Les figures 1 et 2 ont déjà été publiés en biologie et médecine (Queliconi et al. 5) Free Radical et avoir le droit d&#39;auteur détenus par Elsevier. Ce travail a été soutenu par le Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), l&#39;Instituto Nacional de Tecnologia e Ciência de Processos Redox lui Biomedicina, Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox lui Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), et USPHS GM087483 (KN ). BBQ est un étudiant au doctorat soutenue par une bourse FAPESP.

Une. C. elegans croissance <ol><li> Préparer 35 mm nématode croissance médias (NGM) des plaques de gélose ensemencées avec des bactéries OP50, que par les méthodes de culture standards 1. </li><li> Synchroniser C. elegans en plaçant 6 adultes gravides sur une plaque NGM graines. Retirez les adultes après ~ 100 œufs ont été pondus (~ h de 3). </li><li> Incuber les plaques pendant 3 jours à 20 ° C, à quel point les vers se sont développées en stade jeune adulte et sont optimales pour cette expérience. Des protocoles alternatifs pour synchroniser C. elegans sont décrits ailleurs 10. </li></ol> 2. Matériaux pour AS <ol><li> Tampon M9 (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM de NaCl, 1 mM de MgSO 4) doit être purgé de l&#39;oxygène par équilibrage avec du N2 (argon peut aussi être utilisé) pendant 30 min avant l&#39;expérience et entretenu, entouré de glace. </li><li> Faire un petit trou (3 mmde large) dans le couvercle de 1,5 ml microtubes dans lequel les vers seront placés durant AS. Le trou permet l&#39;échange de gaz sans garder le couvercle ouvert, car cela peut conduire à l&#39;évaporation excessive des médias. </li></ol> 3. Anoxie / famine <ol><li> Effectuer toutes les expériences au moins en triple exemplaire. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon de RT, M9 oxygénée à chaque plaque de 35 mm contenant jeunes vers adultes cultivés comme décrit ci-dessus. Soyez prudent pour éviter l&#39;élimination des bactéries de la plaque (M9 ajouter aux bords où les bactéries ont été ensemencées pas). Après ~ 1 min les vers doivent être nagent dans le M9. </li><li> Manteau un embout de pipette de 1 ml avec de la BSA par pipetage et à expulser une solution stérile de la BSA à 1%. </li><li> Incliner délicatement la plaque contenant les vers dans un tampon M9, retirez le M9 de l&#39;endroit même où il a été ajouté, et placer la suspension dans les microtubes préparés. Laisser reposer dans la glace jusqu&#39;à ce que les vers ont chuté au fond des tubes (~ 1-2 Min). </li><li> Retirez le maximum de M9 possible sans perturber les vers du tube (en laissant environ 100 pi), ajouter 1 ml de la M9 oxygène purgé et glacé et placer le tube sur la glace jusqu&#39;à ce que les vers se déposent au fond de nouveau. Répétez la dernière étape 3x. Dans le dernier lavage, retirer le M9 jusqu&#39;à ~ 100 pi reste dans le tube. </li><li> Placer les tubes avec les vers dans désoxygéné M9 l&#39;intérieur d&#39;une chambre anoxique / hypoxique (voir les instructions ci-dessous, la section 3.6.1) ou, à défaut, dans un récipient scellé personnalisé (voir les instructions ci-dessous, la section 3.6.2). <ol><li> Si une chambre de anoxique / hypoxique commercial doit être utilisé, laissez un M9 purgé l&#39;intérieur de la chambre avant l&#39;étape 3.5 de départ et répétez l&#39;étape 3.5 une fois que les vers sont dans la chambre. </li><li> Si une chambre personnalisée doit être utilisé, une description détaillée de la façon de créer un appareil à faible coût est présenté à la fin de ce protocole et a été décrit par un autre groupe auparavant 11. En bref: <ol&gt; <li> Faites deux trous dans un couvercle de 250 ml contenant Tupperware-type et ajouter des connecteurs de tubes pour eux. L&#39;un servira à injecter le mélange gazeux alors que l&#39;autre sera la sortie de gaz dans un bain d&#39;eau. </li><li> Placer les vers dans la chambre et fermer la chambre à l&#39;aide du couvercle. </li><li> Gaz avec un flux constant de N2 (100 ml / min). </li><li> Placer le récipient dans un bain-marie à 26 ° C. Assurez-vous que le tube de sortie est bien immergé dans l&#39;eau donc pas de retour d&#39;air et qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites dans le système (apparente par des bulles provenant de la chambre elle-même). </li></ol></li></ol></li><li> Incuber les vers à 26 ° C pendant 20 heures. </li></ol> 4. Reperfusion simulée <ol><li> Après 20 heures sous conditions, retirer les tubes de la chambre d&#39;incubation dans l&#39;air ambiant. </li><li> Pipette C. elegans avec une pointe BSA enduit (comme dans l&#39;étape 3.3) sur un OP50 ensemencé 35 mm de plaque NGM. Incuber les plaques à 20 ° C pendant 24 heures.Après cela, les vers seront prêts à être marqué. </li></ol> 5. Identifier les morts Versus vers vivants <ol><li> Avec une pointe de platine, toucher légèrement le dessus de la tête de la vis sans fin. Vers vivants se déplacent vers l&#39;arrière après avoir été touché. Si les vers sont répondaient pas, marquer comme mort. De temps en temps, un ver ne sera pas revenir en arrière, mais peut présenter un léger mouvement de la tête d&#39;un côté à côté. Bien que pas techniquement mort, ces vers sont presque certains d&#39;expirer