L&#39;imagerie microscopique a été réalisée par les services du Centre de l&#39;Université d&#39;État du Michigan pour la microscopie avancée. Maïs cal a été acheté à partir du Centre de transformation de maïs de l&#39;Iowa State University. Les auteurs tiennent à remercier Jeffrey R. Weatherhead du Laboratoire MSU recherche sur les plantes pour son aide technique sur l&#39;analyse des glucides. Cette recherche a été généreusement financé par le Programme commercialisation du maïs du Michigan (CMPM) et le Consortium pour la recherche en biotechnologie des plantes (CPBR).

1. Préparation de dsRNAi constructions utilisées pour la régulation à la baisse de ZmCCR1 <ol><li> amorces spécifiques du gène de conception, y compris nécessaires sites d&#39;enzymes de restriction pour faire un dsRNAi construire de knock-out du gène ZmCCR1. Deux jeux d&#39;amorces ont été conçues pour amplifier deux segments de fragments de ZmCCR1 ADNc:. Un fragment de 523 pb du nucléotide 748 à 1271, et un pb fragment 285 de nucléotides 986-1271 Le ZmCCR1 ADNc a été fourni par l&#39;Institut de génomique de l&#39;Arizona (AGI). Plus de détails sont décrits dans la figure 1. </li><li> Amplifier le grand fragment par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) à partir du modèle ZmCCR1 ADNc en utilisant des amorces (5&#39;-ZmCCR1_748F_BglII AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &#39;) et ZmCCR1_1271R_NcoI (5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&#39;). Amplifier le plus petit fragment (285 pb) en utilisant les amorces (5&#39;-ZmCCR1_986F_BglII AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &#39;) et une ZmCCR1_1271R_SacI (5R17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 &#39;). </li><li> Ligaturer individuellement les fragments dans pGEM-T Easy en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Effectuer des mini-prep isolement d&#39;ADN plasmidique à partir des transformants individuels, chacun contenant le vecteur pGEM-T construit en utilisant un mini-prep de plasmide kit commercial. </li><li> Digérer la fois le pGEM-T :: ZmCCR1 (523 pb) et ImpactVector (IV) -1,1 (vecteur d&#39;expression de cytoplasme) avec à la fois Ncol et BglII. </li><li> Ligaturer le grand gel purifié ZmCCR1 fragment digéré (523 pb) dans le gel digéré IV-1.1 purifié. </li><li> Digérer le vecteur pGEM-T :: ZmCCR1 (285 pb) et IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 pb) à la fois avec BglII et Sacl afin d&#39;insérer le petit fragment dans le IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 pb). </li><li> Ligaturer le petit gel digéré fragment ZmCCR1 purifié (285 pb) dans le gel digéré IV-1.1 purifié :: ZmCCR1 (523 pb). </li><li> Cloner fois 523 pb et 285 pb fragmentationts en IV-1.1 pour rendre le ZmCCR1 ARNi construire, qui a une séquence de répétition inversée de 285 pb avec un 238 pb entretoise au milieu des fragments répétées inversées (voir la figure 1). </li><li> Transférer cette construction dans Escherichia coli (E. coli), les cultiver et d&#39;effectuer une taille plasmide isolement de l&#39;ADN de midi-prep à obtenir suffisamment d&#39;ADN plasmidique pour le maïs transformation génétique. </li></ol> 2. Maïs transformation génétique <ol><li> Préparation de particules de tungstène <ol><li> Placer 60 mg de billes de tungstène (M10) dans un tube de 1,5 ml et on lave avec 1 ml d&#39;éthanol à 70% au vortex pendant 2 min. Incuber pendant 10 min à 23 ° C puis centrifuger à 18 894 g pendant 2 min et jeter le surnageant. </li><li> Laver 3 fois avec 1 ml d&#39;éthanol à 100%, la centrifugation pendant 2 min et en éliminant le surnageant. Ajouter 1 ml de glycerol stérile à 50% pour amener la concentration de microparticules à 60 mg / ml. </li></ol></li><li> Préparation de l&#39;ADN pour le bombardement <ol><li> Place les 50 pi (3 mg) de billes de tungstène préparées dans du glycerol à 50% dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 