Эта работа была поддержана грантами от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (грант номер MOP 38040) для Р.К., мышечной дистрофии ассоциации (США) для Р.К., семьи SMA в Р.К. и Л.M.M, SMA Trust к T.H.G., и мышечной дистрофии кампании T.H.G. Л.M.M является получателем Рассеянного склероза общества Канады постдокторской стипендии, и Р.К. является получателем университета здравоохранения научно-исследовательский кафедры из Университета Оттавы.

Все процедуры должны выполняться в установленные учреждением стандарты по уходу за животными.
1. Рассечение брюшной мускулатуры от мыши
<ol><li>Перед началом, составляют 4% параформальдегид (PFA). Внимание: Всегда держите PFA в паровом капюшоне и носите соответствующее защитное оборудование.</li>
	<li>Усыпание мыши утвержденным методом. Примечание: Мышь, показанная на видео, была усыпляется передозировкой CO2 и вывихом шейки матки. Эта мышь представляет собой 4-недельную мышь дикого типа на гибридном фоне CD1/C57Bl6. Эта мышь была выведена в животных объектов в Университете Оттавы от мышей, которые были первоначально приобретены.</li>
	<li>Сделайте первоначальный разрез через кожу на уровне бедра и прорезать кожу всю дорогу вокруг мыши.</li>
	<li>Очистите кожу, потянув вверх, пока не достигнете уровня forelimb.</li>
	<li>Вырезать через брюшную мускулатуру на уровне бедра и продолжать разрез, пока не достигнет позвоночного столба.</li>
	<li>В этот момент, начать резать вверх через мускулатуру и ребра, пока вы не достигнете верхней конечности.</li>
	<li>Вырезать прямо поперек, пока вы не достигнете позвоночного столба на другой стороне.</li>
	<li>Вырезать вниз, пока вы не достигнете точки, в которой вы начали.</li>
	<li>Отпустите диафрагму снизу (заботясь, чтобы не повредить мышцу TVA) и поместите его в фосфат буферный солевой раствор (PBS) в SYLGARD покрытием рассечения блюдо с 0,2 мм рассечения булавки.</li>
	<li>Прикрепите грудную клетку и связанные с ней мускулатуры в блюдо, поверхностные стороны вверх, убедившись, что мышцы полностью растягивается.</li>
	<li>Слейте 1x PBS и заменить 4% PFA.</li>
	<li>Накрыть крышкой и оставить на качалке при комнатной температуре на 15 мин.</li>
	<li>Вымойте 3x в 1x PBS при комнатной температуре в течение 10 мин.</li>
</ol>В этот момент фиксированные мышцы могут быть оставлены в холодильнике на ночь перед последующим вскрытием.
2. Изоляция мышц TVA
<ol><li>Чтобы приступить к изоляции мышцы TVA, под микроскопом вскрытия, начните с резки через внешнюю косую мышцу на уровне последних нескольких ребер (см. рисунок 1 для аннотированного руководства).</li>
	<li>Вырезать прямо рядом с linea Альба (забота, чтобы не прорезать TVA ниже), пока вы не достигнете начала внутренней косой мышцы.</li>
	<li>Затем разрезать, чтобы освободить чрезмерно rectus abdominis и внешних косых мышц из верхней части TVA ниже.</li>
	<li>Удалите кровеносный сосуд и любой чрезмерного жира из мышцы TVA.</li>
	<li>Освободите мышцу от чрезмерного последнего ребра.</li>
	<li>Вырезать вокруг края мышцы и удалить на 24-хорошо пластины, содержащей PBS.</li>
</ol>3. Иммунофлюоресцентная маркировка и микроскопия мышцы TVA
Для всех последующих шагов снимите жидкость с помощью тонкой наконечником пипетки и оставьте пластину на качалочной платформе. Если не указано иное, все последующие шаги выполняются при комнатной температуре.
<ol><li>Инкубационный в PBS, содержащий 1:1,000 флуоресцентно помечены bungarotoxin в течение 30 минут, чтобы обозначить NMJs. Это можно сделать в темной комнате или под фольгой.</li>
	<li>Permeabilize мышцы, добавив 300 мкл на колодец 2% Triton X-100 в PBS и оставить на качалки платформы в течение 30 мин.</li>
	<li>Инкубация в блокирующих реагентах (4% BSA, 1% Triton в PBS) в течение 30 мин.</li>
	<li>Инкубационный в блокировании реагент, содержащий первичные антитела (нейрофиламент 1:100; синаптический белок пузырьков 2, 1:250) при 4 градусах Цельсия за ночь.</li>
	<li>Вымойте 3x в 1x PBS.</li>
	<li>Инкубация в PBS, содержащая 1:250 вторичных антител в течение 2-4 часов.</li>
	<li>Вымойте 3x в 1x PBS.</li>
	<li>Намонтировать мышцы на стеклянные горки с использованием достаточного флуоресцентного монтажа средств массовой информации и крышки.</li>
	<li>Слайды лучше всего просматривать с помощью фильтра двойного диапазона прохода на стандартном эпифлюоресцентном микроскопе.</li>
	<li>NMJ лучше всего известен с помощью проекции z-серии на конфокальцаторе, оснащенном, по крайней мере, целью 40X.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

