עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (מספר מענק MOP 38040) ל- R.K., איגוד ניוון השרירים (ארה"ב) ל- R.K., משפחות SMA ל- R.K. ו- L.M.M, קרן SMA ל- T.H.G., וקמפיין ניוון השרירים ל- T.H.G.. L.M.M הוא מקבל של אגודת טרשת נפוצה של קנדה פוסט דוקטורט מלגת, ו R.K. הוא מקבל של קתדרה לחקר הבריאות באוניברסיטה מאוניברסיטת אוטווה.

יש לבצע את כל ההליכים על פי הסטנדרטים לטיפול בבעלי חיים שנקבעו על ידי המוסד.
1. ניתוח שרירי הבטן מהעכבר
<ol><li>לפני תחילת, לפצות 4% paraformaldehyde (PFA). זהירות: יש לשמור תמיד על PFA בתוך מכסה המנוע וללבוש ציוד מגן מתאים.</li>
	<li>המתת חסד לעכבר בשיטה מאושרת. שים לב: העכבר המוצג בסרטון היה מורדם על ידי מנת יתר של CO2 ונקע בצוואר הרחם. עכבר זה הוא עכבר פראי בן 4 שבועות על רקע היברידי CD1/C57Bl6. עכבר זה גדל במתקני בעלי החיים באוניברסיטת אוטווה מעכברים שנרכשו במקור.</li>
	<li>בצע חתך ראשוני דרך העור ברמה של הירך לחתוך דרך העור כל הדרך סביב העכבר.</li>
	<li>לקלף את העור, מושך כלפי מעלה עד שתגיע לרמה של forelimb.</li>
	<li>חותכים דרך שרירי הבטן ברמה של הירך ולהמשיך את החתך עד שתגיע לעמוד החוליות.</li>
	<li>בשלב זה, להתחיל לחתוך כלפי מעלה דרך השרירים והצלעות עד שתגיע לאיבר העליון.</li>
	<li>חותכים ישר לרוחב עד שתגיע לעמוד החוליות בצד השני.</li>
	<li>חותכים כלפי מטה עד שתגיע לנקודה שבה התחלת.</li>
	<li>שחררו את הסרעפת מלמטה (מקפידים לא לפגוע בשריר ה-TVA) והניחו אותה בתמיסת מלח עם אגירה פוספטית (PBS) בצלחת ניתוח מצופה SYLGARD עם סיכות דיסקציה של 0.2 מ"מ.</li>
	<li>הצמד את כלוב הצלעות ואת השרירים הקשורים בצלחת, צד שטחי למעלה, לוודא את השריר הוא מתוח לחלוטין.</li>
	<li>יוצקים את 1x PBS ולהחליף עם 4% PFA.</li>
	<li>מכסים ומשאירים על פלטפורמת נדנדה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.</li>
	<li>לשטוף 3x ב 1x PBS בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
</ol>* בשלב זה ניתן להשאיר את השרירים הקבועים במקרר לילה לפני הניתוח הבא.
2. בידוד שריר ה- TVA
<ol><li>כדי להמשיך בבידוד של שריר ה- TVA, תחת מיקרוסקופ נתיחה, התחל על-ידי חיתוך השריר האלכסוני החיצוני ברמה של הצלעות האחרונות (ראה איור 1 לקבלת מדריך מבואר).</li>
	<li>חותכים ישר ליד אלבה לינאה (מקפיד לא לחתוך דרך TVA להלן) עד שתגיע לתחילת השריר הפנימי אלכסוני.</li>
	<li>לאחר מכן לחתוך כדי לשחרר את abdominis rectus overlying ושרירים אלכסוניים חיצוניים מהחלק העליון של TVA להלן.</li>
	<li>הסר את כלי הדם ואת כל שומן overlying משריר TVA.</li>
	<li>שחררו את השריר מהצלעות האחרונות.</li>
	<li>חותכים סביב שולי השריר ומסירים לצלחת של 24 באר המכילה PBS.</li>
</ol>3. תיוג חיסוני ומיקרוסקופיה של שריר TVA
עבור כל השלבים הבאים, להסיר נוזל באמצעות פיפטה עדין הטה ולהשאיר את הצלחת על פלטפורמת נדנדה. אלא אם צוין אחרת, כל השלבים הבאים מבוצעים בטמפרטורת החדר.
<ol><li>דגירה ב PBS המכיל 1:1,000 פלואורסצנטי מתויגים bungarotoxin במשך 30 דקות כדי לתייג את NMJs. זה יכול להיעשות בחדר חשוך או תחת רדיד אלומיניום.</li>
	<li>לחלחל שריר על ידי הוספת 300 μl לכל באר של 2% טריטון X-100 ב PBS ולהשאיר על פלטפורמת נדנדה במשך 30 דקות.</li>
	<li>דגירה בחסימת ריאגנט (4% BSA, 1% טריטון ב PBS) במשך 30 דקות.</li>
	<li>דגירה בחסימת ריאגנט המכיל נוגדנים ראשוניים (neurofilament 1:100; חלבון vesicle סינפטית 2, 1:250) ב 4 מעלות צלזיוס לילה.</li>
	<li>לשטוף 3x ב 1x PBS.</li>
	<li>דגירה ב PBS המכיל 1:250 נוגדן משני במשך 2-4 שעות.</li>
	<li>לשטוף 3x ב 1x PBS.</li>
	<li>הר את השרירים על מגלשות זכוכית באמצעות מספיק מדיה הרכבה פלואורסצנטית ו coverslip.</li>
	<li>שקופיות מוצגות בצורה הטובה ביותר באמצעות מסנן מעבר פס כפול במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי סטנדרטי.</li>