5 ul (1 ug) de IV-1.1 :: ZmCCR1 ARNi ADN plasmidique, 50 ul de 2,5 M CaCl 2, et 20 ul de 0,1 M de spermidine. Vortex brièvement entre chaque addition de réactifs ci-dessus. </li><li> Vortex le tungstène bourrelet ADN mélange brièvement et centrifuger à 18 894 x g pendant 30 s. Décanter le surnageant et remettre en suspension les culots dans 140 ul d&#39;éthanol à 70%. Retirer le liquide et le jeter. Ajouter 140 ul d&#39;éthanol à 100%. Retirer le liquide et le jeter. </li><li> Ajouter 48 ul d&#39;éthanol à 100%. Utiliser immédiatement ou stocker sur la glace jusqu&#39;à 4 heures avant le bombardement. </li></ol></li><li> Bombardement <ol><li> Placez un 3-5 cm de diamètre Salut-II maïs embryonnaire cals (fourni du centre de transformation de maïs de l&#39;Iowa State University) au milieu de 100 mm boîtes de Petri contenant un milieu de N6OSM 32 (comme osmotium) au moins 4 heures avant le bombardement. </li><li> Prepare dispositif de particules de livraison PSD-1000/He selon les instructions du fabricant 33. </li><li> Stériliser paroi de la chambre avec 70% d&#39;éthanol. Chargez stérile 650 psi disque de rupture dans le capuchon de retenue stérile. Étaler 5-6 pi de la solution M10-ADN sur la surface d&#39;un macrosupport, brièvement sec. macrosupport de charge et l&#39;arrêt de l&#39;écran en microporteur ensemble de lancement. </li><li> Placez microporteur ensemble de lancement et le maïs cals dans la chambre à une distance choisie de l&#39;écran d&#39;arrêt (L2 = 6 cm) et fermer la porte. Accélérer dans le vide de 27 psi contre un tamis à mailles de fil. </li><li> Appuyez sur le bouton de tir jusqu&#39;à rafales disque de rupture et la pression de l&#39;hélium jauge tombe à zéro. Relâchez le bouton de tir. </li><li> Incuber les cals bombardés dans une boîte de Pétri contenant N6OSM (milieu osmotique) 32 pendant 16 heures dans l&#39;obscurité à 27 ° C. Cassez les cals en une dizaine de morceaux et de les transférer à N6E (milieu d&#39;induction de cal) 32 dans des boîtes de Pétri et incuber pendant 5 jours in l&#39;obscurité à 27 ° C. </li></ol></li><li> Sélection <ol><li> Après 5 jours sur N6E, transférer les cals sur un milieu N6S (médias de sélection) 32. Subculture tous cals sur un milieu de sélection tous les 30 jours pour les 8-12 semaines sans perturber la structure de cals. </li><li> Après environ 8-10 semaines, blancs secteurs à croissance rapide se développeront à partir de la non-prolifération et partiellement nécrotique mère cals. Exciser les tissus à croissance rapide blancs et repiquer leur milieu de sélection frais (N6S) 32 et continuer à incuber comme ci-dessus. </li></ol></li><li> Régénération <ol><li> Transférer les cals embryonnaires blanc et en croissance rapide sur milieu de régénération 32 et incuber comme ci-dessus pendant 1 semaine. Mettez la régénération de cals embryogènes à une période de 16 heures jour et 8 h obscurité à 25-27 ° C </li><li> Transférer la régénération tire sur le milieu d&#39;enracinement 32 dans un tube à essai en verre au bout de 3-4 semaines, de continuer à incuber comme précédemment. Après r substantielledéveloppement oot apparaît, laver les racines soigneusement sous l&#39;eau du robinet, puis transplanter les plantules à 4 &quot;pots de terreau. Couvrez les pots avec des sacs de plastique pour garder humide. Après 2 jours font de petits trous les sacs en plastique. Après 5-6 jours enlever les sachets en plastique. Continuer à incuber comme ci-dessus pendant 5-6 jours. </li></ol></li><li> Effet de serre <ol><li> Transférer les plants dans des pots de 18 &quot;avec le sol et de maintenir dans la lumière du soleil de plein été ou la lumière à effet de serre. Les plantes régénérées initiales sont appelés T 0 alors que les premières graines appartiennent à la génération T 1. </li></ol></li></ol> 3. Essai histologique <ol><li><ol><li> Fixer les feuilles de maïs nervures