Injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires

Ce protocole décrit la technique permettant de générer des modèles murins portant l’ostéosarcome primaire et les lésions de métastases pulmonaires. Par injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome, ce modèle imite au mieux les caractéristiques de développement clinique de l’ostéosarcome tumoral. Un nombre précis de cellules d’ostéosarcome sont directement injectées dans le tibia à l’aide d’une seringue en microvolume, ce qui permet d’obtenir des taux de formation de tumeurs et des volumes tumoraux identiques.

Le jour de l’injection de cellules d’ostéosarcome, lavez les cellules deux fois avec PBS. Trypsiniser les cellules avec 1,5 millilitres de 0,25% de trypsine pendant trois minutes. Ajoutez ensuite six millilitres de milieux MEM contenant 10 % de sérum.

Recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Aspirer 20 microlitres de suspension cellulaire dans la chambre de la plaque de comptage cellulaire et calculer la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatique. Centrifuger les cellules à 800 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.

Aspirer le surnageant avec une pipette, remettre en suspension la pastille de cellule dans une matrice de membrane basale de 8,5 milligrammes par millilitre et les placer sur de la glace. Placez la souris en position couchée. Tenez la cheville de la souris à l’aide du pouce et de l’index et désinfectez le site d’injection du tibia avec un écouvillon à 70% d’éthanol.

Faites pivoter l’articulation de la cheville de chaque souris vers l’extérieur pour déplacer le tibia et le péroné, et pliez l’articulation du genou dans une position appropriée jusqu’à ce que le plateau du tibia proximal soit visible à travers la peau. Fixez l’aiguille à une seringue d’un millilitre et pointez la pointe de l’aiguille vers le site d’injection, parallèlement à l’axe du tibia. Insérez l’aiguille par voie percutanée pour percer un trou à travers la plate-forme du tibia vers l’extrémité distale du tibia.

Chargez la suspension de cellules d’ostéosarcome précédemment placée sur de la glace dans une seringue en microvolume et remplacez la seringue d’un millilitre dans le tibia par la seringue à microvolume chargée de cellules d’ostéosarcome. Injecter lentement environ 10 microlitres de suspension de cellules d’ostéosarcome dans le tibia de chaque souris atymique sans appliquer beaucoup de pression. Retirez ensuite la seringue à microvolume du site d’injection et appuyez sur le site avec le coton-tige pendant environ 30 secondes.

Replacez la souris dans une cage propre et observez sa récupération pendant 10 minutes. Cette figure représente le modèle murin atteint d’ostéosarcome orthotopique développé à partir de l’injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome et sa forme isolée. Une augmentation progressive du volume tumoral est observée chaque semaine.

Les images radiographiques obtenues de la première à la sixième semaine après l’injection de cellules d’ostéosarcome marquées par la luciférase ont montré une augmentation progressive du volume. De plus, l’image obtenue après l’injection dans le tibia de la souris a montré une croissance de l’ostéosarcome orthotopique in vivo. Les métastases pulmonaires causées par l’injection intratibiale des cellules de l’ostéosarcome ont été suivies avec succès in vivo à l’aide d’un système d’imagerie en direct par bioluminescence.

L’observation sous stéréomicroscope a révélé des colonies métastatiques dans les tissus pulmonaires isolés. La coloration HE sur les tissus pulmonaires incrustés de paraffine a montré des lésions métastatiques. L’aiguille doit être insérée par voie percutanée dans la capsule articulaire à travers le ligament rotulien pour percer un trou à travers la plate-forme du tibia vers le tibia numérique en faisant pivoter la seringue.