Il s’agit d’un protocole pour l’isolement des cellules souches musculaires primaires de la souris pour l’étude du métabolisme ex vivo. Ce protocole fournit une population beaucoup plus importante de cellules souches par rapport à d’autres protocoles que nous avons essayé dans le passé. Et surtout, une fois que nous différencions ces cellules souches en myotubes, elles présentent une physiologie normale, donc des choses comme les rythmes circadiens.
Lors de l’essai de cette procédure pour la première fois, prendre des notes détaillées et enregistrer plusieurs images parce que chaque explant tissu semble différent et il y aura des variations dans l’excroissance des myoblastes. Sans démonstration visuelle, il est difficile de savoir si vous isolez les cellules correctes. Nous avons bénéficié de l’aide généreuse d’autres personnes qui nous ont montré cette méthode lorsque nous l’avons établie dans notre laboratoire.
Après avoir préparé le plat pour la dissection selon le manuscrit, préparer une chambre humide en plaçant deux à trois feuilles de papier absorbant épais dans un sac en plastique et utiliser une pipette pour mouiller la surface du papier avec de l’eau stérile. Placez la chambre sous la lumière UV pendant cinq minutes pour stériliser. Disséquer le muscle désiré d’une souris de quatre à huit semaines et rincer doucement dans PBS contenant 40 microgrammes par gentamycine millilitre pour stériliser.
Utilisez des forceps stériles pour transférer le muscle dans une boîte de Pétri stérile de 10 centimètres non enduite. Ajouter 0,5 à un millilitre de supports de placage sur le muscle de sorte que le tissu est humide, mais pas flottant. Utilisez un scalpel stérile ou une lame de rasoir pour couper doucement le muscle en petits fragments.
Utilisez des forceps ou une pipette pour transférer les fragments musculaires sur la surface d’une plaque pré-enduite de six centimètres. Superposez très doucement 0,8 millilitres supplémentaires de supports de placage sur le tissu. Placez le plat de six centimètres contenant les fragments musculaires à l’intérieur de la chambre humide et retournez-le dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.
Préparer et préchawarer les médias myoblastes, la trypsine et la génotamycine PBS dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Pour enrober un flacon T25 pour chaque groupe musculaire, ajouter deux millilitres de solution de revêtement à la surface du flacon, secouer doucement pour créer une couche même à la surface, et incuber le flacon à quatre degrés Celsius pendant une heure. Maintenant, avec une pipette, enlever les supports de placage des explantations musculaires et rincer doucement les explantations musculaires avec deux millilitres de PBS-gentamycine.
Retirez rapidement le PBS et ne laissez pas la plaque reposer dans le PBS. Ajouter ensuite délicatement un millilitre de PBS-gentamycine et placer la plaque dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant une minute. Utilisez une pipette P1000 pour recueillir le PBS avec des cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Ensuite, ajoutez un millilitre de trypsine à la plaque et retournez-le à l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Appuyez doucement sur les assiettes pour déloger les myoblastes. Recueillir la trypsine avec des cellules et combiner avec la collection PBS.
Ajouter huit millilitres de myoblaste dans le tube de centrifugeuse et inverser délicatement pour mélanger. Superposez doucement deux millilitres de solution de placage sur les plaques musculaires et retournez les plaques à l’incubateur de 37 degrés Celsius. Faire tourner les tubes de centrifugeuse contenant des cellules dans une centrifugeuse pendant trois minutes à 200 fois g.
Aspirer le surnatant et garder environ un millilitre dans le tube. Ajouter délicatement le média myoblaste, transférer les cellules dans le flacon pré-enduit et placer le flacon dans l’incubateur de 37 degrés Celsius. Aspirez les médias des flacons P0 myoblastE T25.
Rincez brièvement les cellules à l’aide de deux millilitres de génotamycine PBS chaude puis aspirez le PBS du flacon. Pipette deux millilitres de PBS chaud dans chaque flacon contenant des myoblastes. Placez les flacons avec PBS dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant trois minutes.
Puis appuyez fermement sur le côté de la fiole pour déloger les cellules. Vérifiez sous un microscope léger les myoblastes flottant librement. Placez les flacons à la verticale dans un capot de culture tissulaire et rincez le fond des flacons avec 10 millilitres de médias myoblastes deux à trois fois pour vous assurer que toutes les cellules sont délogées.
Recueillir le mélange de médias cellulaires dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Centrifugeuse pendant trois minutes à 200 fois g. Aspirez les médias à laisser environ un millilitre dans le tube en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire.
Ajouter délicatement un volume approprié de supports myoblastes au tube de centrifugeuse et mélanger délicatement. Répartir le mélange cellulaire dans de nouveaux flacons T75 de six millilitres chacun. Ajouter 10 millilitres de myoblaste à chaque nouveau flacon T75.
Secouez doucement les flacons horizontalement pour distribuer les cellules et placez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Dans ce protocole, des cellules primaires ont émergé des explants ont été observées sous un microscope léger standard. Les premières récoltes de myoblastes sont apparues sous forme de petites sphères rondes et brillantes.
La différenciation des myoblastes a pris quatre à six jours au cours de laquelle la morphologie des cellules est passé de sphères rondes simples à de longues fibres multinucléées fusionnées allongées. Des myotubes entièrement différenciés ont été donnés qui étaient prêts pour la mesure des taux de consommation d’oxygène. Ces cellules peuvent être utilisées pour un certain nombre d’applications en aval.
Par exemple, nous les utilisons fréquemment pour étudier le flux de substrat dans les instruments seahorse.
