Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts de recherche en santé du Canada (numéro de subvention MOP 38040) à R.K., de la Muscular Dystrophy Association (É.-U.) à R.K., de Families of SMA à R.K. et L.M.M, de The SMA Trust à T.H.G. et de The Muscular Dystrophy Campaign à T.H.G.. L.M.M est titulaire d’une bourse postdoctorale de la Société canadienne de la sclérose en plaques et R.K. est titulaire d’une chaire universitaire de recherche en santé de l’Université d’Ottawa.

Toutes les procédures doivent être effectuées selon les normes de soins aux animaux établies par l’établissement.
1. Dissection de la musculature abdominale de la souris
<ol><li>Avant de commencer, constituer 4 % de paraformaldéhyde (PFA). Attention : Gardez toujours le PFA dans une hotte et portez l’équipement de protection approprié.</li>
	<li>Euthanasier la souris par une méthode approuvée. Remarque : La souris montrée dans la vidéo a été euthanasiée par surdosage de CO2 et luxation cervicale. Cette souris est une souris de type sauvage de 4 semaines sur un fond hybride CD1/C57Bl6. Cette souris a été élevée dans les installations pour animaux de l’Université d’Ottawa à partir de souris achetées à l’origine.</li>
	<li>Faites une incision initiale à travers la peau au niveau de la hanche et coupez à travers la peau tout autour de la souris.</li>
	<li>Décollez la peau, en tirant vers le haut jusqu’à ce que vous atteigniez le niveau des membres antérieurs.</li>
	<li>Coupez la musculature abdominale au niveau de la hanche et continuez l’incision jusqu’à ce que vous atteigniez la colonne vertébrale.</li>
	<li>À ce stade, commencez à couper vers le haut à travers la musculature et les côtes jusqu’à ce que vous atteigniez le membre supérieur.</li>
	<li>Coupez directement jusqu’à ce que vous atteigniez la colonne vertébrale de l’autre côté.</li>
	<li>Coupez vers le bas jusqu’à ce que vous atteigniez le point où vous avez commencé.</li>
	<li>Relâchez le diaphragme par le dessous (en prenant soin de ne pas endommager le muscle TVA) et placez-le dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de dissection recouverte de SYLGARD avec des broches de dissection de 0,2 mm.</li>
	<li>Épinglez la cage thoracique et la musculature associée dans le plat, côté superficiel vers le haut, en vous assurant que le muscle est complètement étiré.</li>
	<li>Versez le PBS 1x et remplacez-le par 4% PFA.</li>
	<li>Couvrir et laisser sur une plate-forme à bascule à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Laver 3x en 1x PBS à température ambiante pendant 10 min.</li>
</ol>* À ce stade, les muscles fixes peuvent être laissés dans un réfrigérateur pendant la nuit avant la dissection ultérieure.
2. Isolement du muscle TVA
<ol><li>Pour procéder à l’isolement du muscle TVA, sous un microscope de dissection, commencez par couper à travers le muscle oblique externe au niveau des dernières côtes (voir la figure 1 pour un guide annoté).</li>
	<li>Coupez tout droit à côté de la linea alba (en prenant soin de ne pas couper à travers la TVA ci-dessous) jusqu’à ce que vous atteigniez le début du muscle oblique interne.</li>
	<li>Ensuite, coupez à travers pour libérer les abdominis rectus en cours et les muscles obliques externes de la partie supérieure de la TVA ci-dessous.</li>