médianes dans 5 ml de 10% du formol tamponné neutre. </li><li> Processus et vide infiltrent avec de la paraffine sur un processeur de tissu à l&#39;aide d&#39;un processeur de tissus. </li><li> Incluez les tissus en paraffine à l&#39;aide d&#39;une station d&#39;enrobage Histocentre III. </li><li> Retirer l&#39;excès de paraffine sur les bords une fois blocks sont refroidis. </li><li> Section échantillon à 4-5 pm avec un microtome à l&#39;aide d&#39;un microtome. </li><li> Placez sections sur des lames de microscope et sec dans un incubateur à 56 ° C pendant 2-24 h. Assurez-vous que les articles sont entièrement respectées à la diapositive. </li><li> Déparaffiner sections dans deux bains de xylène pendant 5 min à 23 ° C. </li><li> Hydrate glisse dans deux changements d&#39;éthanol à 100% pendant 2 min et deux changements de l&#39;éthanol à 95% pendant 2 min à 23 ° C. </li><li> Rincer les sections dans l&#39;eau du robinet pendant 2 min. </li><li> Colorer avec 0,05% de bleu de toluidine O pendant 1-2 min et rincer brièvement avec le trou DDH 2 O. </li><li> Placez une lamelle sur les échantillons avec de l&#39;huile d&#39;immersion et de visualisation en microscopie optique. </li></ol></li><li> Microscopie électronique à balayage (MEB) <ol><li> Fixer les feuilles de maïs milieu des nervures à section transversale à 4% de glutaraldéhyde et 0,1 M de tampon phosphate de sodium (pH 7,4) à 4 ° C pendant 1-2 heures. </li><li> Rincer rapidement les échantillons dans la mémoire tampon, les déshydratées dans unsérie d&#39;éthanol (25%, 50%, 75% et 95%) pour 10 à 15 min à chaque gradation et 100% d&#39;éthanol pendant 10 minutes, 3 fois. </li><li> Sécher les feuilles de maïs milieu des nervures transversales à section déshydratées dans un séchoir à point critique en utilisant du dioxyde de carbone liquide en tant que fluide de transition. </li><li> Montez les échantillons séchés sur les talons de l&#39;aluminium à l&#39;aide des onglets de carbone de haute vide </li><li> Enduire les feuilles de maïs milieu des nervures montées sur les moignons d&#39;aluminium avec de l&#39;or (environ 20 nm d&#39;épaisseur) dans un dispositif de revêtement par pulvérisation cathodique purgé avec de l&#39;argon gazeux. </li><li> Examiner les échantillons revêtus à un JEOL JSM-6400V (émetteur d&#39;électrons de l&#39;hexaborure de lanthane) au microscope électronique à balayage. </li><li> Les images numériques ont été photographiés à l&#39;aide d&#39;un logiciel Pro analyse (de la version 3.2). </li></ol></li></ol> 4. Klason lignine mesure <ol><li> Mill les échantillons à travers un tamis de 2 mm. </li><li> Utiliser un analyseur d&#39;humidité pour déterminer la teneur en humidité de chaque échantillon et noter la valeur. </li><li> Peser environ 1,5 g de chaque échantillon et enregistrer la masse. Extract les échantillons en utilisant de l&#39;eau pour la première extraction, suivi par de l&#39;éthanol pour la seconde extraction à l&#39;aide soit d&#39;un solvant d&#39;extraction automatique (3 cycles par extraction, ~ 14 min par cycle) ou un appareil Soxhlet (8 h par extraction). (Remarque: Cette étape élimine extraits qui peuvent se condenser pendant l&#39;hydrolyse acide et interférer avec la mesure de la lignine précis, l&#39;augmentation de la teneur apparente en lignine Klason.) </li><li> Sécher les échantillons extraits à 45 ° C pendant une nuit, puis les laisser refroidir dans le dessiccateur et peser à nouveau. </li><li> Définir un incubateur à 30 ° C. Mesurer 0,3 g de chaque échantillon sec extrait dans des tubes à haute pression vis-top (triple par échantillon est recommandé) et enregistrer le poids à 0,1 mg près. Ajouter 3 ml de 72% de H 2 SO 4 dans chaque tube de pression. </li><li> Mélanger l&#39;échantillon en utilisant une tige de verre ou téflon d&#39;agitation. Laisser la tige d&#39;agitation dans le tube jusqu&#39;à ce que l&#39;eau est ajoutée après