وقد دعم هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (منحة رقم MOP 38040) إلى R.K. ، وجمعية ضمور العضلات (الولايات المتحدة الأمريكية) إلى R.K. ، وأسر SMA إلى R.K. و L.M.M ، وSMA Trust إلى T.H.G. ، وحملة ضمور العضلات إلى T.H.G. L.M.M هو حاصل على زمالة التصلب المتعدد في كندا ما بعد الدكتوراه، وR.K. هو حاصل على كرسي البحوث الصحية الجامعية من جامعة أوتاوا.

وينبغي تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لمعايير رعاية الحيوان التي تحددها المؤسسة.
1. تشريح عضلات البطن من الفأر
<ol><li>قبل البدء، يشكلون 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). تنبيه: احتفظ دائما ب PFA داخل غطاء الدخان وارتد معدات الحماية المناسبة.</li>
	<li>القتل الرحيم الماوس بواسطة أسلوب معتمد. ملاحظة: الفأر الذي يظهر في الفيديو قتل رميا بالرصاص بجرعة زائدة منثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم. هذا الماوس هو فأر من النوع البري عمره 4 أسابيع على خلفية هجينة CD1/C57Bl6. تم تربية هذا الفأر في مرافق الحيوانات في جامعة أوتاوا من الفئران التي تم شراؤها في الأصل.</li>
	<li>إجراء شق الأولي من خلال الجلد على مستوى الورك وقطع من خلال الجلد على طول الطريق حول الماوس.</li>
	<li>قشر قبالة الجلد، وسحب صعودا حتى تصل إلى مستوى الأطراف الأمامية.</li>
	<li>قطع من خلال عضلات البطن على مستوى الورك ومواصلة شق حتى تصل إلى العمود الفقري.</li>
	<li>عند هذه النقطة، تبدأ في قطع صعودا من خلال العضلات والأضلاع حتى تصل إلى الطرف العلوي.</li>
	<li>قطع مباشرة عبر حتى تصل إلى العمود الفقري على الجانب الآخر.</li>
	<li>قطع لأسفل حتى تصل إلى النقطة التي بدأت.</li>
	<li>الإفراج عن الحجاب الحاجز من تحت (مع الحرص على عدم تلف العضلات TVA) ووضعه في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) في طبق تشريح SYLGARD المغلفة مع دبابيس تشريح 0.2 ملم.</li>
	<li>دبوس خارج القفص الصدري والعضلات المرتبطة بها في الطبق، الجانب السطحي حتى، والتأكد من أن العضلات امتدت تماما.</li>
	<li>صب قبالة برنامج تلفزيوني 1x واستبدالها مع 4٪ PFA.</li>
	<li>يغطى ويترك على منصة هزازة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>غسل 3x في برنامج تلفزيوني 1x في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.</li>
</ol>* عند هذه النقطة يمكن ترك العضلات الثابتة في الثلاجة بين عشية وضحاها قبل تشريح لاحقة.
2. عزل العضلات TVA
<ol><li>للشروع في عزل عضلة TVA ، تحت مجهر تشريح ، ابدأ بقطع العضلات المائلة الخارجية على مستوى الأضلاع القليلة الماضية (انظر الشكل 1 للحصول على دليل مشروح).</li>
	<li>قطع مباشرة إلى أسفل بجانب ألبا خط (مع الحرص على عدم قطع من خلال TVA أدناه) حتى تصل إلى بداية العضلات المائلة الداخلية.</li>
	<li>ثم قطع عبر للافراج عن abdominis المستقيم المفرط والعضلات المائلة الخارجية من الجزء العلوي من TVA أدناه.</li>
	<li>إزالة الأوعية الدموية وأي الدهون الزائدة من العضلات TVA.</li>
	<li>حرر العضلة من الضلع الأخير المفرط.</li>
	<li>قطع حول هوامش العضلات وإزالة إلى لوحة 24 جيدا تحتوي على برنامج تلفزيوني.</li>
</ol>3. وضع العلامات immunofluorescent ومجهر العضلات TVA
لجميع الخطوات اللاحقة، وإزالة السائل باستخدام ماصة غرامة يميل وترك لوحة على منصة هزاز. ما لم ينص على خلاف ذلك، يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة.
<ol><li>احتضان في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1:1،000 bungarotoxin الموسومة الفلورسنت لمدة 30 دقيقة لتسمية NMJs. ويمكن القيام بذلك في غرفة مظلمة أو تحت احباط.</li>
	<li>Permeabilize العضلات بإضافة 300 ميكرولتر لكل بئر من 2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني وترك على منصة هزاز لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>احتضان في حجب الكاشف (4٪ BSA، 1٪ تريتون في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>احتضان في حجب الكاشف الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية (neurofilament 1:100; بروتين الحويزل متشابك 2, 1:250) في 4 °C بين عشية وضحاها.</li>
	<li>غسل 3x في برنامج تلفزيوني 1x.</li>
	<li>احتضان في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1:250 الأجسام المضادة الثانوية لمدة 2-4 ساعة.</li>
	<li>غسل 3x في برنامج تلفزيوني 1x.</li>
	<li>جبل العضلات على الشرائح الزجاجية باستخدام وسائل الإعلام تركيب الفلورسنت كافية و coverslip.</li>
	<li>يتم عرض الشرائح بشكل أفضل باستخدام فلتر تمرير النطاق المزدوج على المجهر القياسي.</li>
	<li>يتم تصوير NMJs بشكل أفضل باستخدام إسقاط سلسلة z على مجهر كونفوجال مجهز بهدف 40X على الأقل.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

