Ce travail a été financé par l&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, le Centre National de la Recherche Scientifique, de l&#39;Université de Strasbourg, l&#39;Hôpital de Strasbourg, l&#39;Association pour la Recherche sur le Cancer, l&#39;Institut National du Cancer, l&#39;Agence Nationale de la Recherche et la Région Alsace. Pietro Laneve a été soutenu par la Fondation pour la Recherche Médicale. Actuellement, il est le bénéficiaire d&#39;une Istituto Italiano Tecnologia (IIT) de fraternité. Les frais de publication sont pris en charge par le réseau Neurex (TriNeuron - Programme Interreg IV Rhin Supérieur)

Collection 1 de l&#39;échantillon <ol><li> Détachez 2 cellules de semi-adhérent, Schneider (1-5 x 10 6 cellules en moyenne), à la pipette et les récolter par centrifugation (100 g pendant 1 min). Dans le cas de cellules adhérentes en culture in vitro, trypsiniser eux dans des conditions standard ou directement à percevoir ces plaques dans une quantité convenable d&#39;ARN réactif d&#39;extraction, par l&#39;aide d&#39;un grattoir à cellules. </li><li> Pour la collecte des embryons, développer des souches de drosophile dans des cages à mouches et laisser embryons s&#39;accumulent sur ​​des plaques de ponte. Essuyez embryons hors d&#39;un pinceau dans de l&#39;eau distillée (dH 2 O), jeter des débris par filtrage tamis, rincer et récupérer des embryons dans un flacon 48. </li><li> Comme une technique alternative, disséquer manuellement tissus / organes. Isoler les testicules (un système préférentiel pour l&#39;analyse piRNA) de la drosophile abdomen dans un tampon phosphate salin (PBS) sous un stéréomicroscope (grossissement 20X), par l&#39;utilisation d&#39;aiguilles de dissection ou de pinces visualized dans Sullivan et al 49. </li><li> Pilon homogénéiser les échantillons sur la dépendance de 0,5 volumes de réactif d&#39;extraction d&#39;ARN. </li></ol> 2 Extraction de l&#39;ARN / Analyse <ol><li> Les instructions du fabricant suivantes effectuent isolement de l&#39;ARN par les réactifs commerciaux. ATTENTION! Agents d&#39;extraction d&#39;ARN sont généralement toxique et caustique. En variante, appliquer un protocole basé sur la protéinase K pour l&#39;isolement de l&#39;ARN 50, comme suit: <ol><li> Diluer les échantillons dans 400 ul de mélange d&#39;arrêt et incuber à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Récupérer les composants hydrosolubles de standard au phénol: chloroforme: alcool isoamylique et l&#39;extraction dans le chloroforme et par l&#39;éthanol (EtOH) précipitation / lavage. Air sécher les échantillons et remettre en suspension dans de diéthyle (DEPC) traités par une double distillation (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Évaluer la concentration d&#39;ARN par mesure spectrophotométrique UV. Assurez-vous également la pureté de l&#39;ARN est élevé, proche de 2,0, based sur A 260 / A 280 lecture. </li><li> Vérifiez la préparation de l&#39;ARN sur gel d&#39;agarose dénaturant comme suit: <ol><li> Dans un bêcher propre, dissoudre 1,2 g d&#39;agarose dans 82 ml de DEPC-DDH 2 O, sous agitation continue. Faire bouillir jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Laisser la solution de gel à refroidir; lorsque la température atteint 60 ° C, ajouter 10 ml d&#39;acide 4-10X morpholinepropanesulfonic (MOPS) tampon à 1X concentration finale (FC), et 8 ml de formaldéhyde à 37% à 3% FC. ATTENTION! formaldéhyde est cancérogène. </li><li> Verser le gel dans une cellule d&#39;électrophorèse horizontale. Laisser le gel se solidifier sous une hotte pendant au moins 1 h. Après solidification, immerger le gel dans MOPS 1X. </li><li> Aliquote 2 pg d&#39;échantillon d&#39;ARN et 1 pg de contacts (utiliser un marqueur d&#39;ARN lorsque l&#39;évaluation précise est souhaitée). Ajouter 3 volumes de colorant de