Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Canadian Institutes of Health Research (Grant-Nummer MOP 38040) an R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) an R.K., Families of SMA to R.K. und L.M.M, The SMA Trust to T.H.G. und The Muscular Dystrophy Campaign to T.H.G. unterstützt. L.M.M ist Empfänger eines Multiple-Sklerose-Gesellschafts-Postdoktorandenstipendiums der Multiple Sclerosis Society of Canada und R.K. ist Empfänger eines University Health Research Chair von der University of Ottawa.

Alle Verfahren sollten nach den von der Einrichtung festgelegten Tierpflegestandards durchgeführt werden.
1. Dissektion der Bauchmuskulatur von der Maus
<ol><li>Vor dem Start 4% Paraformaldehyd (PFA) ausmachen. Achtung: Halten Sie PFA immer in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie eine geeignete Schutzausrüstung.</li>
	<li>Euthanisieren Sie die Maus nach einer genehmigten Methode. Hinweis: Die im Video gezeigte Maus wurde durch eine Überdosis CO2 und Zervixdislokation eingeschläfert. Diese Maus ist eine 4 Wochen alte Wild-Type-Maus auf einem CD1/C57Bl6-Hybridhintergrund. Diese Maus wurde in den Tieranlagen der Universität Ottawa von Mäusen gezüchtet, die ursprünglich gekauft wurden.</li>
	<li>Machen Sie einen ersten Schnitt durch die Haut auf der Ebene der Hüfte und schneiden Sie durch die Haut den ganzen Weg um die Maus.</li>
	<li>Die Haut abziehen, nach oben ziehen, bis Sie das Niveau des Vorderbeins erreichen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Bauchmuskulatur auf der Ebene der Hüfte durch und setzen Sie den Schnitt fort, bis Sie die Wirbelsäule erreichen.</li>
	<li>An diesem Punkt beginnen Sie, nach oben durch die Muskulatur und die Rippen zu schneiden, bis Sie die obere Extremität erreichen.</li>
	<li>Schneiden Sie geradeüber, bis Sie die Wirbelsäule auf der anderen Seite erreichen.</li>
	<li>Schneiden Sie nach unten, bis Sie den Punkt erreichen, an dem Sie begonnen haben.</li>
	<li>Lösen Sie das Zwerchfell von unten (wobei darauf geachtet wird, den TVA-Muskel nicht zu beschädigen) und legen Sie es in Phosphatgepufferte Salin (PBS) in einer SYLGARD-beschichteten Sezierschale mit 0,2 mm Sezierstiften.</li>
	<li>Pin out der Rippenkäfig und die damit verbundene Muskulatur in der Schale, oberflächliche Seite nach oben, um sicherzustellen, dass der Muskel vollständig ausgestreckt ist.</li>
	<li>Gießen Sie die 1x PBS ab und ersetzen Sie sie durch 4% PFA.</li>
	<li>Bedecken und lassen Sie auf einer Schaukelplattform bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>Waschen Sie 3x in 1x PBS bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
</ol>* An dieser Stelle können die festen Muskeln über Nacht vor der anschließenden Zerlegung im Kühlschrank gelassen werden.
2. Isolierung des TVA-Muskels
<ol><li>Um mit der Isolierung des TVA-Muskels unter einem Seziermikroskop fortzufahren, beginnen Sie mit dem Durchschneiden des äußeren schrägen Muskels auf der Ebene der letzten Rippen (siehe Abbildung 1 für eine anmerkungsierte Anleitung).</li>
	<li>Schneiden Sie gerade neben der Linea alba (achten Sie darauf, nicht durch den TVA unten zu schneiden), bis Sie den Beginn der inneren schrägen Muskel erreichen.</li>
	<li>Dann schneiden Sie durch, um die darüber liegenden Rectus abdominis und externe schräge Muskeln aus dem oberen Teil des TVA unten zu lösen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Blutgefäß und jedes darüber liegende Fett aus dem TVA-Muskel.</li>
	<li>Lassen Sie den Muskel von der überlegenen letzten Rippe.</li>
	<li>Schneiden Sie um die Ränder des Muskels und entfernen Sie auf eine 24-Well-Platte, die PBS enthält.</li>
</ol>3. Immunfluoreszenz-Etikettierung und Mikroskopie des TVA-Muskels
Für alle nachfolgenden Schritte Flüssigkeit mit einer fein gekippten Pipette entfernen und die Platte auf einer Schaukelplattform lassen. Sofern nicht anders angegeben, werden alle nachfolgenden Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt.