l&#39;incubation. </li><li> Placer les flacons dans un incubateur soit à 30 ° C et 150 rpm pendant 60 min. Après 1 heure, ajouter 84 ml d&#39;eau désionisée pour diluer la concentration de l&#39;acide à 4% et mélanger avec la tige d&#39;agitation. Veillez à ne pas laisser de grandes quantités d&#39;échantillon sur les côtés du flacon-dessus de la ligne d&#39;eau. </li><li> Bien sceller les bouchons sur les flacons et les placer dans un rack de métal ou de grands gobelets. Autoclave à 121 ° C en utilisant un cycle de stérilisation liquide pendant 1 heure. Laisser refroidir à température ambiante avant de l&#39;ouvrir. </li><li> Pré-cendre les creusets de filtrage dans un four à 575 ° C pendant au moins 4 heures. Permettre aux creusets refroidir dans un dessiccateur pendant au moins une heure. </li><li> Filtrer la solution sous vide à partir de chaque tube à travers un creuset séparé, au moyen d&#39;un adaptateur en caoutchouc pour fixer le creuset. Utiliser de l&#39;eau déminéralisée pour rincer les particules restantes du tube. </li><li> Sécher le résidu de lignine à 105 ° C pendant un minimum de 4 heures. Noter le poids du creuset sec et les résidus. </li><li> Si vous utilisez un 575 ° C, pré-Le-feu des échantillons sur un bec Bunsen jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y a pas de fumée ou de la cendre et les placer dans le four pendant 24 heures, ou si vous utilisez un four programmable, ne pas pré-ash et utiliser le programme suivant: </li><li> Rampe de la température ambiante à 105 ° C et maintenir pendant 12 min. </li><li> Rampe à 250 ° C à 10 ° C / min et maintenez pendant 30 min. </li><li> Rampe à 575 ° C à 20 ° C / min et pendant au moins 180 minutes. </li><li> Retirez les creusets du four et laisser refroidir dans un dessiccateur. Peser le creuset et de cendre. </li><li> Calculer le résidu insoluble dans l&#39;acide à l&#39;aide de l&#39;équation suivante: </li></ol><img alt="Equation 1" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" /> M PRE = masse de la biomasse des pré-extrait M POST = masse de la biomasse post-extrait M = masse du VIAL biomasse extraite ajouté à la fiole M RÉSIDUS = masse du résidu creuset et de la lignineue M ASH = masse du creuset et de cendre MC = teneur en eau de la biomasse des pré-extrait, base du poids total 5. Analyse des glucides <ol><li> Effectuer la paroi cellulaire glucidique analyses sur la base du Foster et al. (2010) Protocole 31. En bref, préparer l&#39;alcool résidu insoluble de la matière végétale lyophilisée. Ensuite, hydrolyser le matériau avec de l&#39;acide trifluoroacétique et faire correspondre les dérivés de monosaccharides solubilisées à leurs acétates d&#39;alditols correspondants. Analyser ces dérivés volatils par chromatographie en phase gazeuse (GC) relié à un spectromètre de masse quadruple. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+lignin+biosynthesis+promotes+cellulose+accumulation+and+growth+in+transgenic+trees.">Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees.</a> Nature. 17, 808-812 (1999).</li><li>Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+cinnamyl+alcohol+dehydrogenase+deficiency+in+poplar+lignins.">Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins.</a> Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).</li><li>Updegraff, D. 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F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;accessibilité des cellulases microbiennes pour planter des polysaccharides de la paroi cellulaire est largement dépendante de la mesure dans laquelle ils sont associés à des polymères phénoliques 23. Le taux de biomasse lignocellulosique de conversion fermentescibles sucre est corrélée négativement avec le contenu de la lignine déposé dans secondadry parois cellulaires végétales. Cette corrélation est attribuée aux propriétés physiques de la lignine tels que l&#39;hydrophobie 24,</...