dans quelques heures, et devraient être marqués comme mort. Si l&#39;on attend trop longtemps pour marquer les vers, l&#39;éclosion interne de la descendance peut se produire et ces «sacs-de-vers&quot; peut se rompre, ce qui rend la détection des carcasses très difficile. </li><li> Retirez les deux vers vivants et morts de la plaque, ils sont pris pour éviter des comptes dupliqués. Les vers de terre vivants peuvent être déplacés vers une plaque séparée pour effectuer des essais de comportement. La quantité de vers vivants par rapport au total est représenté comme le% de vers survivants (figure 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Touchez Essai de réponse <ol><li> Une description détaillée de ce protocole a été présenté dans Hart, Anne C., ed. Comportement (Juillet 3, 2006), WormBook, éd. Le C. Communauté elegans recherche, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Pour marquer la réponse au toucher, identifier les vers qui se déplacent et appuyez légèrement sur ​​le côté de la tête de la vis sans fin (près de la partie centrale du pharynx) avec un pic à cil (figure 3). </li><li> Si le ver se déplace vers l&#39;arrière, marquer le plus sensible, si pas, marquer comme non (figure 1B). Répétez cette étape 10-15x pour chaque ver avec des intervalles de 10 sec. Sonder au moins 10 vers dans chaque groupe de disposer de données précises. La même analyse peut être utilisée pour évaluer les changements avant de locomotion suivante légère touche à la paroi postérieure du corps. Veillez à ne pas toucher la tête ou la queue du ver, car cela stimule un comportement distinct. </li><li> Enfin,souches génétiques de contrôle des sociétés [de type sauvage N2 Bristol, mec (mécano) mutant positif pour le négatif - par exemple CB1338 mec-3 (e1338) IV] pour calibrer la force avec laquelle toucher les vers. Trop dur d&#39;une stimulation seront obtenir une réponse comportementale chez les mutants de mec, trop peu ne sera pas obtenir un effet dans les contrôles N2 type sauvage. </li></ol></li></ol> 7. Neuronale modifications <ol><li> Pour visualiser poste AS modifications neuronales, utiliser une souche qui exprime la GFP dans les neurones mec tactiles répondant 4,5. Ces neurones ont un long processus qui courent le long de la paroi du corps et sont facilement avantage des anomalies morphologiques. En outre, l&#39;information morphologique peut être intégré avec les mesures comportementales de la fonction neuronale, tels que décrits ci-dessus. Une souche qui peut être utilisé à cette fin est TU2583, qui est disponible auprès de la C. elegans Centre de Génétique et contient le transgène intégré de uIs25 exprimant la GFP vientm le promoteur mec-18, ou en variante TU2562, qui contient un mec-3 :: GFP fusion intégré. </li><li> Préparer un tampon d&#39;agarose. <ol><li> Faire fondre 2% d&#39;agarose dans l&#39;eau, porter à 1x M9 avec un 10x stock, et maintenir la solution à 70 ° C. </li><li> Déposer une goutte (~ 20 ul) de cette solution sur une lame de verre (25 mm x 75 mm) qui a été placé entre deux autres diapositives, chacun d&#39;eux ayant un seul morceau de ruban adhésif sur leur côté inférieur. </li><li> Placer une lame de verre finale perpendiculaire à la première au-dessus de la solution d&#39;agarose à 2%, et le laisser refroidir à température ambiante. Cela devrait former un tampon qui est l&#39;épaisseur de la bande. </li><li> Retirer la lame supérieure et ajouter 10 ul de M9 contenant 0,1% tetramisole, qui immobiliser les vers. </li></ol></li><li> Déplacez une partie (~ 10) vers vivants sur la lame d&#39;agarose à 2%. Placer une lamelle couvre-objet sur eux et de visualiser la GFP en utilisant un microscope à fluorescence sous un objectif 100X avec un éclairage approprié. </li><li> Endommagéneurones vont montrer une chaîne cytosolique de la membrane de motif de perles dans les procédés, qui comprend punctum multiple (figure 2A), et / ou des anomalies où les procédés semblent être rompu (figure 2B). Comptez punctum et des anomalies dans les deux neurones pour chaque ver, en utilisant un total d&#39;au moins 10 vers. </li></ol> 8. Lab-fait hypoxique Chambre <ol><li> Un style Tupperware, refermable, contenant hermétique pouvez rajouter comme une chambre anoxique. Prenez soin de sélectionner un conteneur qui est aussi petit que possible. Un petit récipient crée un environnement hypoxique plus rapide et plus facile à tenir dans le bain d&#39;eau (figure 4). </li><li> Faites deux trous sur le couvercle (qui peut être fait avec un tournevis ou en chauffant forceps et en forçant dans le couvercle) et insérer un connecteur en plastique ou en métal qui s&#39;adapte le tube (figure 5A). Utilisez de la colle qui peut être placé sous l&#39;eau, et obtient également dur après séchage, évitant mouvement dele connecteur et donc de réduire le risque de fuite (Figure 5B). </li><li> Le récipient doit être placé dans le bain d&#39;eau de sorte qu&#39;elle soit complètement immergé (figure 4). Pour plonger le récipient, utiliser un poids de bouteille ou un poids de plongée. </li><li> L&#39;un des raccords de tubes seront utilisés pour introduire un mélange de gaz et l&#39;autre tube agira comme un limiteur de pression, d&#39;où il doit être laissé sous