	<li>Retirez le vaisseau sanguin et toute graisse qui en est trop du muscle TVA.</li>
	<li>Relâchez le muscle de la dernière côte terrestre.</li>
	<li>Couper autour des marges du muscle et retirer à une plaque de 24 puits contenant pbs.</li>
</ol>3. Étiquetage immunofluorescent et microscopie du muscle TVA
Pour toutes les étapes suivantes, retirez le liquide à l’aide d’une pipette à pointe fine et laissez la plaque sur une plate-forme à bascule. Sauf indication contraire, toutes les étapes suivantes sont effectuées à température ambiante.
<ol><li>Incuber dans du PBS contenant 1:1 000 bungarotoxine marquée par fluorescence pendant 30 min pour étiqueter les NMJ. Cela peut être fait dans une pièce sombre ou sous papier d’aluminium.</li>
	<li>Perméabiliser le muscle en ajoutant 300 μl par puits de Triton X-100 à 2% dans du PBS et laisser sur une plate-forme à bascule pendant 30 min.</li>
	<li>Incuber dans le réactif de blocage (4% BSA, 1% Triton dans PBS) pendant 30 min.</li>
	<li>Incuber dans un réactif bloquant contenant des anticorps primaires (neurofilament 1:100; protéine de vésicule synaptique 2, 1:250) à 4 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Laver 3x dans 1x PBS.</li>
	<li>Incuber dans pbs contenant 1:250 anticorps secondaire pendant 2-4 heures.</li>
	<li>Laver 3x dans 1x PBS.</li>
	<li>Montez les muscles sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage fluorescent et d’une lame de couverture suffisants.</li>
	<li>Il est préférable de visualiser les lames à l’aide d’un filtre passe-bande double sur un microscope épifluorescent standard.</li>
	<li>Les NMJ sont mieux entrés à l’aide d’une projection en série z sur un microscope confocal équipé d’au moins un objectif 40X.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette vidéo, nous avons détaillé un protocole pour la dissection du muscle TVA de la souris et pour le étiquetage immunofluorescent de montage entier des NMJs dans le muscle. Nous présentons également des données montrant que ce muscle peut être utilisé pour analyser la pathologie de jonction neuromusculaire dans un modèle murin de SMA.
Le succès de cette technique dépend d’un certain nombre de facteurs. Certains des problèmes les plus courants sont décrits ci-dessous. Tout d’abord: mauvaise coloration immunohistochimique. Il peut y avoir un certain nombre de raisons à cela, l’une des plus courantes étant l’utilisation de différents réactifs à ceux énumérés dans ce protocole. Un PFA de qualité de microscopie électronique de haute qualité est très important pour assurer une bonne coloration, de même que le choix des anticorps énumérés dans ce protocole. De plus, chez les animaux plus âgés(c’est-à-dire> 3 mois), il peut être plus difficile d’obtenir une coloration de bonne qualité. Cela est dû à l’augmentation de l’épaisseur du fascia entourant le muscle et à l’augmentation de l’accumulation de graisse entre l’oblique externe et tranversus abdominis. Il est important de dépouiller la graisse, avant de procéder à l’immunofluorescence. Il peut également être nécessaire de retirer une partie du fascia recouvrant le muscle, qui peut s’épaissir. Il est parfois difficile de dépouiller le fascia et la graisse du muscle sans encourir des dommages à la fibre musculaire et une perturbation du modèle d’innervation. Cependant, si cette technique est effectuée avec