<ol><li>Inkubieren Sie in PBS mit 1:1.000 fluoreszierend Bungarotoxin für 30 min, um die NMJs zu kennzeichnen. Dies kann in einem dunklen Raum oder unter Folie erfolgen.</li>
	<li>Permeabilisieren Sie den Muskel, indem Sie 300 l pro Bohrgut von 2% Triton X-100 in PBS hinzufügen und 30 min auf einer Schaukelplattform lassen.</li>
	<li>Inkubieren Sie in blockierendem Reagenz (4% BSA, 1% Triton in PBS) für 30 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie in blockierendem Reagenz, das primäre Antikörper (Neurofilament 1:100; synaptisches Vesikelprotein 2, 1:250) bei 4 °C über Nacht enthält.</li>
	<li>Waschen Sie 3x in 1x PBS.</li>
	<li>Inkubieren in PBS mit 1:250 sekundärem Antikörper für 2-4 Stunden.</li>
	<li>Waschen Sie 3x in 1x PBS.</li>
	<li>Montieren Sie Muskeln mit ausreichend fluoreszierenden Montagemedien und Deckelrutschen auf Glasschlitten.</li>
	<li>Dias werden am besten mit einem Doppelbandpassfilter auf einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop betrachtet.</li>
	<li>NMJs werden am besten mit einer Z-Serie-Projektion auf einem konfokalen Mikroskop mit mindestens einem 40-Fach-Objektiv abgebildet.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Video haben wir ein Protokoll für die Zerlegung des TVA-Muskels von der Maus und für die ganzmontierte immunfluoreszierende Kennzeichnung von NMJs innerhalb des Muskels detailliert beschrieben. Wir präsentieren auch Daten, die zeigen, dass dieser Muskel verwendet werden kann, um neuromuskuläre Knotenpathologie in einem Mausmodell von SMA zu analysieren.
Der Erfolg dieser Technik hängt von einer Reihe von Faktoren ab. Einige der häufigsten Probleme werden im Folgenden beschrieben. Erstens: schlechte immunhistochemische Färbung. Es kann eine Reihe von Gründen dafür geben, einer der häufigsten ist die Verwendung von verschiedenen Reagenzien zu denen, die in diesem Protokoll aufgeführt sind. Eine hochwertige Elektronenmikroskopie Qualität PFA ist sehr wichtig, um eine gute Färbung zu gewährleisten, wie die Wahl der Antikörper in diesem Protokoll aufgeführt sind. Darüber hinaus kann bei älteren Tieren(d.h.> 3 Monaten) eine gute Färbung schwieriger sein. Dies ist aufgrund der erhöhten Dicke der Faszien um den Muskel und die Zunahme der Fettansammlung zwischen der äußeren Schräglage und Tranversus Abdominis. Es ist wichtig, das Fett abzustreifen, bevor Sie zur Immunfluoreszenz übergehen. Es kann auch notwendig sein, einige der Faszien abzustreifen, die den Muskel bedecken, die verdickt werden können. Es ist manchmal schwierig, die Faszien und Fett aus dem Muskel zu entfernen, ohne einige Schäden an der Muskelfaser und eine Störung des Innervationsmusters. Wenn diese Technik jedoch sorgfältig durchgeführt wird, kann eine gute Färbung von Mäusen bis mindestens 1 Jahr erworben werden. Bei jüngeren Mäusen(d.h.weniger als 3 Monate alt) sollte es nicht notwendig sein, eine Hänseleien oder Trennung von Muskelfasern durchzuführen. Zweitens: schwierig bei der Suche nach NMJs nach Sezieren und Färben. Dies liegt oft daran, dass sich die Sezierung unter der letzten Rippe nicht verlängert hat. Die meisten NMJs befinden sich direkt unter der letzten Rippe und daher muss darauf geachtet werden, dass dieser Teil des Muskels in der Zerlegung enthalten ist. Drittens: Die Haftung des EO-Muskels am TVA-Muskel. Dies ist oft eine Beschwerde, wenn Einzelpersonen versuchen, die Sektion unter dem Niveau der inneren Schrägstrich (IO) Muskel zu verlängern. Der Bereich des TVA-Muskels, in dem auch die IO vorhanden ist, ist schwieriger zu analysieren, da es schwierig sein kann, zu unterscheiden, welcher Muskel welche ist. Aus diesem Grund sezieren wir routinemäßig nur den überlegensten Teil des TVA-Muskels. Auf dieser Ebene gibt es keine Haftung zwischen der EO und TVA Muskeln, und daher sollte dies kein signifikantes Problem sein.