في هذا الفيديو، قمنا بتفصيل بروتوكول لتشريح عضلة TVA من الماوس ووضع العلامات المناعية الكاملة ل NMJs داخل العضلات. كما نقدم بيانات تظهر أن هذه العضلة يمكن استخدامها لتحليل أمراض التقاطع العصبي العضلي في نموذج الماوس من SMA.
يعتمد النجاح في هذه التقنية على عدد من العوامل. وفيما يلي بعض المشاكل الأكثر شيوعا. أولا: ضعف التلطيخ المناعي الكيميائي. يمكن أن يكون هناك عدد من الأسباب لذلك، واحدة من أكثر شيوعا هو استخدام الكواشف المختلفة لتلك المذكورة في هذا البروتوكول. من المهم جدا أن يكون الفحص المجهري الإلكتروني عالي الجودة PFA مهما جدا لضمان تلطيخ جيد ، وكذلك اختيار الأجسام المضادة المدرجة في هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، في الحيوانات القديمة(أي> 3 أشهر) ، يمكن أن يكون الحصول على تلطيخ ذات نوعية جيدة أكثر صعوبة. وذلك بسبب زيادة سمك اللفافة المحيطة العضلات وزيادة في تراكم الدهون بين المائل الخارجي وdbdominis tranversus. من المهم تجريد الدهون، قبل الشروع في immunofluorescence. قد يكون من الضروري أيضا لتجريد قبالة بعض اللفافة التي تغطي العضلات، والتي يمكن أن تصبح سميكة. من الصعب في بعض الأحيان تجريد اللفافة والدهون من العضلات دون تكبد بعض الأضرار التي لحقت ألياف العضلات وتعطيل نمط التعصيب. ولكن إذا تم تنفيذ هذه التقنية بعناية ، يمكن الحصول على تلطيخ ذات نوعية جيدة من الفئران حتى 1 سنة على الأقل من العمر. في الفئران الأصغر سنا(أيأقل من 3 أشهر من العمر) لا ينبغي أن يكون من الضروري إجراء أي إغاظة أو فصل ألياف العضلات. ثانيا: صعوبة في العثور على NMJs بعد تشريح وتلطيخ. هذا غالبا لأن تشريح لم تمتد تحت الضلع الأخير. وتقع غالبية NMJs فقط تحت الضلع الأخير، وبالتالي يجب توخي الحذر لضمان إدراج هذا الجزء من العضلات في تشريح. ثالثا: التزام عضلة EO بعضلات TVA. غالبا ما تكون هذه شكوى عندما يحاول الأفراد تمديد التشريح إلى ما دون مستوى العضلة المائلة الداخلية (IO). منطقة العضلات TVA حيث IO موجود أيضا هو أكثر صعوبة لتحليل كما يمكن أن يكون من الصعب التمييز بين العضلات التي هي. لهذا السبب، ونحن بشكل روتيني مجرد تشريح الجزء الأكثر تفوقا من العضلات TVA. وعلى هذا المستوى، لا يوجد أي التزام بين عضلات منظمة أصحاب العمل وقوة التلفزيون، وبالتالي لا ينبغي أن يكون ذلك مشكلة كبيرة.
أحد العوائق الهامة لاستخدام عضلة TVA ، مقارنة بالعضلات الزائدة الدودية ، هو إمكانية الوصول إما للتلاعب الجراحي أو حقن المواد. يمكن أن تكون هذه الأنواع من التجارب حاسمة للتحقيق في فسيولوجيا NMJ في عضلة معينة. على الرغم من أن TVA هو بالتأكيد أقل سهولة الوصول إليها من العضلات الأكثر شيوعا مثل الساق الأمامي أو gastrocnemius, وقد أظهرت الأعمال السابقة أنه من الممكن ل denervate TVA عن طريق الإصابة الجراحية للأعصاب الوربي18. وقد استخدمنا مؤخرا أيضا هذه العضلة للإدارة المحلية للمواد تحت التخدير العام (بيانات غير منشورة). على الرغم من أن هذه التجارب يمكن أن تمثل تحديا تقنيا معتدلا، وهذا العمل يدل على أنها ممكنة وبالتالي توسيع فائدة هذه العضلة لتحليل NMJs تحت كل من التلاعب المرضي والفسيولوجي.
العضلات TVA هي واحدة من عدد من العضلات المسطحة رقيقة تقع في جميع أنحاء الجسم التي يمكن استخدامها لتحليل كامل جبل من أنماط ال الداخلي. وتشمل العضلات الأخرى مجموعة من العضلات القحفية التي تقحمها الخلايا العصبية الحركية الناشئة من نواة الوجه في جذع الدماغ ، وتشمل ليفاتور أوريس لونغوس، متفوقة المسالك ، وuctor auris longus، التشريحات التي تم وصفها سابقا14،19. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تسمية العضلات المحيطة عضلة TVA، بما في ذلك EO، IO، و rectus abdominis،واستخدامها لتحليل NMJ. للتحليل الشامل لأمراض NMJ في نموذج الماوس ، من المهم النظر في عدد من العضلات الموجودة في جميع أنحاء الجسم وعدم تقييد التحليل إلى عضلة واحدة. ويتجلى هذا في نماذج الماوس من أمراض الخلايا العصبية الحركية حيث يوجد عدم تجانس كبير في مستويات أمراض NMJ بين عضلات مختلفة20. مثل هذا التباين العضلي هو أداة قيمة للغاية عند التحقيق في آلية ضعف الخلايا العصبية الحركية وبالتالي تقييد التحليل إلى عضلة واحدة يمكن أن يقلل بشكل كبير من إمكانات البحث.

