The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

1. Préparation des instruments, des substrats, Culture Media et Plats <ol><li> Manipulation de nitrure de silicium (Si 3 N 4) fenêtres. <ol><li> Ouvrir la capsule légèrement en serrant une extrémité portant la fenêtre de manière à ne pas serrer la fenêtre elle-même, tout en faisant tourner l&#39;autre extrémité de la capsule avec l&#39;autre main. </li><li> Vérifiez une paire de revers, pinces à pointe fine sous stéréomicroscope pour se assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de colle, des lacunes ou des coudes à la pointe. Sinon, les fenêtres peuvent être brisés par la pince à épiler ou se envolent d&#39;entre eux au cours des étapes subséquentes. </li><li> Retirer la fenêtre de la capsule en saisissant soigneusement le châssis de la fenêtre avec une pince, tout en serrant doucement la capsule à proximité de l&#39;extrémité ouverte en appliquant une pression dans une direction de manière à rendre la capsule plus large où les bords de la fenêtre doivent sortir. </li></ol></li><li> Fenêtre de pré-lavage (en option). <ol><li> Si vous le souhaitez, des fenêtres pré-lavage en les plongeant doucementdans de l&#39;eau distillée pendant 5 secondes, suivie par 2 min lavage dans 70% d&#39;éthanol et 2 min lavage dans 100% d&#39;éthanol. </li></ol></li><li> Apposition et la stérilisation fenêtres sur la boîte de culture. <ol><li> Pour fixer les fenêtres, régler la fenêtre avec le côté plat vers le haut au bas de la boîte de culture, placez un morceau de ruban adhésif sur une lame de verre propre. Couper environ une bande quart de pouce descendre la côté long de la bande. Prendre une tranche de la bande sur le côté court (à ⅛ &quot;de ¾&quot;) avec une lame de rasoir propre. </li><li> Utiliser des pinces pour appliquer la tranche de la bande au bord de la grille ou de la fenêtre. Utiliser suffisamment pour la faire adhérer en toute sécurité sans couvrir l&#39;ouverture de la fenêtre elle-même. Manipulation du ruban collé avec des pincettes, régler la fenêtre vers le bas sur le fond de la boîte de culture. Utilisez la pointe de la pince à adhérer bande au bas de la boîte de culture fermement. </li><li> Appliquer une autre bande de ruban à l&#39;autre bord et respecter ce au fond fermement avec le bout de la pince à épiler. </li><li> Une fois que toutes les fenêtres sontenregistrée, stériliser fenêtres dans des boîtes de culture avec les rayons ultraviolets (UV). Accomplir cela en plaçant la capsule sous la lampe UV dans une hotte à flux laminaire pendant environ 1 h. </li><li> (Facultatif) Si les fenêtres doivent être pré-revêtu de poly-lysine, faire la fenêtre suivante stérilisation. Enduire la fenêtre avec 10 pi de solution pendant 1 heure stérile 0,01% de poly-L-lysine dans un incubateur à 37 ° C, puis rincer la solution restante hors avec le milieu de culture. </li></ol></li><li> Préparation des tampons pour lavage final avant XFM. <ol><li> Préparer soit un tampon Tris-glucose ou pipérazine N, N &#39;-bis (acide éthanesulfonique) (PIPES) -saccharose tampon exempt de tous métaux en traces, par l&#39;osmolalité et le pH équivalent de tampon de phosphate de la solution saline de Dulbecco (D-PBS) sans calcium et magnésium. Utilisez l&#39;un de ces tampons pour rincer les cellules après que les cellules sont fixés chimiquement. <ol><li> Pour préparer la solution de Tris-glucose (Tris 10 mM, glucose 260 mM, acide acétique 9 mM), ajouter 1,4 g de glucose, 36 mg de base Tris et16 ul d&#39;acide acétique à 20 ml d&#39;eau ultrapure. Ensuite, régler le volume final à 30 ml avec de l&#39;eau ultra-pure. Aucun ajustement de pH ne est nécessaire. Stocker à température ambiante jusqu&#39;à une semaine. </li><li> Pour faire les pipes-saccharose (20 TUYAUX mM, saccharose 200 mM) ajouter 0,18 g de tuyaux et de 2,0 g de saccharose à 20 ml d&#39;eau ultra pure et ajuster le pH à 7,4 avec de petites quantités d&#39;acide acétique concentré. Ensuite, régler le volume final à 30 ml avec de l&#39;eau ultra-pure. Stocker à température ambiante jusqu&#39;à une semaine. REMARQUE: La raison d&#39;éviter l&#39;utilisation de PBS dans le rinçage final est que les concentrations de phosphate, chlorure et de potassium dans du PBS sont si élevés qu&#39;il ne peut interférer avec XFM si elle ne est pas complètement éliminé avant séchage à l&#39;air. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation des tampons pour le placage des cellules. <ol><li> Élaborer ou sur tous les médias, tel que le milieu RPMI 1640, 1x solution de trypsine-EDTA, D-PBS, et tous les autres réactifs que nécessaire pour la ligne de cellules adhérentes particulier qui normalement seraient fait pour repiquage des cellules adhérentes of intérêt, et les chauffer à 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Placage des cellules <ol><li> Dans la boîte de culture stérilisé contenant les fenêtres, dans la hotte à flux laminaire, ajouter doucement les supports (10 ml pour une boîte de culture de 100 mm), le long du côté de la boîte de culture avec elle selon un angle incliné. Éviter de créer la tension de surface inutiles ou de faire tomber les médias directement sur la surface des fenêtres de nitrure de silicium. Comme les médias est ajouté, soulager lentement l&#39;angle d&#39;inclinaison pour enrober la grille et la fenêtre avec les médias. </li><li> Préparer la ligne de cellules adhérentes d&#39;intérêt appropriée, trypsinisation ou gratter les cellules hors des plaques comme d&#39;habitude pour repiquage de la lignée cellulaire. Effectuez l&#39;une numération cellulaire, ou autre préparation nécessaire avant d&#39;appliquer les cellules à la plaque frais. </li><li> Ajouter les cellules de la boîte de culture avec des fenêtres à une densité cellulaire qui est nécessaire pour atteindre typiquement 50% à 70% de confluence au sein de 24 à 72 h, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone. </li&gt; <li> Observer la croissance de cellules de temps en temps, en utilisant un microscope optique inversé, jusqu&#39;à ce que la densité cellulaire souhaitée (généralement de 50% à 70% de confluence) est atteinte. </li></ol> 3. Fixation de cellules <ol><li> Préparer une solution fraîche de paraformaldehyde à 4% dans du D-PBS en diluant un stock acheté (tel que 25% de paraformaldehyde) et en ajustant le pH à 7,4 avec de l&#39;acide acétique (pour éviter d&#39;ajouter un excès de sodium à l&#39;échantillon). </li><li> Lorsque les cellules ont été cultivées comme souhaité, et les taches vitales (comme Hoescht) ont été appliquées et imagé, retirez le support par aspiration douce, l&#39;inclinaison du plat à un angle de 45 ° avec une seule main, et aspirer à la pipette à la main avec l&#39;autre . Remarque: au lieu des médias de pipetage passé, une alternative est de choisir la fenêtre jusqu&#39;à, tremper la fenêtre dans des microtubes avec D-PBS deux fois, puis placez-le dans un nouveau récipient de culture avec des solutions de fixateur pendant 20 min suivie par deux fois de PBS lavage pour éliminer les fixateurs résiduelles. Si ce est choisi, allez dirtement à l&#39;étape 3.5. </li><li> Rincer le plat doucement avec D-PBS et remplacer immédiatement le liquide retiré en ajoutant doucement le frais 4% PFA / PBS tout en maintenant le plat à un angle de 45 °, pipetage vers le côté de la boîte, et relaxant lentement l&#39;angle d&#39;inclinaison pour permettre la solution de fixation pour couvrir les fenêtres. Maintenir les cellules recouvertes de le fixatif pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Retirez le liquide par aspiration douce, encore une fois comme ci-dessus, en inclinant légèrement la parabole et aspirer à la main. </li><li> Remplacez le liquide retiré en ajoutant délicatement une partie des tuyaux / solution de saccharose, en utilisant la méthode de basculement et de pipetage décrit dans l&#39;étape 3.3. </li><li> Répétez les étapes 3.4 et 3.5. </li><li> Préparer le matériel pour le séchage. <ol><li> Rassemblez serviettes non pelucheux tels que Kimwipes, et tirez une sortie de la boîte de sorte qu&#39;il est à portée de main très rapidement et facilement. </li><li> Préparer un, non niveau endroit propre pour définir la fenêtre de sécher. Situé sur un tapis de grille de caoutchouc du type utilisé en microscopie électronique, qui comporte des nervures de sortela fenêtre peut être calé sur une extrémité tout en séchant. Cela permet de garder la fenêtre de se coincer à la surface de séchage en séchant, et vidanger tout tampon restant à bord de l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> Tweeze délicatement la bande attaché à la fenêtre de tenir jusqu&#39;à la fenêtre du liquide. Récupérer fenêtres qui se détachent de la bande en