Ein erhebliches Hindernis für die Verwendung des TVA-Muskels, im Vergleich zu appendicular Muskeln, ist zugänglich für chirurgische Manipulationen oder Injektion von Substanzen. Diese Arten von Experimenten können entscheidend sein, um die NMJ-Physiologie in einem bestimmten Muskel zu untersuchen. Obwohl der TVA sicherlich weniger leicht zugänglich ist als häufiger verwendete Muskeln wie tibialis anterior oder gastrocnemius, hat frühere Arbeiten gezeigt, dass es möglich ist, den TVA durch chirurgische Verletzung der Interkostalnerven zu denervate18. Wir haben diesen Muskel vor kurzem auch für die lokale Verabreichung von Substanzen unter Vollnarkose (unveröffentlichte Daten) verwendet. Obwohl diese Experimente eine moderate technische Herausforderung darstellen können, zeigt diese Arbeit, dass sie machbar sind und somit die Nützlichkeit dieses Muskels für die Analyse von NMJs unter pathologischer und physiologischer Manipulation erweitern.
Der TVA-Muskel ist einer von mehreren dünnen flachen Muskeln im ganzen Körper, die für die Gesamt-Mount-Analyse von Innervationsmustern verwendet werden können. Andere Muskeln umfassen eine Gruppe von Schädelmuskeln, die durch motorische Neuronen, die aus dem Gesichtskern des Hirnstamms stammen, innerviert werden und Levator auris longus, auricularis superiorund Adduktoren auris longusumfassen, deren Dissektionen zuvor14,19beschrieben wurden. Darüber hinaus kann die Muskulatur, die den TVA-Muskel umgibt, einschließlich EO, IO und rectus abdominis, auch gekennzeichnet und für die NMJ-Analyse verwendet werden. Für eine umfassende Analyse der NMJ-Pathologie in einem Mausmodell ist es wichtig, eine Reihe von Muskeln im ganzen Körper zu berücksichtigen und die Analyse nicht auf einen einzelnen Muskel zu beschränken. Dies wird in Mausmodellen von motorischen Neuronenerkrankungen veranschaulicht, bei denen es eine signifikante Heterogenität in den Niveaus der NMJ-Pathologie zwischen verschiedenen Muskeln20gibt. Eine solche intermuskuläre Variabilität ist ein äußerst wertvolles Werkzeug bei der Untersuchung des Mechanismus der Motorneuron-Schwachstelle und daher könnte die Beschränkung der Analyse auf einen einzelnen Muskel das Potenzial der Forschung erheblich verringern.

Neuromuskuläre Knoten (NMJs) sind die synaptische Verbindung zwischen einem unteren motorischen Neuron und einer Skelettmuskelfaser. Sie gelten traditionell als dreigliedrige Synapse, bestehend aus einem Neuron (präsynaptisches Terminal), Muskelfaser (postsynaptische Seat) und terminalschwann Zelle1. NMJs scheinen frühe und signifikante Ziele in der Pathologie in einer Reihe von motorischen Neuronenerkrankungen und Mausmodellen zu sein2,3. Typische Symptome sind Dieervation, wo die Motorendplatte frei von einer präsynaptischen Innervation, Schwellung des präsynaptischen Terminals und einer Verringerung der Komplexität derNMJ-Morphologie 4-11wird. Kompensatorische Reaktionen können auch festgestellt werden, einschließlich Terminal- und Knotenkeimung, wo axonale Prozesse von verbleibenden synaptischen Klemmen oder Internoden bis hin zu reinvierten denervierten Endplatten12,13reichen. Aufgrund der engen Korrelation zwischen synaptischer Aktivität und NMJ-Morphologie können aus der Analyse der NMJ-Morphologie viele Informationen über den funktionellen Status von motorischen Neuronen gewonnen werden. Da der Verlust von NMJs häufig einen der ersten Aspekte der neuromuskulären Pathologiedarstellt 4,10, kann die Quantifizierung auf der Ebene der Innervation wichtige Informationen über das Fortschreiten der Pathologie und die mögliche Wirkung einer therapeutischen Intervention geben. Da der NMJ-Verlust einen bedeutenden Schritt in der pathologischen Progression darstellt, kann die Entwicklung von Therapeutika, die Verbindungen stabilisieren und die Regeneration fördern können, einen erheblichen Nutzen bringen.
