HPV RNA CISH permet la détection d’une infection active par le virus du papillome humain. Puisque l’hybridation in situ cible l’ARN hpv cette technique permet la visualisation d’une transcription active du virus. Il a la résolution spatiale précise et de bonnes exécutions de diagnostic.
La détection du VPH peut appuyer le diagnostic de plusieurs lésions liées au VPH, comme le carcinome épiphymous oropharyngeal ou la néoplasie cervicale. Il peut également avoir une influence sur le pronostic. Après avoir préparé des tampons et contre-souillé les reagents, préparez un reagent de récupération de cible x dans un grand bécher en ajoutant 70 millilitres de 10x reagent de récupération cible à 630 millilitres d’eau distillée.
Placez le bécher sur une plaque chauffante avec un agitateur magnétique et couvrez-le de papier d’aluminium. Faire bouillir son contenu à 100 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes en s’assurant de ne pas le faire bouillir pendant plus de 30 minutes. Pour bloquer l’activité de la peroxyde sur les toboggans avec des sections tissulaires préalablement déparaffinées et placées dans la grille de diapositives, ajoutez quatre à six gouttes, juste assez pour couvrir l’échantillon, de peroxyde d’hydrogène à chaque glissière, et incubez-les pendant 10 minutes à température ambiante.
Laver les toboggans deux fois pendant deux minutes dans de l’eau distillée à température ambiante. Pour briser les limites de tissu d’ARN dans les sections de tissu d’ARN, retirez d’abord la feuille d’aluminium de l’ébullition un x TRR à l’aide d’une griffe, et arrêtez de remuer. Immerger le support de diapositives lentement et très soigneusement.
Couvrir à nouveau le bécher avec le papier d’aluminium et incuber pendant 15 minutes. Utilisez la griffe pour transférer immédiatement la grille à glissière chaude dans un bain d’eau distillée et la laver pendant deux minutes. Lavez ensuite les glissières dans de l’éthanol frais à 100 % pendant deux minutes et laissez-les sécher à température ambiante pendant deux minutes.
Ensuite, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner une barrière autour de chaque échantillon, et laissez-le sécher pendant au moins cinq minutes. Pour la digestion de la protéase, placez les glissières dans le bac à humidité contrôlée et ajoutez environ quatre gouttes de Protease Plus par échantillon. Couvrir le plateau d’un couvercle et l’insérer dans le four d’hybridation pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius.
Retirer le plateau du four et retirer la grille à glissière. En travaillant une diapositive à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez la glissière dans le support à glissière immergé dans un plat teinté rempli d’eau distillée. Laver les toboggans deux fois pendant deux minutes dans de l’eau distillée à température ambiante avec une agitation constante.
Pour commencer l’hybridation, appuyez et feuilletez les glissières pour enlever tout excès de liquide et les remettre dans le support de diapositives. Retirer la sonde hpv préchauffée du four et ajouter environ quatre gouttes pour couvrir entièrement chaque section. Couvrir le plateau avec le couvercle et l’insérer dans le four pendant deux heures à 40 degrés Celsius.
Après avoir terminé l’incubation, retirer le plateau du four et retirer la grille à glissière. Une diapositive à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez la glissière dans le support à glissière immergé dans un plat de coloration rempli d’un tampon de lavage x, lavant les glissières pendant deux minutes à température ambiante avec agitation constante, et répétez avec un tampon de lavage x frais. Appuyez et feuilletez pour enlever tout excès de liquide des glissières et placez-les à nouveau dans le porte-diapositives.
Ajouter environ quatre gouttes d’AMP1 à température ambiante par section pour couvrir entièrement chaque section. Couvrir le plateau avec le couvercle et l’insérer dans le four pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius. Après avoir retiré le plateau du four, retirer la grille à glissière.
En travaillant une diapositive à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez la glissière dans le porte-glissière immergé dans un plat de coloration rempli d’un tampon de lavage x, lavant pendant deux minutes à température ambiante avec agitation constante, et répétez avec un tampon de lavage frais x. Distribuez le même nombre de gouttes de chaque solution DAB-A et DAB-B dans un tube de taille appropriée pour fabriquer environ 120 microlitres de substrat DAB par section et vortex. Prenez chaque glissière, une à la fois, du porte-diapositives, appuyez et feuilletez pour enlever l’excès de liquide et placez-le de nouveau dans le porte-diapositives.
Pipette environ 120 microlitres de mélange DAB sur chaque section de tissu, en s’assurant que les sections sont couvertes. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante, et procéder à la contre-coloration. Placez une goutte de milieu de montage par lame de verre, puis placez les lattes sur les glissières et laissez-les sécher à l’air libre.
Après quelques heures, procéder à l’évaluation à l’aide d’un microscope optique tel que décrit dans le manuscrit. Comme décrit ici dans le carcinome squameux de cellules de tête et de cou, la présence de coloration punctiforme brune dans le cytoplasme ou dans les noyaux des cellules de tumeur a défini un cas positif. Les résultats ont été divisés en deux scores, ARN CISH score élevé et faible comme observé avec un objectif 20x.
La coloration de score de CISH d’ARN est considérée basse une fois observée dans moins de 50% des cellules de tumeur et couvre moins de 80% de la surface de cellules. D’autre part, le score de CISH d’ARN est élevé une fois observé dans plus de 50% des cellules cancéreuses souillées, ou avec la surface de coloration dépassant 80% dans plus de 30% des cellules de tumeur. Il ne faut jamais laisser sécher les glissières pour l’hybridation.
N’oubliez pas de préchauffer la sonde. Pour chaque échantillon, effectuer un contrôle positif et négatif afin d’évaluer la qualité de l’ARN.