chargement agarose (ALD) à l&#39;ARN et à l&#39;échelle. Chauffer à 70 ° C pendant 5 min, puis refroidir sur glace. CAUTION! Contenu de ALD (de bromure d&#39;éthidium et formamide, voir Matériaux) sont mutagène et corrosif, respectivement. </li><li> Charger les échantillons et exécuter le gel à 50 V pendant environ 1 heure avec recyclage de tampon occasionnelle. Vérifiez le motif ARN de fractionnement par visualisation UV ou l&#39;imagerie de gel. Reconnaître bandes discrètes correspondant à 28S et 18S ARNr et ARNt (voir Figure 1). </li></ol></li><li> Passez à l&#39;Essai du Nord ou de l&#39;ARN de conserver à -80 ° C. </li></ol> 3. dénaturation gel d&#39;acrylamide Préparation <ol><li> Utilisez un petit appareil vertical électrophorétique pour cette étape de fractionnement (de la taille de la plaque d&#39;environ 8 cm x 9 cm, épaisseur de 0,75 mm peigne). </li><li> Assembler verres propres ensemble dans un cadre de coulée. </li><li> Préparer 10 ml de 10% d&#39;acrylamide / bis-acrylamide (19: 1) solution de MOPS 1x, 7 M d&#39;urée. Juste avant la coulée, ajouter 100 ul de 10% de persulfate d&#39;ammonium et 10 ul de TEMED et mélanger rapidement la solution. ATTENTION! L&#39;acrylamide est neurotoxique et cancérogène. </li><li> Verser le gel entre des plaques de verre et insérer le peigne bien soin d&#39;éviter les bulles. Laisser polymériser le gel à température ambiante pendant au moins 45 min avant utilisation. Autrement, stockez le gel O / N, enveloppé dans du papier filtre imbibé d&#39;eau et scellé dans du papier saran. </li></ol> Préparation de l&#39;échantillon 4 <ol><li> Aliquote de 0,5 à 20 ug d&#39;ARN total pour chaque échantillon. Si le volume dépasse 3-4 pi, vide sécher l&#39;échantillon. </li><li> Pour la détermination de la taille, exécutez une aliquote (20-30 cps) de radiomarqué échelle du bas-gamme en parallèle aux échantillons, comme un marqueur (voir rubrique 4.3 et 4.4 pour la préparation). Traiter en parallèle des échantillons, comme décrit dans l&#39;étape 4.5. </li><li> Ladder: mettre en place une réaction directe de phosphate en utilisant 0,1 ug d&#39;une échelle de 10 pb-étape. Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes et stopper la réaction par addition d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 20 mM FC. </li><li> Purifier par précipitation avec EtOH / lavage, l&#39;air sec etremettre en suspension dans le trou DDH 2 O (environ 100 pi). ATTENTION! 32 P est une source radioactive. </li><li> Pour chaque échantillon ajouter un volume égal de colorant bleu acrylamide (ABD). Dénaturer par chauffage à 80 ° C pendant 5 min et laisser refroidir sur glace jusqu&#39;au chargement. ATTENTION! Formamide (contenu dans ABD) est corrosif. </li></ol> 5. électrophorétique fractionnement <ol><li> Retirer les plaques de verre à partir de la pièce moulée de support et les assembler correctement dans la cellule d&#39;électrophorèse. Remplissez les deux chambre intérieure et extérieure avec suffisamment de tampon de migration (RB). </li><li> Retirez délicatement le peigne et pré-exécuter le gel à 200 V pendant 10 min. Avant le chargement des échantillons, laver les dépôts d&#39;urée des puits en injectant une partie RB moyen d&#39;une seringue. </li><li> Utiliser des embouts plats à stratifier attentivement échantillons de l&#39;étape 4.5 au fond de chaque puits. Vérifiez les connexions d&#39;anode et de la cathode à éviter un fonctionnement inversé. Après que les échantillons entrent dans le gel à 100 V pendant 5 min, iUGMENTATION la tension de 200 V. </li><li> Pour une longueur de fractionnement d&#39;environ 7 cm, une 45-min est suffisante à long terme. Évitez bleu de bromophénol (un pigment de suivi dans ABD) à déborder le gel. </li><li> Visualisez sur le gel de longues ARN fractionnées par le bromure d&#39;éthidium (EtBr) de