anhydride dodécénylsuccinique, 13 g d&#39;anhydride méthylnadique et 1 ml de N-benzyldiméthylamine. Bien mélanger dans un récipient jetable à l&#39;aide d&#39;une spatule en bois. </li><li> Incuber avec Epoxy nuit de résine dans des flacons non plafonnés (ce qui permet tout oxyde de propylène restant s&#39;évaporer). </li><li> Incluez dans des capsules marquées avec de la résine fraîchement préparé. Polymériser à 60 ° C pendant 48 heures. </li><li> des coupes de tissus de photographie à l&#39;aide d&#39;un microscope électronique à transmission à 80 ou 60 kV sur un film en microscope électronique. Imprimer les images sur du papier photographique ou stocker médias numériques. </li><li> Analyser formation autophagosome dans des cellules intactes contenant noyau. Les champs de faible puissance (e. G. 2,000-4,000 X) peuvent être utilisés pour identifier les cellules nucléées. Typiquement 6,800-10,000 X images sont utilisées pour eest la quantification autophagosome. Comptez autophagosomes par unité de surface de 15 à 30 champs de représentation statistique appropriée. Autophagosomes ont une structure à double membrane, où autophogosomes à un stade avancé ressemblaient vacuoles remplies. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents à déclarer

Le principal avantage de CLP est qu&#39;il permet aux chercheurs d&#39;étudier la septicémie de différents niveaux de gravité (c&#39;est à dire de faible à moyenne et haute qualité). La gravité de la septicémie induite est affecté par la longueur du caecum ligaturé (dont le déterminant le plus important), la taille de l&#39;aiguille utilisée pour percer et le nombre de trous 15 réalisés. En outre, la souche de souris et le sexe peut avoir une incidence sur la gravité de la septicémie...

Septicémie, une réponse inflammatoire systémique à l&#39;infection, représente une des principales causes de décès chez les patients gravement malades 1. Infections intra-abdominales, conduisant souvent à une septicémie polymicrobienne, compte pour 20% des cas de septicémie, qui ont une mortalité importante de jusqu&#39;à 60% 2. la mortalité associée au sepsis résulte principalement de dysfonction d&#39;organes multiples avec défaillance organique ultérieure 3,4. Complément d&#39;enquête dans le mécanisme pathogène de cette maladie est urgent de promouvoir le développement de thérapies nouvelles et plus efficaces. La méthode ligature du caecum et à la perforation (CLP) est une procédure couramment utilisée pour la modélisation sepsis in vivo. Comme le caecum est pleine de bactéries, les résultats de ponction dans péritonite polymicrobiens, la translocation de bactéries dans le sang (bactériémie), le choc septique, la dysfonction d&#39;organes multiples et, finalement, la mort 5. Il est généralement admis que CLP reflète cliniquela réalité avec plus de précision que les techniques antérieures, telles que l&#39;injection d&#39;endotoxine ou de bactéries, même purifiés à des rongeurs, ainsi CLP est considéré comme l&#39;étalon-or (mais pas sans limites) 6 pour l&#39;induction expérimentale, et donc, l&#39;enquête de la pathogenèse de la septicémie. Dans cette monographie, nous décrivons les protocoles visant à évaluer si les mécanismes pathogènes de la septicémie comprennent l&#39;autophagie. L&#39;autophagie, un processus cellulaire évolutif conservé, facilite le renouvellement des protéines et des organites tels que les mitochondries endommagées et joue un rôle important dans la clairance des pathogènes intracellulaires, y compris les bactéries 7,8. Au cours de l&#39;autophagie, des protéines ou des organites cytoplasmiques sont séquestrés dans des vésicules à double membranaires appelées autophagosomes, qui sont ensuite livrées aux lysosomes pour la dégradation 9. Plusieurs protéines ont été identifiées comme des homologues mammifères de gènes liés autophagy-(ATG),initialement identifiées dans la levure, qui réglemente le processus de l&#39;autophagie. La conversion de la chaîne légère associée aux microtubules protéines 1 3B (LC3B) (homologue de Atg8) de LC3B-I (forme libre) à LC3B-II (forme de phosphatidyléthanolamine-conjugué) représente une étape importante dans la formation autophagosome 9. Dysfonction autophagie est associée au vieillissement et les maladies humaines telles que le cancer et les maladies neurodégénératives 10. En outre, autophagy affecte l&#39;immunité innée et adaptative tel que la présentation d&#39;antigène, le développement des lymphocytes et la sécrétion de cytokines par les cellules immunitaires 8. Ainsi, il semble raisonnable que l&#39;autophagie pourrait également jouer un rôle dans la réponse inflammatoire systémique à l&#39;infection (c&#39;est à dire dans le sepsis). A ce jour plusieurs méthodes ont été décrites pour évaluer le rôle de l&#39;autophagie des blessures des tissus in vivo. Ceux-ci comprennent l&#39;utilisation de souris exprimant la protéine de fluorescence verte (GFP)-LC3 et la quantification de l&#39;automobilephagosomes dans les tissus par microscopie électronique (ces deux méthodes sont décrites dans cette monographie). D&#39;autres méthodes incluent la quantification de l&#39;expression de la protéine autophagique dans les homogénats de tissus, et l&#39;analyse des flux autophagique (comme décrit ailleurs) 11-13. L&#39;objectif de cette étude est de fournir les protocoles actuels pour évaluer l&#39;autophagie in vivo dans le cadre de la septicémie expérimentale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