	<li>NMJs הם בתמונה הטובה ביותר באמצעות הקרנת סדרת z על מיקרוסקופ confocal מצויד לפחות 40x מטרה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בסרטון זה, יש לנו פרוטוקול לניתוח של שריר TVA מן העכבר עבור תיוג immunofluorescent כל ההר של NMJs בתוך השריר. אנו מציגים גם נתונים המראים כי שריר זה יכול לשמש לניתוח פתולוגיה צומת neuromuscular במודל העכבר של SMA.
הצלחה בטכניקה זו מסתמכת על מספר גורמים. חלק מהבעיות הנפוצות ביותר מפורטות להלן. ראשית: כתמים אימונוהיסטוכימיים ירודים. יכולות להיות מספר סיבות לכך, אחת הסיבות הנפוצות ביותר להיות שימוש ריאגנטים שונים לאלה המפורטים בפרוטוקול זה. PFA באיכות גבוהה מיקרוסקופיה אלקטרונים חשוב מאוד כדי להבטיח כתמים טובים, כמו גם הבחירה של נוגדנים המפורטים בפרוטוקול זה. בנוסף, בבעלי חיים מבוגרים(כלומר> 3 חודשים), מקבל כתמים באיכות טובה יכול להיות קשה יותר. הסיבה לכך היא עובי מוגבר של fascia המקיף את השריר ואת הגידול בצבירת השומן בין אלכסון חיצוני טרנוורוס abdominis. חשוב להסיר את השומן, לפני שתמשיך לכשל חיסוני. ייתכן גם שיהיה צורך להסיר חלק fascia מכסה את השריר, אשר יכול להיות מעובה. לפעמים קשה להפשיט את fascia ושומן מן השריר מבלי לגרום נזק כלשהו סיבי השריר הפרעה דפוס innervation. עם זאת, אם טכניקה זו מבוצעת בקפידה, כתמים באיכות טובה ניתן לרכוש מעכברים עד גיל שנה לפחות. בעכברים צעירים יותר(כלומרפחות מ 3 חודשים של גיל) זה לא צריך להיות נחוץ כדי לבצע כל מתגרה או הפרדה של סיבי שריר. שנית: קשה למצוא NMJs בעקבות ניתוח וכתמים. הסיבה לכך היא לעתים קרובות כי הניתוח לא השתרע מתחת לצלעות האחרונות. רוב NMJs ממוקמים ממש מתחת לצלע האחרונה ולכן יש להקפיד כדי להבטיח חלק זה של השריר כלול ניתוח. שלישית: דבקות בשריר ה-EO בשריר ה-TVA. זוהי לעתים קרובות תלונה כאשר אנשים מנסים להאריך את הניתוח מתחת לרמה של השריר הפנימי אלכסוני (IO). האזור של שריר TVA שבו IO הוא גם נוכח קשה יותר לנתח כפי שהוא יכול להיות קשה להבחין איזה שריר הוא אשר. מסיבה זו, אנחנו באופן שגרתי רק לנתח את החלק העליון ביותר של שריר TVA. ברמה זו, אין דבקות בין שרירי EO ו TVA, ולכן זה לא צריך להיות בעיה משמעותית.
מכשול משמעותי אחד לשימוש בשריר TVA, בהשוואה לשרירי התוספתן, הוא נגישות למניפולציות כירורגיות או להזרקת חומרים. סוגים אלה של ניסויים יכולים להיות חיוניים כדי לחקור את הפיזיולוגיה של NMJ בשריר נתון. למרות TVA הוא בהחלט פחות נגיש בקלות מאשר שרירים נפוצים יותר כגון tibialis anterior או gastrocnemius, עבודה קודמת הוכיחה שניתן denervate TVA על ידי פציעה כירורגית של העצבים הבין צלעיים18. לאחרונה השתמשנו גם שריר זה לניהול מקומי של חומרים תחת הרדמה כללית (נתונים שלא פורסמו). למרות ניסויים אלה יכולים לייצג אתגר טכני מתון, עבודה זו מראה כי הם אפשריים ובכך להרחיב את התועלת של שריר זה לניתוח של NMJs תחת מניפולציה פתולוגית ופיזיולוגית כאחד.
שריר TVA הוא אחד ממספר שרירים שטוחים דקים הממוקמים בכל הגוף שניתן להשתמש בהם לניתוח הרכבה שלם של דפוסי innervation. שרירים אחרים כוללים קבוצה של שרירי גולגולת פנימיים על ידי נוירונים מוטוריים שמקורם גרעין הפנים של גזע המוח, מקיף levator auris longus, auricularis מעולה, ו adductor auris longus, את הניתוחים אשר תוארו בעבר14,19. יתר על כן, השרירים המקיפים את שריר TVA, כולל EO, IO, ו rectus abdominis, ניתן גם לתייג ולהשתמש לניתוח NMJ. לניתוח מקיף של פתולוגיה NMJ במודל העכבר, חשוב לשקול מספר שרירים הממוקמים בכל הגוף ולא להגביל את הניתוח לשריר אחד. זה בא לידי ביטוי במודלים העכבר של מחלות נוירון מוטורי שבו יש הטרוגניות משמעותית ברמות של פתולוגיה NMJ בין השרירים השונים20. שונות בין שרירית כזו היא כלי בעל ערך רב כאשר חוקרים את המנגנון של פגיעות נוירון מוטורי ולכן הגבלת ניתוח לשריר יחיד יכול להפחית באופן משמעותי את הפוטנציאל של המחקר.