coloration, comme une étape facultative: <ol><li> Coupez 2 cm du haut du gel et les rincer rapidement la tranche dans le trou DDH 2 O. </li><li> Incuber la tranche de gel à température ambiante pendant 15 min avec shacking douce dans RB, du BET 0,5 pg / ml FC. </li><li> Destain le gel pendant 15 minutes à RB, visualiser longues ARNr par irradiation UV ou l&#39;imagerie de gel. Vérifiez pour la charge d&#39;ARN et de la qualité (voir la figure 1, Groupe 7). ATTENTION! Bromure d&#39;éthidium est un agent mutagène. </li></ol></li><li> Pendant ce temps passer buvard la partie inférieure du gel contenant de petites espèces d&#39;ARN. </li></ol> 6. Gel Blot <ol><li> Coupez 6 morceaux de papier buvard pour s&#39;adapter à la zone de blot et une pièce équivalente de uncharged membrane de nylon. Humidifiez les feuilles de papier, membrane et 2 tampons buvards de RB. Assurez-vous de tremper complètement les plaquettes en les serrant à plusieurs reprises dans RB. </li><li> Retirer le gel de l&#39;appareil et ouvrir les verres en moyenne d&#39;une spatule. Utilisez un coupe propre pour enlever les puits. Placez une feuille de papier Whatman humide sur le gel et soulevez-le délicatement. </li><li> Placer la membrane de nylon sur la face libre du gel. Marquer un coin pour orienter le filtre selon le chargement des échantillons. Remplissez le &quot;sandwich&quot; (3 morceaux de papier de chaque côté). Rouler une tige en plastique sur la surface de la tache, pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Placez la tache entre deux sous-main et puis dans la cassette buvard. Monter la cassette dans le module buvard, remplir la chambre avec RB et vérifier l&#39;orientation correcte (membrane de nylon doit rester entre le gel et le terminus positif). </li><li> Transfert à 20 V pendant 20 min. Remarque: pour assurer des conditions homogènes, après 10 min ouvrir le module buvard et rOtate le sandwich de 180 ° avant de terminer le transfert. </li></ol> 7. membrane réticulation <ol><li> Préparer 6 ml de solution de reticulation frais (XLS). Saturer 10 cm x 10 cm (plus grand que membrane de nylon) morceau de papier buvard avec XLS. ATTENTION! HCl (un composant de XLS) est très corrosif. </li><li> Démonter la tache et placer la membrane sur le papier filtre 3MM humide. Remarque: l&#39;ARN doit pas être en contact direct avec le papier saturé. Placer le filtre et le papier entre deux plaques de verre et l&#39;envelopper dans saran-wrap. </li><li> Chauffer la membrane à 60 ° C pendant 2 heures, suivi par un trou DDH 2 O lavage. Stocker à -20 ° C ou de procéder à l&#39;hybridation. </li></ol> 8. membrane Préhybridation <ol><li> Si la charge d&#39;ARN a été vérifiée (étape optionnelle 5.5), passez directement à l&#39;hybridation. Ou bien, Coupez 1 cm de la partie supérieure du filtre en nylon, pour éviter sonde transversale hybridizations à longs ARN fractionnées. </li><li> Préchauffer 10 ml de solution d&#39;hybridation (SH) à 37 ° C. Dénaturer 1 mg de sperme de saumon à 95 ° C pendant 5 min, refroidir sur glace et ajouter à HS. </li><li> Incuber le filtre en HS à 37 ° C pendant au moins 1 h, en rotation dans un four à hybridation. Vérifiez que l&#39;ARN-côté du filtre face HS. </li></ol> 9 Sonde de synthèse <ol><li> Mettre en place une réaction directe de phosphate à 10 pmol d&#39;oligonucléotide antisens spécifique, comme décrit dans 4.3. </li><li> Ajouter 5 volumes de tampon Tris-EDTA-NaCl (TEN) de tampon à la réaction et on purifie le amorce marquée à partir de nucleotides non incorporés par Chromatographie d&#39;exclusion sur gel sur des colonnes de Sephadex G-25 (ou encore par précipitation par EtOH). l&#39;activité de la sonde peut être évaluée par compteur à scintillation liquide. </li></ol> 10 membrane d&#39;hybridation <ol><li> Remplacez le HS épuisé avec une nouvelle