تقاطعات العصبية والعضلية (NMJs) هي اتصال متشابك بين الخلايا العصبية الحركية السفلية وألياف العضلات الهيكل العظمي. وهي تعتبر تقليديا المشبك الثلاثي, تتكون من الخلايا العصبية (محطة presynaptic), الألياف العضلية (محطة ما بعد متشابك), ومحطة شوانالخلية 1. NMJs ويبدو أن الأهداف المبكرة والكبيرة في علم الأمراض في مجموعة من أمراض الخلايا العصبية الحركية ونماذج الماوس2,3. وتشمل الأعراض النموذجية denervation, حيث يصبح نهاية المحرك خالية من التعصيب presynaptic, تورم في محطة presynaptic, وانخفاض في تعقيد مورفولوجيا NMJ4-11. ويمكن أيضا أن يلاحظ الاستجابات التعويضية، والتي تشمل محطة ونودال تنبت، حيث تمتد العمليات المحورية من المحطات متشابك المتبقية أو internodes إلى لوحات النهاية denervated إعادة تنشيط12،13. نظرا للارتباط الوثيق بين النشاط المتشابك ومورفولوجيا NMJ ، يمكن الحصول على قدر كبير من المعلومات حول الحالة الوظيفية للخلايا العصبية الحركية من تحليل مورفولوجيا NMJ. كما فقدان NMJs يمثل في كثير من الأحيان واحدة من الجوانب الأولى من علم الأمراض العصبية والعضلية4,10, يمكن أن يعطي القياس الكمي على مستوى التدخيل معلومات هامة حول تطور علم الأمراض والتأثير المحتمل للتدخل العلاجي. وعلاوة على ذلك، كما فقدان NMJ يمثل خطوة هامة في التقدم المرضي، وتطوير العلاجات التي يمكن أن استقرار الاتصالات وتشجيع التجديد قد تسفر عن فائدة كبيرة.
عند تحليل مورفولوجيا NMJ ، فإن اختيار العضلات له أهمية كبيرة. قد تتضمن بعض الاعتبارات الأولية نوع ألياف العضلات، ووضع الجسم، والتحليل المقارن للظروف البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، عندما تكون هناك حاجة إلى تلاعب مثل حقن المواد أو إصابات الأعصاب الرضية، من المهم أيضا النظر في إمكانية الوصول التجريبي. بشكل عام، فمن الأفضل لتحليل مجموعة من العضلات المتمركزة في جميع أنحاء الجسم مما يعكس مجموعة من الأنواع الفرعية وحدة المحرك. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، يتأثر اختيار العضلات من سهولة تشريح. وبالتالي، غالبا ما يتم إجراء تحليل NMJ حصرا على العضلات الزائدة الدودية الكبيرة مثل gastrocnemius. للحصول على تلطيخ NMJ جيدة في مثل هذه العضلات، والقسم أو تعطيل ميكانيكي من ألياف العضلات وغالبا ما تكون هناك حاجة. ونتيجة لذلك، قد يصبح نمط التعصيب معطلا وغالبا ما يتعرض تحليل شامل وعالي الجودة لأنماط التعصيب وتنتشر وتنبت. نهج بديل هو استخدام العضلات المسطحة رقيقة التي لا تتطلب تقسيم ويمكن أن تكون ملطخة وشنت سليمة، مما يسمح لمحة شاملة عن ال داخل العضلات بأكملها. هناك عدد من العضلات التي يمكن استخدامها لمثل هذا التحليل، بما في ذلك مجموعة من العضلات القحفية، (تشمل levator أوريس لونغوس، العورة متفوقة، وauris أوريس لونغوس adductor)14، عضلات الصدر (على سبيل المثال. الثلاثي ستيرني) 15, والبطن (على سبيل المثال، عرضية abdominis (TVA)) العضلات. العائق الرئيسي في استخدام هذه العضلات هو الخبرة التقنية اللازمة لتشريحها دون ضرر.
في هذا الفيديو، ونحن نقدم بروتوكولا لتشريح وأداء وضع العلامات immunofluorescent من العضلات TVA من الماوس للسماح بتحليل شامل لنمط ال الداخلي ومورفولوجيا NMJ. عضلة TVA هي عضلة ارتعاش بطيئة في الغالب تتألف من أعمق طبقة من عضلات البطن ويتم تنشيطها من قبل الأعصاب الوربية السفلية. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن تكون باستمرار عرضة للغاية لعلم الأمراض في عدد من نماذج الماوس من مرض الخلايا العصبية الحركية في مرحلة الطفولة ضمور العضلات الشوكي (SMA) وفي نماذج الماوس الأخرى من انحطاط الخلايا العصبية الحركية بداية مبكرة4,16. لذلك نقترح أن TVA هو عضلة مفيدة لإجراء تحليل NMJ في الأمراض العصبية الطرفية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