l&#39;eau de sorte que le récipient est étanche par rapport à l&#39;environnement extérieur (figure 4). </li><li> La composition de l&#39;air peut être modulée à l&#39;aide de gaz fait sur commande, des régulateurs de débit de masse ou n&#39;importe quel dispositif qui mélange les gaz souhaités. Le débit de gaz doit être contrôlée, comme à haut débit peut créer une évaporation excessive. Par exemple, dans un ml contenant 250, 100 ml / min de gaz fournira un bon espace pour les vers et un flux approprié. </li><li> La longueur du tube doit être maintenue à un minimum, car ils peuvent être perméable au gaz, unllowing l&#39;entrée de O 2. Il est important d&#39;éviter d&#39;utiliser du silicone, tubes Tygon que ces matériaux sont perméables aux échanges gazeux. Nous préférons des tubes en polypropylène ou en nylon. Verre ou tubes métalliques maintiennent les gaz bien, mais est aussi plus difficile de travailler avec. </li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li><li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia.">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li><li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. k. o. g. e. r. b. &. #. 2. 4. 8. ;. G., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression.">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li><li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme,+Ndi1,+in+myocardial+reperfusion+injury.">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288 (2011).</li><li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development.">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Comme il a été largement utilisé dans C. elegans pour modéliser blessure IR. Quelques points clés doivent être mis en évidence pour ce protocole: C. elegans sont résistants à un large éventail de blessures, ce qui justifie la nécessité pour 3 insultes concomitants (chaleur, la famine et l&#39;anoxie) pour atteindre la mort en utilisant ce système. Anoxie seul ne tue pas les vers dans ce laps de temps 14. En outre, l&#39;augmentation de température est un stress supplémentaire, il est donc important de surveiller de près. Strictement parlant, la famine ne contribue pas de manière significative le degré de mortalité observée 7, en soi, mais elle semble réduire la variabilité entre les différents récipients expérimentaux. Étant donné qu&#39;il peut y avoir une grande variabilité de jour en jour, il est extrêmement important de comparer des échantillons testés directement en parallèle, et de répéter des expériences sur plusieurs jours. En général, les résultats sont mesurés pour trois plaques distinctes de 50-100 vers / condition expérimentale et ce sont lesn moyenne et considérée comme une seule répétition expérimentale. Généralement, entre sept et neuf répliques semblent être suffisantes pour atteindre ou exclure la signification statistique. Le stade de développement des vers utilisés dans l&#39;expérience doit également être soigneusement surveillée comme la sensibilité des différentes étapes de l&#39;AS dommages varie considérablement 15,16. L&#39;utilisation des jeunes adultes est la norme, et le stade larvaire (L3 et L4) vers semblent être plus résistants aux effets néfastes de l&#39;AS (données non publiées). Ce protocole présente deux façons d&#39;effectuer les expériences, l&#39;une utilisant un appareil de laboratoire réalisés (en utilisant des récipients de type Tupperware et entrée de gaz 11) et l&#39;autre en utilisant une chambre hypoxique commerciale 4,6. Anoxie peut être obtenue par d&#39;autres moyens qui consomment de l&#39;oxygène, comme décrit par ailleurs 13,17. L&#39;utilisation de techniques alternatives pour créer un environnement hypoxique peut changer le temps d&#39;incubation nécessaire ASpour créer la quantité désirée de la mort. Ciblage ~ 20% de survie est un point de départ idéal pour étudier les interventions de protection, tandis que 80% est tout aussi idéal pour les interventions qui aggravent les effets néfastes de l&#39;AS. Une autre mise en garde importante est l&#39;heure à laquelle les scores d&#39;observation morts / vivants vers. Si le temps de l&#39;analyse est prolongée au-delà de 24 heures, les données peuvent être trompeuses car les vers morts deviennent de plus en plus difficiles à identifier. Cela peut être dû à des carcasses de ver devenir relativement transparent au fil du temps, mais aussi au fait que les embryons fécondés peuvent se développer dans la descendance post-mortem à l&#39;intérieur des carcasses et perturber eux comme ils émergent. L&#39;analyse de la morphologie neuronale peut être modifié pour examiner des profils d&#39;expression de protéines de 18, 4 fragmentation nucléaire et d&#39;autres paramètres 19 de par son remplacement par une souche de vis sans fin qui exprime le marqueur génétiquement codé approprié. Une mise en garde finale est que la visualisation de l&#39;processus neuronaux doivent être effectués moins de 30 minutes après le placement des vers sur la diapositive. Les animaux gardés sous anesthésie sur des lames pour des périodes plus longues peuvent présenter des dommages AS-indépendante. Ajustez la quantité d&#39;animaux par diapositive selon le temps nécessaire pour suivre et analyser.