appliquant une petite quantité de tubes / saccharose de les amener à flotter, puis les ramasser avec les pincettes inverse. </li><li> Soigneusement (sans toucher à la fenêtre elle-même) et bien barbouiller tout excès TUYAUX / saccharose à partir du bord de la fenêtre avec un Kimwipe. Barbouiller également la zone en retrait de retour en utilisant un pli arrondi d&#39;un Kimwipe. NOTE: Le but est d&#39;avoir aussi peu cristallisation des sels ou des tampons sur la surface de la fenêtre que possible. </li><li> Placez la fenêtre sur le tapis de la grille. Assurez-vous que la fenêtre ne est pas à plat sur le tapis de grille, mais calé sur un bord (en utilisant les crêtes de la nappe de treillis) et toucher aussi peu de la grillemat que possible. Laissez la fenêtre sec. </li></ol> 4. Montage de l&#39;échantillon et d&#39;imagerie <ol><li> Une fois que l&#39;échantillon a séché, vérifier la présence de cellules sur les fenêtres en utilisant un microscope optique. Effectuer cette vérification, avant de préparer les échantillons pour le transport vers un synchrotron. </li><li> Emballez les fenêtres pour le transport à la ligne de lumière synchrotron hébergement de votre expérience. Apposer doucement les fenêtres avec du ruban adhésif sur les deux côtés sur une lame de verre, puis apposer la lame de verre avec du ruban adhésif au fond d&#39;une boîte de Petri en plastique. Collez le plat arrêt Petri. NOTE: Avant ce point, ces étapes peut être effectuée dans ne importe quel laboratoire typique. Les étapes suivantes seraient mieux fait à une ligne de lumière synchrotron. </li><li> Retirer le ruban de la fenêtre doucement avec des pincettes. Utilisez le vernis à ongles, dans une mince couche uniforme le long du bord de la fenêtre, pour sécuriser les fenêtres à un support en aluminium fourni par les collaborateurs de lignes de lumière au synchrotron. </li><li> Insérez le support d&#39;aluminium dansune cinématique de montage, puis placez-le en position dans le microscope à rayons X. Monter l&#39;échantillon sur un support le raccordant à platines motorisées, à l&#39;intérieur de la chambre de mesure à la ligne de lumière. </li><li> Après avoir quitté la zone des rayons X de l&#39;appareil de microscope de l&#39;échantillon (une cage faite de parois de plomb-remplie), la configuration du balayage. Grâce à un logiciel spécifique ligne de lumière, choisir la zone appropriée de l&#39;échantillon à analyser, tout en visualisant la position du faisceau de rayons X sur l&#39;échantillon en utilisant une caméra équipée d&#39;une vidéo croix et pré-alignés avec un appareil photo de scintillateur aval. </li><li> Choisir la résolution appropriée pour l&#39;échantillon, basé sur une estimation de la taille du plus petit élément caractéristique d&#39;intérêt. Pour l&#39;imagerie des cellules de mammifères simples (~ 20-40 um), utilisez une résolution de 0,25 à 0,5 um. Pour imager les zones de tissus, et de distinguer les couches de cellules de l&#39;autre, utiliser une résolution de 2-20 um. </li><li> Choisir le temps de séjour approprié pour l&#39;échantillon, basé sur une estimation de la quantité de la respectéesal d&#39;intérêt présent. Pour une analyse aperçu rapide, ou si de grandes quantités de métaux sont présentes, utiliser scans de voler avec des temps de séjour de 30 à 300 ms par pixel. Si peu de matériel est présent, ou pour mesurer les métaux de faible abondance relative, utiliser scans étape avec des temps de séjour de 1 à 2 secondes par pixel. </li><li> Programmer les scans dans le logiciel spécifique ligne de lumière. Acquérir une image raster-scan. Travailler en collaboration avec les collaborateurs de lignes de lumière pour analyser les données avec un logiciel qui permettra d&#39;identifier les pics d&#39;énergie caractéristiques pour chaque élément. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X-ray imagerie de fluorescence est utile dans de nombreux domaines, y compris les sciences de la terre, la science des matériaux et la biologie chimique 26-34. Les progrès dans les rayons X synchrotron, et leur mise au point, ont produit de très faisceaux de haute intensité. Focused X-faisceaux de rayons suffisante pour exciter les métaux endogènes dans les cellules exister maintenant, de production de signal qui peut être mesurée avec la technologie actuelle silicium détecteur de dérive. Et l&#39;?...