Bei der Analyse der NMJ-Morphologie ist die Muskelwahl von großer Bedeutung. Einige der primären Überlegungen können Muskelfasertyp, Körperposition und vergleichende Analyse zu menschlichen Bedingungen umfassen. Darüber hinaus ist, wenn Manipulationen wie Injektion von Substanzen oder traumatische Nervenverletzungen erforderlich sind, auch die experimentelle Zugänglichkeit zu berücksichtigen. Im Allgemeinen ist es vorzuziehen, eine Reihe von Muskeln im ganzen Körper zu analysieren, die eine Reihe von Motoreinheiten-Subtypen widerspiegeln. Oft wird die Muskelwahl jedoch durch die einfache Zerlegung beeinflusst. Folglich wird die NMJ-Analyse oft ausschließlich an großen Anhängsmuskelmuskeln wie Gastrocnemiusdurchgeführt. Um eine gute NMJ Färbung in solchen Muskeln zu erhalten, ist oft Schnitt oder mechanische Störung der Muskelfasern erforderlich. Als Ergebnis kann das Innervationsmuster gestört werden und eine umfassende und qualitativ hochwertige Analyse von Innervationsmustern, Keimen und Denervation wird oft beeinträchtigt. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung dünner flacher Muskeln, die keine Schnitte erfordern und intakt gebeizt und montiert werden können, was einen umfassenden Überblick über die gesamte Innervation des Muskels ermöglicht. Es gibt eine Reihe von Muskeln, die für eine solche Analyse verwendet werden können, einschließlich einer Gruppe von Schädelmuskeln, (einschließlich Levator auris longus, auricularis superior, und Adduktoren auris longus)14, Brustmuskeln (z.B.. triangularis sterni) 15, und Bauchmuskeln(z.B. transversus abdominis (TVA)). Das Haupthindernis bei der Verwendung solcher Muskeln ist das technische Know-how, das erforderlich ist, um sie ohne Schäden zu sezieren.
In diesem Video stellen wir ein Protokoll zur Sezieren und Durchführung von immunfluoreszierender Kennzeichnung des TVA-Muskels von der Maus zur Verfügung, um eine umfassende Analyse des Innervationsmusters und der NMJ-Morphologie zu ermöglichen. Der TVA-Muskel ist ein überwiegend langsamer Zuckmuskel, der die tiefste Schicht der Bauchmuskulatur umfasst und durch die unteren interkostalen Nerven innerviert wird. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass es konsequent sehr anfällig für Pathologie in einer Reihe von Mausmodellen der Kindheit motorischen Neuronenkrankheit spinale Muskelatrophie (SMA) und in anderen Mausmodellen der frühen einsetzenden motorischen Neuronendegeneration4,16. Wir schlagen daher vor, dass das TVA ein nützlicher Muskel für die Durchführung von NMJ-Analysen in peripheren Neuropathien ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

Die Analyse der neuromuskulären Knotenmorphologie kann wichtige Einblicke in den physiologischen Status eines bestimmten motorischen Neurons geben. Die Analyse dünner flacher Muskeln kann gegenüber traditionell verwendeten dickeren Muskeln, wie z.B. aus der Hinterbeinen (z.B.. gastrocnemius). Dünne Muskeln ermöglichen einen umfassenden Überblick über das gesamte Innervationsmuster eines bestimmten Muskels, was wiederum die Identifizierung selektiv anfälliger Becken von motorischen Neuronen ermöglicht. Diese Muskeln ermöglichen auch die Analyse von Parametern wie Motoreinheitsgröße, axonale Verzweigung und Terminal/Knoten-Spriegung. Ein häufiges Hindernis bei der Verwendung solcher Muskeln ist die Gewinnung des technischen Know-hows, um sie zu sezieren. In diesem Video beschreiben wir das Protokoll zur Zerkleinerung des Transversus Abdominis (TVA) Muskels von jungen Mäusen und zur Durchführung von Immunfluoreszenz zur Visualisierung von Axonen und neuromuskulären Knoten (NMJs). Wir zeigen, dass diese Technik einen vollständigen Überblick über das Innervationsmuster des TVA-Muskels gibt und zur Untersuchung der NMJ-Pathologie in einem Mausmodell der motorischen Neuronenerkrankung im Kindesalter, spinaler Muskelatrophie, verwendet werden kann.