La production de biocarburants à partir de biomasse lignocellulosique est hautement souhaitable en raison de son abondance actuelle aux États-Unis 1, et dans le cas de la récolte durable des résidus agricoles et forestiers, la capacité de ne pas concurrencer directement les terres cultivées utilisées pour l&#39;alimentation animale et la production d&#39;aliments. Cependant, contrairement à grains de maïs, qui est la principale source de biocarburant a généré aux Etats-Unis, les matériaux lignocellulosiques sont beaucoup plus complexes et difficiles à briser. En plus de la hydrates de carbone à longue chaîne, de la cellulose et de l&#39;hémicellulose, qui sont les principales sources de sucres pendant la fermentation de matières ligno-cellulosiques, de nombreux types de parois de cellules végétales contiennent également de la lignine, un polymère phénylpropanoïdes qui fournit la force, à la défense contre une attaque pathogène, et l&#39;hydrophobicité de parois cellulaires. Alors que nécessaire pour la croissance des plantes et de la survie, de la lignine présente également un obstacle important à la conversion enzymatique de la cellulose avec succès et hemicelluperdre de sucres solubles. Matériaux à haute teneur en lignine sont généralement des matériaux moins souhaitables à la fois pour le biocarburant (par des voies de conversion biologique) et les industries de pâtes et papiers en raison des impacts négatifs sur les caractéristiques de traitement et la qualité des produits. Par conséquent, la manipulation génétique du matériel végétal pour la réduction de la lignine à un niveau qui n&#39;interfère pas avec la culture et la résistance structurelle des systèmes de défense pourrait être important pour la réduction des coûts de production à la fois pour le biocarburant lignocellulosique et les industries de pâtes et papiers. Dans le maïs (Zea mays), de la lignine est réticulé de manière covalente à l&#39;hémicellulose dans la paroi de la cellule primaire par l&#39;intermédiaire de ponts férulate et diferulate 2. Le complexe lignine-hémicellulose se lie à des microfibrilles de cellulose à travers des liaisons hydrogène, la formation d&#39;une matrice complexe qui confère une intégrité et une résistance à la paroi cellulaire secondaire. La résistance mécanique des parois cellulaires de la plante est largement déterminée par le type de lignin sous-unités 3-5. Dans des études antérieures, en modifiant les proportions de sous-unités de la lignine n&#39;a montré aucune tendance claire sur la digestibilité enzymatique 6-11. Cependant, les réductions de la teneur en lignine présentent généralement une amélioration de la conversion et 12,13 peuvent être une clé pour augmenter la digestibilité de la matière végétale par des enzymes hydrolytiques incluant endocellulases, cellobiohydrolases, β-glucosidases et 14. Le génie génétique pour réguler le niveau de transcrits d&#39;expression a été largement pratiquée à améliorer les caractères des cultures. Des techniques de pointe, y compris les anti-sens 15 et co-suppression de 16 technologies, permettent une régulation efficace de gènes cibles. Gène complet knock-out ont également été réalisés en utilisant des constructions de gènes codant pour des ARN d&#39;intron-épissé avec une structure en épingle à cheveux 17. Par ailleurs, un double brin d&#39;ARN interférence (dsRNAi) de la technique, c&#39;est à dire un support d&#39;expression de gène efficace et puissantteur qui fonctionne soit en ciblant la dégradation de transcription ou de traduction répression, fournit un moyen puissant pour induire un large éventail d&#39;effets de suppression sur l&#39;ARNm cible 18. Techniques Gene silencing montrent plusieurs limites. Ces techniques ne règlent pas avec précision le niveau de la transcription et il pourrait provoquer des effets inattendus sur d&#39;autres silencieux des gènes homologues. Dans cette méthode, nous avons utilisé le bombardement de particules pour effectuer la dsRNAi construit dans le génome du maïs. À ce jour, une vaste gamme d&#39;espèces de plantes ont été transformés avec succès en utilisant un bombardement de particules, Agrobacterium transformation médiation, l&#39;électroporation, et les méthodes de micro-injection. Dans la transformation génétique du maïs, le procédé de bombardement de particules est avantageuse par rapport à toutes les autres méthodes car il est le plus efficace. le bombardement de particules ne dépend pas de bactéries, de sorte que le procédé est exempt de contraintes biologiques tels que la taille des espèces de gènes, le gène ouIgin, ou le génotype de la plante. Le système de délivrance d&#39;un transgène physique permet à l&#39;ADN de haut