X-ray imagerie de fluorescence permet à la fois l&#39;identité et la quantité des éléments présents dans un échantillon à spatialement résolue. Rayons X incidents, d&#39;une énergie choisie pour être supérieure à l&#39;énergie de l&#39;élément le plus lourd d&#39;intérêt liaison électronique, surmonter l&#39;énergie de liaison des électrons intérieure-shell pour le noyau 1. Cela crée un «trou» dans la couche électronique. Comme les électrons de haute énergie tombent dans ces trous, les rayons X fluorescents sont émis, dont la longueur d&#39;onde dépend de l&#39;énergie de séparation de ces orbitales. Étant donné que l&#39;espacement en énergie des orbitales est caractéristique d&#39;un élément donné, la fluorescence de rayons X a également émission longueurs d&#39;onde caractéristiques, dépendantes de l&#39;élément. Ce est cette émission à une longueur d&#39;onde caractéristique qui permet d&#39;identifier les éléments présents. L&#39;étalonnage de l&#39;intensité de fluorescence permet la quantification des éléments présents. Fluorescence X microscopy (XFM) est devenu de plus en plus utilisé, en partie grâce au développement de sources de rayonnement synchrotron à rayons X très brillants, tels que ceux à Spring-8 au Japon, la Facilité européenne de rayonnement synchrotron (ESRF) en France, et l&#39;Advanced Photon Source ( APS) aux États-Unis 2. Ces sources fournissent de très haute intensité faisceaux de rayons X. Dans le même temps, des améliorations dans l&#39;optique X-ray, comme la technologie de plaque de la zone, a permis la mise au point de ces faisceaux à taches sous-micron, mais plutôt inefficace 3. Avec mêmes faisceaux de haute intensité, même relativement petite quantité de lumière qui peut être concentrée est suffisante pour exciter les métaux endogènes dans les cellules, produisant un signal qui peut être mesurée avec la technologie de détection actuellement disponibles. Ainsi, l&#39;étude de la biologie chimique des métaux dans la cellule est une application en particulier qui rend l&#39;utilisation de la plupart des développements récents dans cette technique 4-10. Il ya beaucoup de facteurs essentiels à prendre en considération tout appcouché XFM pour enquêter sur la répartition des éléments et la quantification des cellules de mammifères cultivées ou d&#39;autres échantillons biologiques. Tout d&#39;abord, l&#39;échantillon doit être conservé intact, à la fois structurellement et par rapport à sa composition élémentaire, pour que la mesure ait un sens. En second lieu, l&#39;échantillon doit également être conservée en quelque sorte de sorte qu&#39;il est robuste aux dégâts d&#39;irradiation qui peut être provoquée par un faisceau de rayons X focalisé. Une façon qu&#39;un échantillon peut répondre à ces deux critères à la fois à congeler rapidement dans une glace amorphe vitreuse 11,12. Congélation rapide est souvent réalisée grâce à diverses techniques de cryoconservation telles que le gel de plongée ou à haute pression de congélation 13-16. Il est généralement admis que la cryoconservation préserve architecture cellulaire globale et des compositions chimiques dans des échantillons biologiques aussi près que possible l&#39;état natif. Fixation chimique, d&#39;autre part, à cause de la pénétration lente et sélective des fixateurs dans des cellules et des tissus en well modifications ultérieures de perméabilité de la membrane, peuvent permettre divers ions cellulaires en particulier les ions diffusibles tels que Cl, Ca et K pour être lessivés, perdus ou déplacés, ce qui rend l&#39;enquête de ces éléments sous-optimaux 17-19. Malgré l&#39;avantage évident de cryo-fixation sur la fixation chimique en