soin, une coloration de bonne qualité peut être acquise chez des souris jusqu’à l’âge d’au moins 1 an. Chez les souris plus jeunes(c’est-à-diremoins de 3 mois), il ne devrait pas être nécessaire d’effectuer des taquineries ou des séparations de fibres musculaires. Deuxièmement : difficile en trouvant nmjs après dissection et souillure. C’est souvent parce que la dissection ne s’est pas étendue sous la dernière côte. La majorité des NMJs sont situés juste sous la dernière côte et donc des précautions doivent être prises pour s’assurer que cette partie du muscle est incluse dans la dissection. Troisièmement: l’adhérence du muscle OT au muscle TVA. Il s’agit souvent d’une plainte lorsque les individus tentent de prolonger la dissection au-dessous du niveau du muscle oblique interne (IO). La zone du muscle TVA où l’OI est également présente est plus difficile à analyser car il peut être difficile de distinguer quel muscle est lequel. Pour cette raison, nous disséquons régulièrement la partie la plus supérieure du muscle TVA. À ce niveau, il n’y a pas d’adhérence entre les muscles EO et TVA, et donc cela ne devrait pas être un problème important.
Un obstacle important à l’utilisation du muscle TVA, par rapport aux muscles appendiculaires, est l’accessibilité pour les manipulations chirurgicales ou l’injection de substances. Ces types d’expériences peuvent être cruciaux pour étudier la physiologie nmj dans un muscle donné. Bien que la TVA soit certainement moins facilement accessible que les muscles plus couramment utilisés tels que les tibialis antérieurs ou gastrocnémieux,des travaux antérieurs ont montré qu’il est possible de dénerver la TVA par lésion chirurgicale des nerfs intercostaux18. Nous avons récemment également utilisé ce muscle pour l’administration locale de substances sous anesthésie générale (données non publiées). Bien que ces expériences puissent représenter un défi technique modéré, ce travail montre qu’elles sont réalisables et étendent ainsi l’utilité de ce muscle pour l’analyse des NMJs sous manipulation pathologique et physiologique.
Le muscle TVA est l’un des nombreux muscles plats minces situés dans tout le corps qui peuvent être utilisés pour l’analyse de montage entier des modèles d’innervation. D’autres muscles comprennent un groupe de muscles crâniens innervés par des motoneurones provenant du noyau facial du tronc cérébral, englobant le levator auris longus, auricularis superior,et adducteur auris longus,dont les dissections ont été décrites précédemment14,19. En outre, la musculature entourant le muscle TVA, y compris EO, IO, et rectus abdominis, peut également être étiquetée et utilisée pour l’analyse NMJ. Pour une analyse complète de la pathologie NMJ dans un modèle murin, il est important de considérer un certain nombre de muscles situés dans tout le corps et de ne pas restreindre l’analyse à un seul muscle. Ceci est illustré dans les modèles murins de maladies des motoneurones où il y a une hétérogénéité significative dans les niveaux de pathologie NMJ entre différents muscles20. Une telle variabilité intermusculaire est un outil extrêmement précieux lors de l’étude du mécanisme de vulnérabilité des motoneurones et, par conséquent, restreindre l’analyse à un seul muscle pourrait réduire considérablement le potentiel de la recherche.