poids moléculaire et de multiples gènes à introduire dans le génome des plantes et dans certains cas dans les chloroplastes à haute efficacité de la transformation 19. La réduction de la lignine dans le système vasculaire de la nervure centrale des feuilles peut être visualisé par microscopie électronique à balayage (SEM) qui est bénéfique pour l&#39;examen de la topographie et la composition des échantillons. Dans les plants de maïs, de la réductase de deux cinnamoyl-CoA (ZmCCR1: X98083 et ZmCCR2: Y15069) gènes ont été trouvés dans le génome du maïs 20. Cinnamoyle-CoA reductase catalyse la conversion de l&#39;ester hydroxycinnamoyl-CoA en aldéhydes cinnamyliques. Nous avons choisi le gène ZmCCR1 à réguler à la baisse cette enzyme parce que le gène est exprimé dans tous les tissus lignifying. Les 523 nucleotides à l&#39;extrémité 3 &#39;du gène ZmCCR1 ont été choisis pour la construction d&#39;un dsRNAi parce que les séquences ont semblé êtreplus diversifiée par rapport à ceux de ZmCCR2. Ainsi, la construction dsRNAi lierait précisément qu&#39;à ZmCCR1, évitant hors cible au silence 21. Produit d&#39;assemblage ZmCCR1_RNAi a été conçu dans le système d&#39;expression cytoplasmique ImpactVector1.1-tag (IV 1.1) contenant le vert promoteur spécifique de tissu, le ribulose-1, 5 carboxylase oxygénase-bisphosphate (RuBisCO). Pour étudier les effets de la dsRNAi construire sur des plantes transgéniques, la teneur en lignine a été quantifiée. Le Klason (insolubles dans l&#39;acide) mesure de la lignine est connu pour être plus précis par rapport à des méthodes de quantification de la lignine détergent acide qui solubilisent une partie de la lignine 22. Par conséquent, la lignine Klason a été mesurée dans les tiges de maïs transgéniques. Ce procédé consiste en une hydrolyse acide en deux étapes qui permet de convertir des glucides polymères solubles dans 23 monosaccharides. La biomasse hydrolysée a ensuite été fractionné en materi solubles et insolubles acidesal et la lignine insoluble de l&#39;acide a été mesurée d&#39;après des études antérieures 23,24. Idéalement, l&#39;analyse de la lignine doit comprendre extractions avec de l&#39;eau et de l&#39;éthanol avant l&#39;étape d&#39;hydrolyse, afin d&#39;éliminer les matières solubles qui peuvent interférer avec les résultats, et une combustion post-hydrolyse du résidu de lignine pour tenir compte de toutes les cendres présentes dans le résidu. Sans ces mesures, la teneur en lignine de l&#39;échantillon pourrait être gonflé artificiellement. La méthode complète est présentée ici, mais pour nos expériences, nous n&#39;avons pas pu effectuer ces deux étapes en raison du faible volume de matériel disponible pour les tests Deux autres composants de la paroi cellulaire, la cellulose et l&#39;hémicellulose ont également été analysés dans la lignine de lignes régulée à la baisse de maïs transgénique. Il a été rapporté que les plantes transgéniques qui ont été régulés à la baisse dans les deux leur phénylalanine ammoniac-lyase (PAL) 25, 4 coumarate: CoA ligase (4CL) 26, ou un cinnamyliquelcohol déshydrogénase (CAD) 27 montrent une augmentation des autres éléments structurels de la paroi cellulaire. Comme première étape dans nos études, la cellulose cristalline a été mesuré en utilisant la méthode Updegraff 28. Cette méthode a été initialement conçu pour la détermination de la cellulose dans un grand nombre de bactéries et de champignons cellulolytiques. En bref, les stocks de maïs broyées ont été traités avec Updegraff réactif (acide acétique: acide nitrique: l&#39;eau) pour enlever l&#39;hémicellulose, la lignine, et xylosans. La cellulose cristalline a été complètement hydrolysé en glucose via Saeman hydrolyse par addition de H 2 SO 4. La cellulose cristalline a ensuite été testée en utilisant la méthode colorimétrique à l&#39;anthrone 29. Pour vérifier si le contenu d&#39;hémicellulose ont été modifiées, les extraits de monosaccharides à partir de tiges broyées ont été hydrolysés à l&#39;aide de l&#39;acide trifluoroacétique, transformés en dérivés en utilisant la méthode de l&#39;acétate d&#39;alditol et ensuite analysés par chromatographie en phase gazeuse (GC) 30. Les procédures détaillées pour cel cristallineLes analyses de composition et de matrice contenu lulose polysaccharides sont décrits dans Foster et al. (2010) 31. Ici, nous décrivons les méthodes utilisées pour la lignine régulation à la baisse dans le maïs par une technologie ARNi, particule transformation de bombardement, et l&#39;analyse de la lignine pour la déconstruction accélérée de maïs biomasse lignocellulosique en sucres fermentescibles pour les biocarburants.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