général, pour les cellules mammifères adhérentes en particulier, la cryoconservation a diverses limitations 20-23. La plus évidente est que chaque laboratoire de recherche offre un accès facile aux instruments de cryoconservation. La plupart des congélateurs à haute pression ou même des courants plongent les congélateurs sont coûteux et détenue uniquement par un sous-ensemble d&#39;installations cryogéniques, qui peut être loin de l&#39;endroit où les cellules sont incubées. L&#39;avantage de la cryoconservation pourrait être échangé contre l&#39;inconvénient de stress Voyage placé sur les cellules. Ainsi, alors que la cryoconservation est certainement la façon la plus rigoureuse pour préserver des échantillons pour l&#39;analyse par fluorescence de rayons X, il ne est certainement pas le plus accessible à tous les chercheurs dans toutes les circonstances;il ne est pas toujours indispensable - si les métaux d&#39;intérêt sont étroitement liés à des macromolécules corrigeables, et la résolution à laquelle l&#39;échantillon sera imagée est plus grande que les dommages à l&#39;ultra-microstructure qui pourrait se produire au cours du séchage. Consciente des réserves 24, fixation chimique et le séchage peuvent être un choix approprié. D&#39;autres facteurs dans un X-ray expérience d&#39;imagerie de fluorescence succès comprennent une analyse appropriée. X-ray imagerie de fluorescence est fondamentalement X-ray spectroscopie d&#39;émission de fluorescence combinée avec raster-numérisation pour fournir une résolution spatiale. Les spectres émission de fluorescence à rayons X recueillies contiennent une combinaison de chevauchement des pics d&#39;émission, de fond, et les pics de diffusion élastique et inélastique du faisceau incident. Logiciel qui permet la dé-convolution de ces contributions, et le montage des pics d&#39;émission, est un développement important de ce domaine 25. En outre, le développement commercial et distribution normes de couches minces de composition connue, utilisée pour étalonner l&#39;intensité de fluorescence par rapport à la quantité matière, est également très importante. Ce protocole fournit une description de la préparation de cellules adhérentes par fixation chimique et séchage à l&#39;air. Une étape cruciale dans ce processus est la croissance des cellules sur les fenêtres de nitrure de silicium, qui souvent ne adhèrent pas bien, ce qui rend le rinçage doux dans une clé de manière particulière à la réussite.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">silicon nitride windows</td>
			<td style="width:423px;">Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.&#160; Thickness 500 nm.&#160; Frame size: 5 mm x 5 mm.&#160; Frame thickness: 200 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">reverse tweezers</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">78520-5X</td>
			<td style="width:167px;">EMS 5X, NC &#8211; Ultra Fine Tweezers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">rubber grid mat</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">71170</td>
			<td style="width:167px;">Round Grid Mat</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">acetic acid</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">338826</td>
			<td style="width:167px;">trace metals grade concentrated acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PIPES buffer</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:167px;">solid PIPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">formaldehyde stock solution</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">RT 17113</td>
			<td style="width:167px;">10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