C. elegans est un nématode qui a été largement adopté comme un modèle eucaryote organisme multicellulaire depuis son introduction par Brenner 1. Il s&#39;agit d&#39;un modèle simple, pas cher et polyvalent, qui permet un accès facile entre les altérations génétiques et phénotypique change 2. L&#39;ischémie est caractérisé par un manque de nutriments et de l&#39;apport d&#39;oxygène à un tissu, suivie d&#39;une reperfusion, quand une salve d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène est produit 3 et la plupart des dommages se produisent. En 2002, un modèle d&#39;ischémie / reperfusion (IR) en C. elegans a été développé 4 impliquant soumettre l&#39;ensemble ver à l&#39;anoxie, une carence en nutriments et le stress de la chaleur pendant environ 20 heures puis de 24 heures dans des conditions normales. Bien que ce modèle est techniquement une anoxie-famine (AS) l&#39;état, la mort cellulaire se produit par des mécanismes qui sont conservés chez les mammifères, y compris les dommages induits par les oxydants pendant la reperfusion &lt;sup&gt; 5. En outre, même à des mammifères IR, dommages induits par les AS en C. elegans peuvent être évités par le préconditionnement ischémique 6,7 ou préconditionnement anesthésique 8,9. Les protocoles ci-dessous montrent comment imiter IR en C. elegans en utilisant le modèle AS, comment marquer des anomalies morphologiques et comportementaux qui résultent de l&#39;AS, et comment adapter le protocole d&#39;une manière qui permet l&#39;expérience d&#39;être réalisée avec un investissement initial inférieur en utilisant un, facilement construit alternative chambre sur mesure .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