Das obige Protokoll leitet die Isolierung und Färbung des TVA-Muskels für die NMJ-Analyse. Dies ermöglicht eine vollwertige Analyse von Muskelinnervationsmustern sowie eine hochauflösende Analyse der NMJ-Morphologie (Abbildung 2). Diese Technik kann erfolgreich angewendet werden, um NMJ-Pathologie in Mausmodellen der motorischen Neuronenerkrankung, wie SMA4,17(Abbildung 3) zu offenbaren. In Mausmodellen von SMA gibt es signifikante intramuskuläre Variabilität in der Pathologie, jedoch ist der TVA-Muskel durchweg stark betroffen. Dies wird durch die Denervation von motorischen Endplatten, die Ansammlung von Neurofilamenten am präsynaptischen Terminal und das Terminalkeimen belegt (Abbildung 3). Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen somit, dass die oben beschriebene Technik eine leistungsfähige Methode sein kann, um einen umfassenden Überblick über die Innervation und Analyse der NMJ-Pathologie in Mausmodellen zu bieten.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> Abbildung 1. Überblick über die Bauchmuskulatur der Maus. (A) Bild zeigen den Brustkäfig mit angehängter Bauchmuskulatur, der von einer kürzlich eingeschläferten Maus entfernt und in einer Sezierschale auf der oberflächlichen Seite nach oben gepinnt wurde (A). (B) Die Dissektion in A wurde mit Anmerkungen zur ungefähren Grenze der Bauchmuskeln bezeichnet. Die oberflächlichen Bauchmuskeln können auf der linken Seite der Sezierung gesehen werden, und umfassen äußere Schräglage (blau umrandet) und rectus abdominis (rot umrandet). Auf der rechten Seite der Sektion wurden die oberflächlichen Muskeln entfernt erlaubt Visualisierung der transversus abdominis Muskel (in grün umrissen) und der internen schrägen Muskel (in gelb umrissen). Ziel dieses Protokolls ist es, die Zerlegung des oberen Teils des TVA-Muskels, der hier als ein durchgehendes grünes Dreieck dargestellt wird, zu lenken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> Abbildung 2. Überblick über neuromuskuläre Knoten im TVA-Muskel. Bilder, die Beispiel-NMJs aus dem TVA-Muskel zeigen, visualisiert mit immunfluoreszierender Färbung für Neurofilamente (NF; grün), synaptischeves Vesikelprotein 2 (SV2; grün) und Bungarotoxin (BTX; rot). Die Bilder sind montagierte fluoreszierende Mikrographien, die den gesamten Muskel (A) oder konfokale Bilder zeigen Gruppen (B) oder einzelne (C) NMJs. Scale bar = 800 'm (A), 70 'm (B), 25 'm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> Abbildung 3. Neuromuskuläre Knotenpathologie im TVA-Muskel aus einem Mausmodell von SMA. Konfokale Mikrographien zeigen NMJs aus dem TVA-Muskel visualisiert mit immunfluoreszierender Färbung für Neurofilament (NF; grün), synaptischeves Vesikelprotein 2 (SV2; grün) und Bungarotoxin (BTX; rot) von entweder Kontrolle (Smn2B/+) oder SMA-Mausmodell (Smn2B/-). Beachten Sie, dass während normale NMJ-Morphologie bei Kontrollmäusen beobachtet werden kann, bei TVA-Muskeln von Smn2B/- Mäusen gibt es Hinweise auf eine vollständige Denervation (weiße Pfeilspitze), partielle Denervation (lila Pfeilspitze) Terminal-Keimung (blaue Pfeilspitze) und präsynaptische Schwellung (gelbe Pfeilspitze). Die postsynaptischen Endplatten sind auch weniger komplex und spiegeln einen scheinbar weniger ausgereiften Phänotyp wider. Maßstabsleiste = 50 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

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Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In diesem Video zeigen wir ein Protokoll zur Zerlegung des Transversus-Abdominis-Muskels der Maus und verwenden Immunfluoreszenz und Mikroskopie, um neuromuskuläre Knoten zu visualisieren.

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

11.5K Aufrufe.  Ottawa Hospital Research Institute. In diesem Video zeigen wir ein Protokoll zur Zerlegung des Transversus-Abdominis-Muskels der Maus und verwenden Immunfluoreszenz und Mikroskopie, um neuromuskuläre Knoten zu visualisieren.

Serie: Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...