В этом видео, у нас есть подробный протокол для вскрытия мышцы TVA от мыши и для всей установки иммунофторной маркировки NMJs в мышце. Мы также представляем данные, показывающие, что эта мышца может быть использована для анализа нервно-мышечной патологии соединения в мышиной модели SMA.
Успех в этом методе зависит от ряда факторов. Некоторые из наиболее распространенных проблем изложены ниже. Во-первых: плохое иммуногистохимическое окрашивание. Для этого может быть несколько причин, одной из наиболее распространенных из которых является использование различных реагентов к тем, которые перечислены в этом протоколе. Высокое качество электронной микроскопии класса PFA очень важно для обеспечения хорошего окрашивания, как и выбор антител, перечисленных в этом протоколе. Кроме того, у пожилых животных(т.е.> 3 месяца), получить хорошее качество окрашивания может быть сложнее. Это связано с увеличением толщины фасции, окружающей мышцу, и увеличением накопления жира между внешним косым и tranversus abdominis. Важно, чтобы сдирать жир, прежде чем приступить к иммунофлюоресценции. Это также может быть необходимо, чтобы сдирать некоторые фасции, покрывающей мышцы, которые могут стать утолщенными. Иногда трудно лишить фасции и жира из мышц, не понеся некоторые повреждения мышечного волокна и нарушения иннервации картины. Однако, если этот метод выполняется тщательно, хорошее качество окрашивания могут быть приобретены у мышей до по крайней мере 1 год. У более молодыхмышей (т.е.менее 3 месяцев) не должно быть необходимости выполнять какие-либо дразнить или разделения мышечных волокон. Во-вторых: трудно найти NMJs после вскрытия и окрашивания. Это часто потому, что вскрытие не распространяется под последним ребром. Большинство NMJs расположены чуть ниже последнего ребра и, следовательно, необходимо позаботиться, чтобы обеспечить эту часть мышцы включены в вскрытие. В-третьих: присоединение мышцы ЭО к мышце TVA. Это часто жалоба, когда люди пытаются продлить вскрытие ниже уровня внутренней косой (IO) мышцы. Область мышцы TVA, где io также присутствует, труднее анализировать, так как может быть трудно различить, какая мышца есть какая. По этой причине, мы обычно просто вскрыть наиболее превосходную часть мышцы TVA. На этом уровне, нет никакой приверженности между мышцами EO и TVA, и поэтому это не должно быть существенной проблемой.
Одним из значительных препятствий для использования мышцы TVA, по сравнению с аппендикулярными мышцами, является доступность для хирургических манипуляций или инъекций веществ. Эти типы экспериментов могут иметь решающее значение для исследования физиологии NMJ в данной мышце. Хотя TVA, безусловно, менее легко доступны, чем более часто используемые мышцы, такие как tibialis передней или gastrocnemius, предыдущая работа показала, что можно denervate TVA хирургическим повреждением межреберныхнервов 18. Недавно мы также использовали эту мышцу для местного администрирования веществ под общим наркозом (неопубликованные данные). Хотя эти эксперименты могут представлять собой умеренную техническую проблему, эта работа показывает, что они осуществимы и, таким образом, расширить полезность этой мышцы для анализа NMJs под патологических и физиологических манипуляций.
Мышцы TVA является одним из ряда тонких плоских мышц, расположенных по всему телу, которые могут быть использованы для цельно-монтажного анализа иннервации моделей. Другие мышцы включают в себя группу черепных мышц иннервированы двигательных нейронов, происходящих из лицевого ядра ствола мозга, охватывающих levator auris longus, auricularis начальник, и аддуктор auris longus, вскрытия, для которых былиописаны ранее 14,19. Кроме того, мускулатура окружающих мышцы TVA, в том числе EO, IO, и rectus abdominis, также могут быть помечены и использованы для анализа NMJ. Для всестороннего анализа патологии NMJ в модели мыши, важно рассмотреть ряд мышц, расположенных по всему телу и не ограничивать анализ одной мышцы. Это иллюстрируется в мышиных моделях заболеваний моторных нейронов, где существует значительная неоднородность в уровнях патологии NMJ между различными мышцами20. Такая межмышечная изменчивость является чрезвычайно ценным инструментом при исследовании механизма уязвимости моторных нейронов и, следовательно, ограничение анализа одной мышцы может значительно уменьшить потенциал исследования.