Protocoles pour anoxie / famine dans le modèle génétique organisme C. elegans simuler une ischémie / reperfusion. Worms sont séparés de l&#39;alimentation bactérienne et placées sous anoxie pendant 20 heures (ischémie simulée), et ensuite déplacés dans une atmosphère normale avec des aliments (par reperfusion simulée). Cette expérimentales résultats de paradigme dans augmentation de la mort et des lésions neuronales et techniques sont présentées pour évaluer la viabilité organisme, altérations de la morphologie des processus contact des neurones, ainsi que la sensibilité tactile, ce qui représente la sortie de comportement de la fonction neuronale. Enfin, une méthode pour construire des pépinières d&#39;hypoxiques en utilisant des conteneurs de stockage de cuisine commune est décrite. L&#39;addition d&#39;une unité de commande de débit massique permet des modifications à apporter au mélange gazeux dans les incubateurs de mesure, et d&#39;un bain à circulation d&#39;eau permet à la fois pour le contrôle de la température et il est facile d&#39;identifier les fuites. Cette méthode offre une alternative à faible coût pour commercialementunités disponibles.

Soumettre C. elegans à 20 h de l&#39;AS à 26 ° C dans une chambre d&#39;incubation de laboratoire faits sur mesure comme décrit (section 3.6.2) a entraîné une mortalité significative (figure 1A) 5. L&#39;imagerie de fluorescence suite de punctum et les pauses dans les GFP étiqueté processus neuronaux de survivants a confirmé la présence d&#39;anomalies morphologiques (Figure 2). Les survivants ont également répondu mal à la lumière paroi du corps contact (figure 1B). Ce modèle a été utilisé par plusieurs groupes pour étudier la façon dont la prédisposition génétique, l&#39;intervention pharmaceutique, et la plasticité métabolique affecte les résultats dépendant 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Figure 1. C. elegans survie et touche réponse aprèsAS. A) Pourcentage de vers qui présentent 24 h post-AS survie. La souche N2 est le fond génétique de type sauvage, et KWN85 contient un transgène intégré qui marque les neurones mec avec la GFP. B) de réponse au toucher stimuli de la vie C. elegans (N2 Strain) après AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Figure 2. Toucher modifications neuronales après AS. Neurone tactile (PLML et PLMR) anomalies telles que les processus et les pauses (A) ou l&#39;accumulation des agrégats de la GFP dans les processus (B) tortueuses ont été suivis en survivant anesthésié C. eleg<html> ans après AS. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Figure 3. Choix des cils. Un choix de cil assemblé. Dans le médaillon, un détail du cil collé au bois de cure-dents. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Figure 4. Lab-made chambre hypoxique à l&#39;intérieur du bain d&#39;eau. Récipient fermé prêt à commencer l&#39;expérience. Les flèches indiquent l&#39;entrée et la sortie de gaz et le poids de la bouteille utilisée pour l&#39;empêcher de flotter. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5. Les détails de la face interne et externe du couvercle de récipient. A) côté extérieur du couvercle du récipient, ce qui indique le tube et son connecteur attaché au trou préalablement réalisé. B) du côté externe du couvercle de récipient, indiquant le connecteur de tube fixé dans le trou préalablement réalisé.

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An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Un protocole est décrit qui utilise anoxie / famine dans C. elegans pour modéliser l&#39;ischémie / reperfusion. Les résultats fonctionnels incluent une mortalité accrue, des anomalies visibles dans les processus neuronaux GFP-étiquetée, et les réponses comportementales douteux qui nécessitent la fonction neuronale.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

9.8K vues.  Universidade de São Paulo.  Un protocole est décrit qui utilise anoxie / famine dans C. elegans pour modéliser l'ischémie / reperfusion. Les résultats fonctionnels incluent une mortalité accrue, des anomalies visibles dans les processus neuronaux GFP-étiquetée, et les réponses comportementales douteux qui nécessitent la fonction neuronale. 

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagerie C. elegans Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Recherche

Biologie

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Méthodes pour Blessant Peau et Essais pour les réponses de blessure dans<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Méthodes d&#39;évaluation de Subcellular compartiments de muscle en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l&#39;utilisation des Métazoaires organisme modèle<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Suivi et quantification des processus de développement des<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilisation des outils open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Mesures des réponses physiologiques au stress à C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...