aliquote de 10 ml (préparé et complété comme décrit ci-dessus). Chauffer la sonde à95 ° C pendant 10 mn, laisser refroidir sur glace et ajouter à nouveau HS. Incuber le filtre à 37 ° C sous tension. </li></ol> 11 Membrane à laver <ol><li> Récupérer la solution d&#39;hybridation et de le stocker à -20 ° C dans une boîte de radioactivité blindage. </li><li> Rincez le filtre à tampon de lavage (BM) et le laver à fond pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Utiliser un détecteur Geiger Mueller pour le contrôle de la radioactivité résiduelle dans les coins de filtre. Lorsque l&#39;émission de fond est d&#39;environ 5 cps, procéder à la membrane exposition. </li></ol> Détection du signal 12 <ol><li> Exposer le filtre films d&#39;autoradiographie ou sur un écran moléculaire imageur ON. Révéler signaux de traitement photographique ou de la conversion numérique. </li><li> Analyser l&#39;intensité de la bande par le logiciel de quantification dédié (ImageJ ou Optiquant). </li></ol> 13 Membrane dénuder <ol><li> Pour éliminer les signaux primaires, plonger la membrane dans 500 ml d&#39;une solution bouillante à dénuder, Puis incuber à température ambiante pendant 1 min. Passez à nouveau (pré) hybridation ou entreposer le filtre à -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bien que notre appréciation de l&#39;entrelacement sophistiqué par lequel l&#39;ARN régule la neurogenèse est en constante augmentation, les implications mécanistiques de circuiteries à base d&#39;ARN qui affectent neurones biologie des cellules souches, la différenciation neuronale / intégration fonctionnelle, le développement de pathologies et cancers de neurones restent inexplorées. Le maintien de ces réseaux par les royaumes rend le potentiel des systèmes génétiques Drosophila melanogaster con...

ARN biochimie a connu progrès spectaculaires au cours des dernières années 1. Notre compréhension du potentiel de l&#39;ARN dans le contrôle de l&#39;expression génique a été éclaté par l&#39;identification des puissants ribo-régulateurs non codants 2, par la découverte de nouveaux mécanismes de régulation à base d&#39;ARN 3,4 et par une caractérisation détaillée des événements post-transcriptionnelle déjà connues 5. Tous biologie de l&#39;ARN ensemble, ces études ont permis de faire considérablement la scène, devenant un important sujet de recherche dans le paysage scientifique actuel. En particulier, au cours des dernières années, nous obtenons une idée de l&#39;impact profond du «monde de l&#39;ARN&quot; sur la neurobiologie moléculaire 6, l&#39;un des domaines de recherche les plus dynamiques en sciences de la vie moderne. Dans la dernière décennie du siècle passé, le scénario scientifique globale a été révolutionné par la découverte de l&#39;interférence ARN 7,8 et des petits ARN régulateurs 9,10notamment en ce qui concerne les micro-ARN 11 exprimé de manière endogène de petits ARN non codantes impliquées dans le contrôle de la quasi-totalité des fonctions cellulaires en tant que régulateurs pléiotropes et combinatoires de l&#39;expression génique. Près de 10 ans après la découverte initiale miARN dans Caenorhabditis elegans par Ambros et les laboratoires de Ruvkun, une attention renouvelée a été tourné dans le champ quand un grand nombre de miARN ont été identifiés chez la drosophile et dans les cellules humaines ainsi 12-15. Depuis lors, grâce à des approches transgéniques polyvalents, Drosophila melanogaster s&#39;est distingué comme un contexte biologique précieux pour se plonger dans la biosynthèse des miARN et de l&#39;activité. Drosophila miARN ont révélé des fonctions distinctes dans les processus d&#39;insectes spécifiques ou évolutives conservées, allant de vieillissement de métabolisme, les voies de signalisation , le comportement et, bien sûr, la neurogenèse. Le long de