Нейромышечные соединения (NMJs) являются синаптической связью между нижним моторным нейроном и скелетным мышечным волокном. Они традиционно считаются трехсторонней синапсе, состоит из нейрона (пресинаптического терминала), мышечного волокна (пост синаптический терминал) и терминальной ячейкиШванн 1. NMJs, как представляется, ранние и значительные цели в патологии в ряде заболеваний моторных нейронов и мышимодели 2,3. Типичными симптомами являются денервация, при которой двигательная эндплейт становится лишенной пресинаптической иннервации, отек пресинаптического терминала и снижение сложности морфологии NMJ4-11. Компенсационные ответы также могут быть отмечены, которые включают терминал и норд прорастания, где аксональные процессы простираются от оставшихся синаптических терминалов или интернодов до reinnervated denervated endplates12,13. Из-за жесткой корреляции между синаптической активностью и морфологией NMJ, можно получить много информации о функциональном состоянии моторных нейронов из анализа морфологии NMJ. Поскольку потеря NMJ часто представляет собой один из первых аспектовнервно-мышечной патологии 4,10, количественная оценка на уровне иннервации может дать важную информацию о прогрессировании патологии и потенциальном эффекте терапевтического вмешательства. Кроме того, поскольку потеря NMJ представляет собой значительный шаг в патологическом прогрессии, развитие терапевтических средств, которые могут стабилизировать связи и стимулировать регенерацию, может принести значительную пользу.
При анализе морфологии NMJ, выбор мышц имеет большое значение. Некоторые из основных соображений могут включать тип мышечного волокна, положение тела, и сравнительный анализ условий жизни человека. Кроме того, в тех случаях, когда требуются такие манипуляции, как инъекция веществ или травматическая травма нерва, важно также учитывать экспериментальную доступность. В целом, предпочтительнее анализировать диапазон мышц, расположенных по всему телу, отражающий ряд подтипов моторных единиц. Часто, однако, выбор мышц зависит от простоты вскрытия. Следовательно, анализ NMJ часто выполняется исключительно на больших аппендикулярных мышцах, таких как гастрокнеймиус. Для получения хорошего Окрашивания NMJ в таких мышцах часто требуется секционные или механические нарушения мышечных волокон. В результате, иннервация картина может стать нарушена и всеобъемлющий и высококачественный анализ иннервации моделей, прорастания и денервации часто скомпрометирована. Альтернативный подход заключается в использовании тонких плоских мышц, которые не требуют секции и могут быть окрашены и установлены нетронутыми, что позволяет всеобъемлющий обзор всей иннервации мышц. Есть ряд мышц, которые могут быть использованы для такого анализа, в том числе группа черепных мышц, (охватывающих леватор auris longus, auricularis выше, и аддуктор auris longus)14, грудные мышцы(например. триангуляции стерни) 15, и брюшной(например, поперечные abdominis (TVA)) мышцы. Основным препятствием в использовании таких мышц является техническая экспертиза, необходимая для вскрытия их без повреждений.
В этом видео, мы предоставляем протокол для вскрытия и выполнения иммунофлуоресцентной маркировки мышцы TVA от мыши, чтобы позволить всеобъемлющий анализ иннервации картины и морфологии NMJ. Мышцы TVA является преимущественно медленно дергаться мышцы, состоящие из глубочайшего слоя брюшной мускулатуры и innervated нижних межреберных нервов. Предыдущая работа показала, что он постоянно очень уязвим к патологии в ряде моделей мыши детства двигательной нейронной атрофии спинальной мышечной атрофии (SMA) и в других моделях мыши раннего начала двигательной дегенерациинейронов 4,16. Поэтому мы предлагаем, что TVA является полезной мышцей для проведения анализа NMJ в периферических невропатий.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

Анализ нейромышечной морфологии соединения может дать важное представление о физиологическом состоянии данного моторного нейрона. Анализ тонких плоских мышц может предложить значительное преимущество по сравнению с традиционно используемыми более толстыми мышцами, такими как мышцы заднейконечности (например. гастрочнемиус). Тонкие мышцы позволяют всесторонне о обзоре всей иннервации данной мышцы, что, в свою очередь, позволяет идентифицировать выборочно уязвимые пулы моторных нейронов. Эти мышцы также позволяют анализ параметров, таких как размер моторного блока, аксональный ветвление, и терминал / нодаль прорастания. Общим препятствием в использовании таких мышц является получение технических знаний, чтобы вскрыть их. В этом видео мы подробно протокол для вскрытия поперечного abdominis (TVA) мышцы от молодых мышей и выполнения иммунофторесценции для визуализации аксонов и нервно-мышечных соединений (NMJs). Мы демонстрируем, что этот метод дает полный обзор иннервации картины мышцы TVA и может быть использован для исследования патологии NMJ в мышиной модели болезни моторных нейронов детства, спинальной мышечной атрофии.