تحليل مورفولوجيا تقاطع العصبية والعضلية يمكن أن تعطي فكرة هامة في الحالة الفسيولوجية للخلية العصبية الحركية معينة. تحليل العضلات المسطحة رقيقة يمكن أن تقدم ميزة كبيرة على العضلات المستخدمة تقليديا سمكا, مثل تلك التي من الطرف الخلفي (على سبيل المثال. الجهاز الهضمي). تسمح العضلات الرقيقة بنظرة عامة شاملة على نمط ال الداخلي بأكمله لعضلات معينة ، مما يسمح بدوره بتحديد برك ضعيفة بشكل انتقائي من الخلايا العصبية الحركية. تسمح هذه العضلات أيضا بتحليل المعلمات مثل حجم وحدة المحرك ، والمتفرعة المحورية ، والنهاية / العقدية تنبت. وثمة عقبة شائعة في استخدام هذه العضلات هو اكتساب الخبرة التقنية لتشريح لهم. في هذا الفيديو، نقوم بتفصيل بروتوكول تشريح عضلة abdominis (TVA) العرضية من الفئران الصغيرة وأداء الفلورسينس المناعي لتصور المحاور والتقاطعات العصبية العضلية (NMJs). ونحن نثبت أن هذه التقنية يعطي لمحة كاملة عن نمط ال الداخلي للعضلات TVA ويمكن استخدامها للتحقيق في علم الأمراض NMJ في نموذج الماوس من مرض الخلايا العصبية الحركية في مرحلة الطفولة, ضمور العضلات الشوكي.