cette direction, nous avons récemment dévoilé un lien nouveau 16 dans le co intriganterrelation survenant entre le gène maître gcm / descente et la voie de l&#39;ARN. Le facteur de transcription Gcm mouche / Glide 17-19 constitue un exemple unique de destin cellulaire déterminant, qui dicte le choix de gliale vs destinée neuronale dans multipotentes voler précurseurs neuraux 20. Vingt ans de longues recherches sur ce sujet a clairement souligné l&#39;apparition de multiples entrées et se chevauchent de la régulation de l&#39;expression des gènes convergent sur ​​gcm / glisser 21-28 pour établir les seuils requis pour équilibrer le rapport délicat entre homologues neuronales et gliales au cours du développement neuronal. Nous avons découvert que la régulation par DMEL-miR279 ciblage représente un niveau supplémentaire de contrôle contribuant à la post-transcriptionnelle de réglage fin de gcm / glisser expression 16. Améliorations méthodologiques spécifiques à l&#39;échelle mondiale, ces lignes de recherche ont requis: le long des années, plusieurs technologies initialement développées pour analyser tradARN tradition- ont été convertis pour quantifier les petits ARN non codantes, comme tant RNase de protection, d&#39;ADNc tableaux 29-31, méthodes de PCR en temps réel 32-35 et le séquençage de 36,37. De l&#39;autre côté, le recalibrage des approches techniques a favorisé progrès continus dans le domaine. Northern Blot dosage (NB, ou une analyse par transfert sur gel d&#39;ARN) constitue un exemple représentatif: il est largement utilisé pour le profil de l&#39;accumulation de l&#39;ARN, car elle assure à la fois le niveau d&#39;expression de quantification, ainsi que la détermination de la taille. Cependant, la faible sensibilité intrinsèque de la méthode est de limiter quand il est appliqué à l&#39;expression des gènes tendeurs faible abondance, comme les ARN courts. Une conséquence néfaste est l&#39;exigence de grandes quantités d&#39;ARN total, ce qui rend difficile son application à des échantillons biologiques spécifiques. Pour ces raisons, les variantes NB spécifiques pour la détection des ARN petit ont été développés 38-40: nous avons profité d&#39;un proc NB amélioréeedure 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), tandis que l&#39;élucidation du jeu susmentionné entre DMEL-miR279 et gcm / descente. Cette méthode repose sur une étape de réticulation chimique sur la base de l&#39;activité d&#39;un dérivé de carbodiimide [1-éthyl-3-(3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, EDC] pour fixer l&#39;acide nucléique sur des supports solides. Carbodiimide est un agent de réticulation polyvalent connu pour catalyser la formation de liaisons amide entre les groupes carboxyle activés ou phosphate et des groupes amine 42. Cette propriété peut être exploitée pour coupler de manière covalente par l&#39;intermédiaire de leurs petits ARN groupe 5&#39;-hydroxyle mono-phosphorylé aux groupes amino à la surface des membranes de nylon. La configuration résultant de fixation augmente l&#39;accessibilité de l&#39;acide nucléique immobilisé et, par conséquent, l&#39;efficacité de l&#39;hybridation sonde-cible, ce qui conduit à l&#39;amélioration remarquable de détection 43. La technique suppose notamment relevance dans des études moléculaires de Drosophila, qui par l&#39;apparition de nouvelles catégories distinctes et de petits ARN non codants de 44 émerge. Parmi ceux-ci, rasiRNAs 45,46 constituent un sous-type spécifique des ARN Piwi-interacting (piRNAs 47), impliqués dans l&#39;inactivation de gène spécifique à la séquence. Détails opérationnels de cette méthode sont décrits en détail et visualisés ci-après, par rapport à l&#39;analyse de la microARN DMEL-miR279 et DMEL-miR286 et, pour la première fois, d&#39;une rasiRNA, rasi4. Nous avons poussé à l&#39;extrême cette méthode, qui nous a permis révélant des objectifs mal exprimés à partir des quantités minimes de l&#39;ARN (moins de 1 ug).