Вышеупомянутый протокол направляет изоляцию и окрашивание мышц TVA для анализа NMJ. Это позволяет провести анализ структур иннервации мышц, а также анализ морфологии NMJ с высоким разрешением(рисунок 2). Этот метод может быть успешно применен для выявить патологию NMJ в мышиных моделях двигательных нейронов, таких как SMA4,17(рисунок 3). В мышиных моделях SMA существует значительная внутримышечная изменчивость в патологии, однако мышца TVA постоянно сильно влияет. Об этом свидетельствует денервация моторных эндпластов, накопление неврофиламентов на пресинаптическом терминале и прорастание терминала(рисунок 3). Представленные здесь результаты показывают, что описанный выше метод может быть мощным методом для обеспечения всестороннего обзора иннервации и анализа патологии NMJ в моделях мыши.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> Рисунок 1. Обзор брюшной мускулатуры мыши. (A) Изображение показывает грудной клетке с прилагается брюшной мускулатуры, которая была удалена из недавно усыпанной мыши и возлагали в рассечение блюдо поверхностной сторонойвверх( ). (B)Рассечение в А было аннотировано, чтобы отметить приблизительные границы мышц живота. Поверхностные мышцы живота можно увидеть на левой стороне вскрытия, и включают в себя внешние косые (очерченные синим цветом) и rectus abdominis (очерченные красным цветом). На правой стороне вскрытия, поверхностные мышцы были удалены позволило визуализации поперечной мышцы abdominis (очерченные зеленым цветом) и внутренней косой мышцы (очерченные желтым цветом). Цель этого протокола состоит в том, чтобы направить вскрытие верхней части мышцы TVA, показанной здесь как сплошной зеленый треугольник. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> Рисунок 2. Цельно-монтаж обзор нервно-мышечных соединений в мышцах TVA. Изображения, показывающие пример NMJs из мышцы TVA визуализированы с иммунофлуоресцентным окрашиванием для неврофиламента (NF; зеленый), синаптический протеин пузырьков 2 (SV2; зеленый) и бунгаротоксин (BTX; красный). Изображения монтаж флуоресцентные микрографы, показывающие всю мышцу (A) или конфокальные изображения, показывающие группы (B) илиотдельных( C ) NMJs. Шкала бар 800 мкм (A), 70 мкм (B), 25 мкм (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> Рисунок 3. Нейромышечная патология соединения в мышце TVA от мышиной модели SMA. Конфокальные микрографы, показывающие NMJs из мышцы TVA визуализированы с иммунофлуоресцентным окрашиванием для нейрофиламента (NF; зеленый), синаптический протеин пузырьков 2 (SV2; зеленый) и бунгаротоксин (BTX; красный) от любого контроля(Smn2B /) или SMA мыши модели (Smn2B / -). Обратите внимание, что в то время как нормальная морфология NMJ может наблюдаться у контрольных мышей, в мышцах TVA от Smn2B/- мышей есть свидетельства полной денервации (белая наконечник стрелы), частичной денервации (фиолетовая наконечник стрелы) терминальной прорастания (голубая наконечник стрелы) и пресинаптического отека (желтая наконечник стрелы). Пост-синаптические конечные пластины также менее сложны, отражая явно менее зрелый фенотип. Шкала бар 50 мкм. Нажмите <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">здесь, чтобы просмотреть изображение больше .</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis at JoVE.com

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

В этом видео мы демонстрируем протокол для вскрытия поперечной мышцы абдоминиса мыши и используем иммунофлуоресценцию и микроскопию для визуализации нервно-мышечных соединений.

Рассечение мышц Transversus Abdominis для анализа нервно-мышечной развязки

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

dissection-transversus-abdominis-muscle-for-whole-mount-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

11.5K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. В этом видео мы демонстрируем протокол для вскрытия поперечной мышцы абдоминиса мыши и используем иммунофлуоресценцию и микроскопию для визуализации нервно-мышечных соединений.

Video: Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Препарирование Мышь Око за полного горе пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Препарирование и обработка изображений активных зон в Drosophila Нервно-мышечном соединении

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Воспроизводимые мыши седалищного нерва и Давка Последующие оценки регенерации полного анализа горы мышц

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Последовательное фото-отбеливание разграничить отдельные клетки шванновских в нервно-мышечном соединении

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Всего Гора иммунного обонятельных рецепторов нейронов в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Антенны

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Всего горе Вскрытие и Иммунофлуоресценции взрослых мышей улитки

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Почему Количественное вопросы: Определение характеристик фенотипов на<em&gt; Drosophila</em&gt; Личиночная нейромышечных синапсах

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Мозги

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Измерение функции нервно-Джанкшен

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Фокуса Macropatch записи синаптических токов от дрозофилы личиночной нервно-Джанкшен

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...