Les jonctions neuromusculaires (NMJs) sont la connexion synaptique entre un motoneurone inférieur et une fibre musculaire squelettique. Ils sont traditionnellement considérés comme une synapse tripartite, composée d’un neurone (terminal présynaptique), d’une fibre musculaire (terminal post-synaptique) et d’une cellule terminale de Schwann1. Les NMJ semblent être des cibles précoces et significatives en pathologie dans une gamme de maladies des motoneurones et de modèles murins2,3. Les symptômes typiques comprennent la dénervation, où la plaque d’extrémité du moteur devient dépourvue d’une innervation présynaptique, un gonflement du terminal présynaptique et une réduction de la complexité de la morphologie NMJ4-11. Des réponses compensatoires peuvent également être notées, qui incluent la germination terminale et nodale, où les processus axonaux s’étendent des bornes synaptiques restantes ou des entre-nœuds aux plaques d’extrémité énervées réinnervées12,13. En raison de la corrélation étroite entre l’activité synaptique et la morphologie de NMJ, beaucoup d’informations peuvent être gagnées au sujet du statut fonctionnel des neurones moteurs de l’analyse de la morphologie de NMJ. Comme la perte de NMJs représente fréquemment l’un des premiers aspects de la pathologie neuromusculaire4,10,la quantification au niveau de l’innervation peut donner des informations importantes sur la progression de la pathologie et l’effet potentiel d’une intervention thérapeutique. En outre, car la perte de NMJ représente une étape significative dans la progression pathologique, le développement des thérapeutiques qui peuvent stabiliser des connexions et encourager la régénération peut produire l’avantage significatif.
Lors de l’analyse de la morphologie NMJ, le choix musculaire est d’une grande importance. Certaines des considérations primaires pourraient inclure le type de fibre musculaire, position du corps, et l’analyse comparative aux conditions humaines. En outre, lorsque des manipulations telles que l’injection de substances ou des lésions nerveuses traumatiques sont nécessaires, l’accessibilité expérimentale est également importante à considérer. En général, il est préférable d’analyser une gamme de muscles positionnés dans tout le corps reflétant une gamme de sous-types d’unités motrices. Souvent, cependant, le choix de muscle est influencé par la facilité de la dissection. Par conséquent, l’analyse NMJ est souvent effectuée exclusivement sur de gros muscles appendiculaires tels que gastrocnémien. Pour obtenir une bonne coloration NMJ dans ces muscles, une sectionnement ou une perturbation mécanique des fibres musculaires est souvent nécessaire. En conséquence, le modèle d’innervation peut devenir perturbé et une analyse complète et de haute qualité des modèles d’innervation, de germination et d’énervation est souvent compromise. Une autre approche consiste à utiliser des muscles plats minces qui ne nécessitent pas de sectionnement et peuvent être colorés et montés intacts, permettant une vue d’ensemble complète de l’innervation complète du muscle. Il existe un certain nombre de muscles qui peuvent être utilisés pour une telle analyse, y compris un groupe de muscles crâniens, (englobant levator auris longus, auricularis superior, et adducteur auris longus)14, les muscles thoraciques (par exemple. triangularis sterni) 15, et les muscles abdominaux(p. ex. transversus abdominis (TVA)). Le principal obstacle à l’utilisation de tels muscles est l’expertise technique requise pour les disséquer sans dommage.
Dans cette vidéo, nous fournissons un protocole pour disséquer et effectuer un étiquetage immunofluorescent du muscle TVA de la souris pour permettre une analyse complète du modèle d’innervation et de la morphologie NMJ. Le muscle TVA est un muscle à contraction principalement lente comprenant la couche la plus profonde de la musculature abdominale et est innervé par les nerfs intercostaux inférieurs. Des travaux antérieurs ont montré qu’il était constamment très vulnérable à la pathologie dans un certain nombre de modèles murins de l’amyotrophie spinale (AMS) de la maladie des motoneurones infantile et dans d’autres modèles murins de dégénérescence précoce des motoneurones4,16. Nous proposons donc que le TVA soit un muscle utile pour entreprendre l’analyse de NMJ dans des neuropathies périphériques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
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dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