Pour faciliter l&#39;utilisation de la biomasse ligno-cellulosique en tant que ressource de bioénergie alternatif, pendant les processus de conversion biologique, une étape de prétraitement est nécessaire pour ouvrir la structure de la paroi cellulaire de la plante, en augmentant l&#39;accessibilité des hydrates de carbone de la paroi cellulaire. La lignine, une matière polyphénolique présente dans de nombreux types de parois cellulaires, est connu pour être un obstacle important à l&#39;accès de l&#39;enzyme. Réduction de la teneur en lignine à un niveau qui n&#39;interfère pas avec le système de l&#39;intégrité structurelle et la défense de la plante peut être une étape importante pour réduire les coûts de la production de bioéthanol. Dans cette étude, nous avons génétiquement régulé à la baisse l&#39;un des gènes liés à la biosynthèse de la lignine-,-cinnamoyl CoA réductase (ZmCCR1) par l&#39;intermédiaire d&#39;une technique d&#39;interférence de l&#39;ARN double brin. Le produit d&#39;assemblage ZmCCR1_RNAi a été intégré dans le génome de maïs en utilisant le procédé de bombardement de particules. Plants de maïs transgéniques ont augmenté normalement par rapport à des plantes témoins de type sauvage sans enterfering à la croissance de la biomasse ou des mécanismes de défense, à l&#39;exception de l&#39;affichage de brun-coloration dans les plantes feuilles milieu des côtes transgéniques, les balles et les tiges. Les analyses microscopiques, en conjonction avec le test histologique, ont révélé que les fibres de sclérenchyme de feuilles ont été éclaircis mais la structure et la taille des autres principaux composants du système vasculaire n&#39;a pas été modifiée. La teneur en lignine dans le maïs transgénique a été réduite de 7 à 8,7%, la teneur en cellulose cristalline a été augmenté en réponse à la réduction de la lignine, des hémicelluloses et est restée inchangée. Les analyses peuvent indiquer que le flux de carbone aurait été déplacé de la biosynthèse de la lignine de la cellulose biosynthèse. Cet article définit les procédures utilisées pour réguler à la baisse la teneur en lignine dans le maïs via la technologie ARNi, et la composition de la paroi cellulaire des analyses permet de vérifier l&#39;effet des modifications sur la structure de la paroi cellulaire.