צמתים נוירומוסקולריים (NMJs) הם הקשר הסינפטי בין נוירון מוטורי נמוך יותר לבין סיבי שריר השלד. הם נחשבים באופן מסורתי סינפסה משולשת, המורכב נוירון (מסוף presynaptic), סיבי שריר (מסוף סינפטית פוסט), ותא מסוף שוואן1. NMJs נראה מטרות מוקדמות ומשמעותיות בפתולוגיה במגוון של מחלות נוירון מוטורי ומודלים העכבר2,3. תסמינים אופייניים כוללים denervation, שבו endplate המנוע הופך נטול innervation presynaptic, נפיחות של הטרמינל presynaptic, וירידה במורכבות של מורפולוגיה NMJ4-11. ניתן גם לציין תגובות מפצות, הכוללות נבטים סופניים ונודאליים, שבהם תהליכים אקסונליים נמשכים ממסופים סינפטיים או מתמחים שנותרו ועד לוחות קצה מנוריםמחדש 12,13. בשל המתאם ההדוק בין פעילות סינפטית מורפולוגיה NMJ, הרבה מידע ניתן להשיג על המצב התפקודי של נוירונים מוטוריים מניתוח של מורפולוגיה NMJ. כמו אובדן של NMJs לעתים קרובות מייצג את אחד ההיבטים הראשונים של פתולוגיה neuromuscular4,10, כימות ברמה של innervation יכול לתת מידע חשוב על התקדמות הפתולוגיה ואת ההשפעה הפוטנציאלית של התערבות טיפולית. יתר על כן, כמו הפסד NMJ מייצג צעד משמעותי בהתקדמות פתולוגית, הפיתוח של טיפולים שיכולים לייצב קשרים ולעודד התחדשות עשוי להניב תועלת משמעותית.
בעת ניתוח מורפולוגיה NMJ, בחירת שרירים היא בעלת חשיבות רבה. חלק מהשיקולים העיקריים עשויים לכלול סוג סיבי שריר, מיקום הגוף, וניתוח השוואתי למצבים אנושיים. בנוסף, כאשר נדרשות מניפולציות כגון הזרקת חומרים או פגיעה עצבית טראומטית, חשוב גם לשקול נגישות ניסיונית. באופן כללי, עדיף לנתח מגוון של שרירים הממוקמים בכל הגוף המשקפים מגוון של תת-סוגים של יחידות מוטוריות. לעתים קרובות, עם זאת, בחירת שרירים מושפעת על ידי קלות של ניתוח. כתוצאה מכך, ניתוח NMJ מבוצע לעתים קרובות אך ורק על שרירי נספח גדולים כגון gastrocnemius. כדי להשיג כתמי NMJ טובים בשרירים כאלה, חתך או הפרעה מכנית של סיבי שריר נדרש לעתים קרובות. כתוצאה מכך, דפוס innervation עלול להיות משובש וניתוח מקיף ואיכותי של דפוסי innervation, נבטים ו denervation נפגע לעתים קרובות. גישה חלופית היא להשתמש בשרירים שטוחים דקים שאינם דורשים חתך וניתן להכתים ולהרכיב ללא פגע, המאפשר סקירה מקיפה של כל innervation של השריר. ישנם מספר שרירים אשר ניתן להשתמש בהם לניתוח כזה, כולל קבוצה של שרירי הגולגולת, (מקיף levator auris longus, auricularis מעולה, ו adductor auris longus)14, שרירי בית החזה (למשל. טריאנגולריס סטרני) 15, ובטן (למשל transversus abdominis (TVA)) השרירים. המכשול העיקרי בשימוש בשרירים כאלה הוא המומחיות הטכנית הנדרשת כדי לנתח אותם ללא נזק.
בסרטון זה, אנו מספקים פרוטוקול לנתח ולבצע תיוג immunofluorescent של שריר TVA מן העכבר כדי לאפשר ניתוח מקיף של דפוס innervation ומורפולוגיה NMJ. שריר TVA הוא שריר עווית איטי בעיקר הכולל את השכבה העמוקה ביותר של שריר הבטן והוא innervated על ידי העצבים הבין צלעיים התחתון. עבודה קודמת הוכיחה את זה להיות פגיע מאוד באופן עקבי פתולוגיה במספר מודלים של העכבר של מחלת נוירון מוטורי בילדות ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA) ובמודלים אחרים של העכבר של ניוון נוירון מוטורי תחילת מוקדם4,16. לכן אנו מציעים כי TVA הוא שריר שימושי עבור ביצוע ניתוח NMJ נוירופתיות היקפיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