يوجه البروتوكول أعلاه عزل وتلطيخ عضلة TVA لتحليل NMJ. وهذا يسمح تحليل كامل جبل من أنماط العضلات الداخلية وكذلك تحليل عالية الدقة من مورفولوجيا NMJ (الشكل 2). يمكن تطبيق هذه التقنية بنجاح للكشف عن أمراض NMJ في نماذج الماوس لمرض الخلايا العصبية الحركية ، مثل SMA4،17(الشكل 3). في نماذج الماوس من SMA هناك تباين عضلي كبير في علم الأمراض ، ولكن عضلة TVA تتأثر بشكل كبير باستمرار. ويتضح ذلك من قبل denervation من لوحات نهاية المحرك، وتراكم الخيوط العصبية في محطة presynaptic ومحطة تنبت (الشكل 3). النتائج المعروضة هنا وبالتالي تبين أن هذه التقنية المذكورة أعلاه يمكن أن تكون طريقة قوية لتقديم نظرة شاملة على التعصيب وتحليل علم الأمراض NMJ في نماذج الماوس.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 نظرة عامة على عضلات البطن من الماوس. (أ) صورة تظهر القفص الصدري مع العضلات البطن المرفقة، والتي تم إزالتها من الماوس القتل الرحيم مؤخرا وعلقت في طبق تشريح الجانب السطحي حتى (A). (ب)وقد تم شرح تشريح في A لوضع علامة على الحدود التقريبية لعضلات البطن. يمكن رؤية عضلات البطن السطحية على الجانب الأيسر من التشريح ، وتشمل مائل خارجي (موضح باللون الأزرق) و rectus abdominis (موضح باللون الأحمر). على الجانب الأيمن من تشريح, وقد أزيلت العضلات السطحية يسمح التصور من العضلات abdominis عرضية (المبينة باللون الأخضر) والعضلات المائلة الداخلية (المبينة باللون الأصفر). الهدف من هذا البروتوكول هو توجيه تشريح الجزء المتفوق من عضلة TVA ، كما هو موضح هنا كمثلث أخضر صلب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم كامل جبل نظرة عامة على تقاطعات العصبية والعضلية في العضلات TVA. صور تظهر المثال NMJs من عضلة TVA تصور مع تلطيخ immunofluorescent للنسيج العصبي (NF; الأخضر), بروتين الحويسن متشابك 2 (SV2; الأخضر) وbungarotoxin (BTX; أحمر). الصور هي صور مجهرية فلورية مونتاجية تظهر العضلات بأكملها (A) أو صور كونفوجال تظهر مجموعات (B) أو فردية (C) NMJs. شريط المقياس = 800 ميكرومتر (A) ، 70 ميكرومتر (B) ، 25 ميكرومتر (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن علم الأمراض تقاطع العصبية والعضلية في العضلات TVA من نموذج الماوس من SMA. ميكروجرافات Confocal تظهر NMJs من عضلة TVA تصور مع تلطيخ immunofluorescent لn neurofilament (NF؛ الأخضر)، بروتين الحويزل متشابك 2 (SV2؛ الأخضر) وbungarotoxin (BTX؛ الأحمر) من أي من التحكم(Smn2B/+) أو نموذج الماوس SMA(Smn2B/-). لاحظ أنه في حين يمكن ملاحظة مورفولوجيا NMJ العادية في فئران التحكم ، في عضلات TVA من Smn2B / - الفئران هناك أدلة على denervation الكامل (رأس السهم الأبيض) ، والحرمان الجزئي (رأس السهم الأرجواني) محطة تنبت (رأس السهم الأزرق) وتورم presynaptic (رأس السهم الأصفر). لوحات النهاية ما بعد متشابك هي أيضا أقل تعقيدا مما يعكس النمط الظاهري أقل نضجا على ما يبدو. شريط المقياس = 50 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">ميكرومتر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis at JoVE.com

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

في هذا الفيديو نظهر بروتوكولا لتشريح العضلات abdominis عرضية من الماوس واستخدام immunofluorescence والمجهر لتصور تقاطعات العصبية والعضلية.

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

dissection-transversus-abdominis-muscle-for-whole-mount-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

11.5K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. في هذا الفيديو نظهر بروتوكولا لتشريح العضلات abdominis عرضية من الماوس واستخدام immunofluorescence والمجهر لتصور تقاطعات العصبية والعضلية.

Video: Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...