L’analyse de la morphologie de jonction neuromusculaire peut donner un aperçu important de l’état physiologique d’un motoneurone donné. L’analyse des muscles plats minces peut offrir un avantage significatif par rapport aux muscles plus épais traditionnellement utilisés, tels que ceux du membre postérieur (par exemple. gastrocnémien ). Les muscles minces permettent une vue d’ensemble complète de l’ensemble du modèle d’innervation pour un muscle donné, qui à son tour permet l’identification des piscines sélectivement vulnérables des motoneurones. Ces muscles permettent également l’analyse de paramètres tels que la taille de l’unité motrice, la ramification axonale et la germination terminale / nodale. Un obstacle commun dans l’utilisation de tels muscles est d’acquérir l’expertise technique pour les disséquer. Dans cette vidéo, nous détaillons le protocole de dissection du muscle transversus abdominis (TVA) des jeunes souris et d’immunofluorescence pour visualiser les axones et les jonctions neuromusculaires (NMJ). Nous démontrons que cette technique donne une vue d’ensemble complète du modèle d’innervation du muscle de TVA et peut être employée pour étudier la pathologie de NMJ dans un modèle murin de la maladie de neurone moteur d’enfance, atrophie musculaire spinale.

Le protocole ci-dessus dirige l’isolement et la coloration du muscle TVA pour l’analyse NMJ. Cela permet une analyse à montage entier des modèles d’innervation musculaire ainsi qu’une analyse à haute résolution de la morphologie NMJ (Figure 2). Cette technique peut être appliquée avec succès pour révéler la pathologie NMJ dans des modèles murins de maladie des motoneurones, tels que SMA4,17(Figure 3). Dans les modèles murins de SMA il y a une variabilité intramusculaire significative dans la pathologie, cependant le muscle TVA est constamment fortement affecté. Ceci est démontré par la dénervation des plaques d’extrémité du moteur, l’accumulation de neurofilaments au terminal présynaptique et la germination terminale (Figure 3). Les résultats présentés ici démontrent ainsi que la technique décrite ci-dessus peut être une méthode puissante pour fournir une vue d’ensemble complète de l’innervation et de l’analyse de la pathologie NMJ dans des modèles murins.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> Figure 1. Vue d’ensemble de la musculature abdominale de la souris. (A) L’image montre la cage thoracique avec une musculature abdominale attachée, qui a été retirée d’une souris récemment euthanasiée et épinglée dans un plat de dissection côté superficiel vers le haut (A). (B) La dissection dans A a été annotée pour marquer les limites approximatives des muscles abdominaux. Les muscles abdominaux superficiels peuvent être vus sur le côté gauche de la dissection, et comprennent oblique externe (souligné en bleu) et rectus abdominis (décrit en rouge). Sur le côté droit de la dissection, les muscles superficiels ont été enlevés, ce qui a permis la visualisation du muscle transversus abdominis (décrit en vert) et du muscle oblique interne (délimité en jaune). Le but de ce protocole est de diriger la dissection de la partie supérieure du muscle TVA, montrée ici comme un triangle vert uni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> Figure 2. Vue d’ensemble de tout-montage des jonctions neuromusculaires dans le muscle de TVA. Images montrant des exemples de NMJs du muscle TVA visualisés avec une coloration immunofluorescente pour le neurofilament (NF; vert), la protéine 2 de la vésicule synaptique (SV2; vert) et la bungarotoxine (BTX; rouge). Les images sont des micrographies fluorescentes montages montrant l’ensemble du muscle(A)ou des images confocales montrant des groupes(B)ou des NMJ individuels(C).Barre d’échelle = 800 μm(A), 70 μm (B), 25 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> Figure 3. Pathologie neuromusculaire de jonction dans le muscle de TVA d’un modèle murin de SMA. Micrographies confocales montrant des NMJs du muscle TVA visualisés avec une coloration immunofluorescente pour le neurofilament (NF; vert), la protéine synaptique de la vésicule 2 (SV2; vert) et la bungarotoxine (BTX; rouge) du modèle de souristémoin (Smn2B/+) ou SMA(Smn2B/-). Notez que tandis que la morphologie normale de NMJ peut être observée chez les souris de contrôle, dans les muscles de TVA de Smn2B/- souris il y a des preuves de la dénervation complète (pointe blanche de flèche), de la dénervation partielle (arrowhead violet), de la germination terminale (arrowhead bleu) et du gonflement presynaptique (arrowhead jaune). Les plaques d’extrémité poteau-synaptiques sont également moins complexes reflétant un phénotype apparemment moins mûr. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.

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Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dans ce vidéo nous démontrons un protocole pour la dissection du muscle d’abdominis de transversus de la souris et employons l’immunofluorescence et la microscopie pour visualiser les jonctions neuromusculaires.

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

11.4K vues.  Ottawa Hospital Research Institute. Dans ce vidéo nous démontrons un protocole pour la dissection du muscle d’abdominis de transversus de la souris et employons l’immunofluorescence et la microscopie pour visualiser les jonctions neuromusculaires.

Vidéo: Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Recherche

Neurosciences

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection et l&#39;imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l&#39;évaluation subséquente de la régénération par l&#39;analyse du Mont muscle entier

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...