ניתוח של מורפולוגיה צומת neuromuscular יכול לתת תובנה חשובה על המצב הפיזיולוגי של נוירון מוטורי נתון. ניתוח של שרירים שטוחים דקים יכול להציע יתרון משמעותי על פני שרירים עבים המשמשים באופן מסורתי, כגון אלה של האיבר האחורי (למשל. גסטרוקנמיוס). שרירים דקים מאפשרים סקירה מקיפה של כל תבנית innervation לשריר נתון, אשר בתורו מאפשר זיהוי של בריכות פגיעות באופן סלקטיבי של נוירונים מוטוריים. שרירים אלה מאפשרים גם ניתוח של פרמטרים כגון גודל יחידה מוטורית, הסתעפות אקסונלית ונבטים סופניים/נודאליים. מכשול נפוץ בשימוש בשרירים כאלה הוא השגת המומחיות הטכנית לנתח אותם. בסרטון זה, אנו מפרטים את הפרוטוקול לנתח את השריר transversus abdominis (TVA) מעכברים צעירים וביצוע immunofluorescence לדמיין אקסונים וצמתים neuromuscular (NMJs). אנו מראים כי טכניקה זו נותנת סקירה מלאה של דפוס innervation של שריר TVA והוא יכול לשמש כדי לחקור פתולוגיה NMJ במודל העכבר של מחלת נוירון מוטורי בילדות, ניוון שרירים בעמוד השדרה.