La septicémie expérimentale peut être induite chez des souris en utilisant la méthode (CLP), qui provoque une septicémie à germes multiples ligature caecale et ponction. Ici, il est prévu un protocole d&#39;induire sepsis de gravité variable chez les souris en utilisant la technique de la CLP. Autophagy est une réponse du tissu fondamental au stress et à l&#39;invasion de pathogènes. Deux protocoles actuels pour évaluer autophagy in vivo dans le cadre de la septicémie expérimentale sont également présentés ici. (I) Les souris transgéniques exprimant la protéine de fluorescence verte de la protéine (GFP)-LC3 fusion sont soumis au règlement CLP. Amélioration localisée du signal de la GFP (puncta), telle que déterminée soit par des dosages immunohistochimiques ou confocale, peut être utilisé pour détecter la formation de autophagosome améliorée et, par conséquent, l&#39;activation de la voie modifiée autophagy. (II) Enhanced vacuole autophagique (autophagosome) formation par aire unitaire de tissu (en tant que marqueur de stimulation autophagy) peut être quantifiée en utilisant la microscopie électronique. L&#39;étude des réponses autophagiques à la septicémie est un échantillon critiqueonent de comprendre les mécanismes par lesquels les tissus répondent à l&#39;infection. Les résultats des recherches dans ce domaine peuvent finalement contribuer à la compréhension de la pathogenèse de la septicémie, ce qui représente un problème majeur en médecine de soins intensifs.

Bactériémie est présent chez la souris dès 6 heures après la septicémie CLP-induite 14. Les signes cliniques de septicémie (y compris des frissons, tachypnée et l&#39;activité motrice facultés affaiblies) apparaissent environ 12 heures après la procédure. Souris soumis au règlement CLP commencent à mourir autour de 18 heures après l&#39;induction de la péritonite. Le plus grave est la septicémie le plus augmenté est la létalité 15. Dans le détail, la septicémie haute qualité ...

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Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

La septicémie expérimentale peut être induite chez des souris en utilisant la méthode (CLP) ligature caecale et ponction. Les protocoles actuels pour évaluer autophagy in vivo dans le cadre de la sepsie induite par CLP sont présentés ici: Un protocole pour la mesure en utilisant des souris autophagy (GFP)-LC3, et d&#39;un protocole de mesure de la formation de autophagosome par microscopie électronique.

Cecal ligature et ponction induite Sepsis comme un modèle pour étudier autophagie chez les souris

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K vues.  Brigham and Women's Hospital.  La septicémie expérimentale peut être induite chez des souris en utilisant la méthode (CLP) ligature caecale et ponction. Les protocoles actuels pour évaluer autophagy in vivo dans le cadre de la sepsie induite par CLP sont présentés ici: Un protocole pour la mesure en utilisant des souris autophagy (GFP)-LC3, et d'un protocole de mesure de la formation de autophagosome par microscopie électronique. 

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Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for establishing new therapeutic approaches in this field. Therefore, animal models are required that are able to closely mimic the human disease and also sufficiently deal with scientific questions. The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. In this model, a small stent is surgically inserted into the ascending colon of mice or rats leading to a continuous leakage of intestinal bacteria into the peritoneal cavity. The procedure results in peritonitis, systemic bacteraemia, organ infection by gut bacteria, and systemic but also local release of several pro- and anti-inflammatory cytokines. The lethality of CASP can be controlled by the diameter of the inserted stent. A variant of this model, the so-called CASP with intervention (CASPI), raises opportunity to remove the septic focus by a second operation according to common procedures in clinical practice. CASP is an easily learnable and highly reproducible model that closely mimics the clinical course of abdominal sepsis. It leads way to study on questions in several scientific fields e.g. immunology, infectiology, or surgery.

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. This article describes the surgical procedure of CASP. The CASP model and its variants allow the systematic investigation of various problems concerning the subject of sepsis.

Colon ascendens stent péritonite (CASP) - un modèle standardisé pour sepsis abdominal polymicrobienne

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

Recherche

Immunologie et infection

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilisation d&#39;<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Comme un organisme modèle pour l&#39;étude<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Maladies infectieuses

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilisation d&#39;<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Pour étudier les interactions de l&#39;autophagie cytosquelette

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation de queue peau d&#39;étudier allogéniques CD4 réponses des cellules T chez la souris

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Un modèle de souris contrôlée pour infection polymicrobienne néonatale

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Conception de la ligation et de la perforation et de l'infection intranasale Double modèle de l'immunosuppression induite par la septicémie

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Utilisation de l'invertébré Galleria mellonella comme modèle d'infection pour étudier le complexe mycobacterium de tuberculose

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...