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Les dernières décennies ont vu l&#39;explosion de l&#39;intérêt scientifique autour des mécanismes de contrôle de l&#39;expression des gènes au niveau de l&#39;ARN. Cette branche de la biologie moléculaire a été fortement alimentée par la découverte de non codantes des ARN comme des acteurs majeurs dans la régulation post-transcriptionnelle. Une telle perspective révolutionnaire a été accompagnée et déclenchée par le développement de technologies puissantes pour le profilage des ARN courte expression, à la fois au niveau haut débit (identification du génome entier) ou analyse d&#39;un seul candidat (accumulation de l&#39;état d&#39;équilibre des espèces spécifiques). Bien que plusieurs stratégies état de l&#39;art sont actuellement disponibles pour le dosage ou la visualisation de ces molécules fuyant, analyse Northern Blot reste l&#39;approche droit dans la biologie moléculaire pour l&#39;évaluation immédiate et précise de l&#39;expression de l&#39;ARN. Il constitue une première étape vers l&#39;application de technologies coûteuses, plus sophistiqués et, dans de nombreux cas, reste une méthode préférentielle pour gagner facilement des idéesARN en biologie. Ici, nous aperçu un protocole efficace (Enhanced Northern Blot) pour détecter les microARN faiblement exprimés (ou d&#39;autres espèces de petits ARN réglementaires) de Drosophila melanogaster embryons entiers, disséqué manuellement tissus / adultes larvaires ou dans des cellules cultivées in vitro. Une quantité très limitée de l&#39;ARN est nécessaire et l&#39;utilisation du matériel de flux cellules cytométrie isolées peuvent être également envisagée.

En suivant la procédure générale décrite dans le texte et représentés schématiquement sur ​​la figure 1, nous avons évalué l&#39;expression de petits ARN à partir d&#39;échantillons d&#39;ARN complexes de différentes origines. Dans l&#39;expérience présentée à la figure 1, l&#39;ARN a été isolé à partir de 2 cellules de Drosophila Schneider par extraction à la protéinase K, vérifiés pour l&#39;intégrité (étape optionnelle: dénaturation agarose fr...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Le but de cette publication est de visualiser et de discuter des étapes opérationnelles d&#39;un protocole Northern Blot améliorée sur l&#39;ARN extrait de Drosophila melanogaster embryons, des cellules et des tissus. Ce protocole est particulièrement utile pour la détection efficace de petites espèces d&#39;ARN.

Amélioration de la détection du Nord Blot des petits ARN espèces en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K vues.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  Le but de cette publication est de visualiser et de discuter des étapes opérationnelles d'un protocole Northern Blot améliorée sur l'ARN extrait de Drosophila melanogaster embryons, des cellules et des tissus. Ce protocole est particulièrement utile pour la détection efficace de petites espèces d'ARN. 

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Recherche

Biologie

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissection de Oenocytes d&#39;adultes Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Une technique non invasive cheveux d&#39;échantillonnage pour obtenir l&#39;ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Génération substrat pour des endonucléases de CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Mesure de la durée de vie en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagerie à travers le cas de la nymphe<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Le maintien d&#39;un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...