הפרוטוקול לעיל מנחה את הבידוד והכתמים של שריר TVA לניתוח NMJ. זה מאפשר ניתוח הרכבה שלם של דפוסי innervation שרירים, כמו גם ניתוח ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיה NMJ (איור 2). טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בהצלחה כדי לחשוף פתולוגיה NMJ במודלים העכבר של מחלת נוירון מוטורי, כגון SMA4,17(איור 3). במודלים העכבר של SMA יש שונות תוך שרירית משמעותית בפתולוגיה, אולם שריר TVA מושפע באופן עקבי מאוד. עדות לכך היא דנרוויציה של לוחות מוטוריים, הצטברות של נוירופילמנטים בטרמינל הפרסינפטי ונבטים סופניים(איור 3). התוצאות המוצגות כאן מראות אפוא כי הטכניקה המתוארת לעיל יכולה להיות שיטה רבת עוצמה לספק סקירה מקיפה של innervation וניתוח של פתולוגיה NMJ במודלים העכבר.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> איור 1. סקירה כללית של שרירי הבטן של העכבר. (A) התמונה מראה את כלוב בית החזה עם שרירי בטן מחוברים, אשר הוסר מעכבר שהורדם לאחרונה והוצמד בצד שטחי צלחת ניתוח למעלה (A). (B) ניתוח ב- A כבר ביאורים כדי לסמן את הגבולות המשוערים של שרירי הבטן. שרירי הבטן השטחיים ניתן לראות בצד שמאל של הניתוח, וכוללים אלכסוני חיצוני (מתואר בכחול) ורקטוס abdominis (מתואר באדום). בצד ימין של הניתוח, השרירים השטחיים הוסרו מותר הדמיה של שריר abdominis transversus (מתואר בירוק) ואת השריר האלכסוני הפנימי (מתואר בצהוב). מטרת פרוטוקול זה היא לכוון את הניתוח של החלק העליון של שריר TVA, המוצג כאן כמשולש ירוק מוצק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> איור 2. סקירה שלמה של צמתים עצביים בשריר TVA. תמונות המציגות NMJs לדוגמה משריר ה- TVA דמיינו עם כתמים אימונופלואורסצנטיים לפילוח עצבי (NF; ירוק), חלבון בסינפטיקה 2 (SV2; ירוק) ובונגרוטוקסין (BTX; אדום). תמונות הן מיקרוגרפים פלואורסצנטיים מונטאז'ים המציגים את כל השריר (A) או תמונות קונפוקל המציגות קבוצות (B) או בודדים (C) NMJs. סרגל קנה מידה = 800 מיקרומטר (A), 70 מיקרומטר (B), 25 מיקרומטר (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> איור 3. נוירומוסקולרי צומת פתולוגיה בשריר TVA ממודל העכבר של SMA. מיקרוגרפים קונפוקלים המציגים NMJs משריר ה- TVA דמיינו עם כתמים אימונופלואורסצנטיים לפילוח עצבי (NF; ירוק), חלבון סינפטי 2 (SV2; ירוק) ובונגרוטוקסין (BTX; אדום) משליטה אחת (Smn2B /+) או מדגם העכבר SMA (Smn2B /-). שים לב כי בעוד מורפולוגיה NMJ נורמלי ניתן לראות עכברי בקרה, בשרירי TVA מ Smn2B /- עכברים יש ראיות של denervation מלא (ראש חץ לבן), denervation חלקית (ראש חץ סגול) נבטי מסוף (ראש חץ כחול) ונפיחות presynaptic (ראש חץ צהוב). לוחות הסיום הפוסט-סינפטיים גם פחות מורכבים ומשקפים פנוטיפ שככל הנראה פחות בוגר. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis at JoVE.com

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

בסרטון זה אנו מדגימים פרוטוקול לניתוח שריר העבדות של העכבר ומשתמשים בכשל חיסוני ובמיקרוסקופיה כדי לדמיין צמתים נוירומוסקולריים.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

dissection-transversus-abdominis-muscle-for-whole-mount-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

11.5K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. בסרטון זה אנו מדגימים פרוטוקול לניתוח שריר העבדות של העכבר ומשתמשים בכשל חיסוני ובמיקרוסקופיה כדי לדמיין צמתים נוירומוסקולריים.

Video: Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...