Nous avons mis en évidence une réduction de la teneur en lignine dans des plants de maïs par l&#39;ARNi. Procédé de transformation d&#39;un bombardement de particules a donné environ 30% d&#39;efficacité de trnasformation. Le silence des gènes de ZmCCR1 a été systématiquement observée dans les générations T0-T2. Les transgéniques de lignine réduit ont augmenté de manière similaire à des plants de maïs de type sauvage, sauf pour l&#39;affichage de coloration brune dans la feuille mi-côte, ba...

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Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Un double interférence ARN brin (dsRNAi) technique est employée pour réguler à la baisse la coenzyme maïs cinnamoyl A réductase (ZmCCR1) gène à faible teneur en lignine des plantes. La lignine régulation à la baisse à partir de la paroi cellulaire est visualisée par des analyses microscopiques et quantifiée par la méthode Klason. Changements dans la composition de l&#39;hémicellulose et la cellulose cristalline sont analysés.

Lignine régulation à la baisse de<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi et Klason lignine analyse

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

13.3K vues.  University of Arizona.  Un double interférence ARN brin (dsRNAi) technique est employée pour réguler à la baisse la coenzyme maïs cinnamoyl A réductase (ZmCCR1) gène à faible teneur en lignine des plantes. La lignine régulation à la baisse à partir de la paroi cellulaire est visualisée par des analyses microscopiques et quantifiée par la méthode Klason. Changements dans la composition de l'hémicellulose et la cellulose cristalline sont analysés. 

Vidéo: Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

L&#39;échographie de contraste ciblées traitement des gliomes chez la souris via la livraison de drogue nanoparticules-Bearing et l&#39;ablation microvasculaire

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Recherche

Bio-ingénierie

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantification de Global diastolique fonction de l&#39;analyse basée sur la modélisation cinématique de transmitral débit via le formalisme de remplissage diastolique paramétrée

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

Étude Soft-matière et les systèmes biologiques sur une échelle de longueur large de nanomètre et micromètre Tailles au Petit-angle Neutron Diffractomètre KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

Assemblage rapide, évolutive et dans divers Nanocarriers synthétique Via Flash nanoprécipitation apport de protéines bioactives et Immunostimulants

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositifs électriques et magnétiques de champ pour la stimulation des tissus biologiques

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&amp;#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation d’agents pathogènes par photolyse en lumière visible de la riboflavine-5′-phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

Ingénierie d’agents antiviraux par résonance plasmonique de surface

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...