La capacité de l&#39;imagerie par fluorescence des rayons X pour fournir des informations sur les échantillons biologiques est subordonnée à ces échantillons préparés d&#39;une manière telle qu&#39;ils résistent à dégâts d&#39;irradiation sur l&#39;échelle de temps de l&#39;expérience, et encore leurs caractéristiques chimiques et structurelles sont bien préservé. Dans l&#39;affichage le résultat d&#39;un échantillon qui a été préparé comme décrit ci-dessus et imagé, il est possible de voir qu&#...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Préparation cellules adhérentes pour fluorescence X-ray Imaging par fixation chimique

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K vues.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Une simple et rapide Protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Recherche

Chimie

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

X-ray Powder Diffraction en science de la conservation: Vers Routine structure cristalline Détermination des produits de corrosion sur l&#39;art du patrimoine Objets

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

Quantifier les données de Fluorescence de rayons x à l’aide de cartes

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

Puces microfluidiques pour diffusion de lumière dynamique Diffraction de rayons x de cristaux In Situ et In Situ pour série cristallographie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for the purpose of biophysical characterization, and measure substrate transfer between periplasmic and cytoplasmic compartments. By carefully limiting the time that the periplasm is separated from the cytoplasm, the experimenter can extract the protein of interest and assay each compartment individually for substrate without carry-over contamination between compartments. The extracted protein from fractionation can then be further analyzed for three-dimensional structure determination or substrate-binding profiles. Alternatively, this method can be performed after incubation with a radiotracer to determine total percent uptake, as well as distribution of the tracer (and hence metal transport) across different bacterial compartments. Experimentation with a radiotracer can help differentiate between a physiological substrate and artefactual substrate, such as those caused by mismetallation.
X-ray fluorescence can be used to discover the presence or absence of metal incorporation in a sample, as well as measure changes that may occur in metal incorporation as a product of growth conditions, purification conditions, and/or crystallization conditions. X-ray fluorescence also provides a relative measure of abundance for each metal, which can be used to determine the best metal energy absorption peak to use for anomalous X-ray scattering data collection. Radiometal uptake can be used as a method to validate the physiological nature of a substrate detected by X-ray fluorescence, as well as support the discovery of novel substrates.

A protocol for the extraction of a periplasmic transition metal chaperone in the context of its native binding partners, and biophysical characterization of its substrate contents by X-ray fluorescence and radiometal uptake is presented.

Absorption des métaux essentielle chez les bactéries Gram-négatives : x-Ray Fluorescence, radio-isotopes et fractionnement de cellules

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid based on volatile solar and wind sources. The pressing demand of developing high-performance electrochemical energy storage solutions, i.e., batteries, relies on both fundamental understanding and practical developments from both the academy and industry. The formidable challenge of developing successful battery technology stems from the different requirements for different energy-storage applications. Energy density, power, stability, safety, and cost parameters all have to be balanced in batteries to meet the requirements of different applications. Therefore, multiple battery technologies based on different materials and mechanisms need to be developed and optimized. Incisive tools that could directly probe the chemical reactions in various battery materials are becoming critical to advance the field beyond its conventional trial-and-error approach. Here, we present detailed protocols for soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS), soft X-ray emission spectroscopy (sXES), and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) experiments, which are inherently elemental-sensitive probes of the transition-metal 3d and anion 2p states in battery compounds. We provide the details on the experimental techniques and demonstrations revealing the key chemical states in battery materials through these soft X-ray spectroscopy techniques.

Here, we present a protocol for typical experiments of soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS) and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) with applications in battery material studies.

Détection sensible élémentaire de la chimie dans les Batteries par spectroscopie d’Absorption des rayons x mous et la diffusion des rayons x inélastique résonante

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. These cell lines, after treatment with ascorbic acid (AA) and &#946;-glycerophosphate (&#946;-GP), undergo complete osteogenic transdifferentiation from proliferation to mineralization and produce matrix vesicles (MVs) that trigger apatite nucleation in the extracellular matrix (ECM).
Based on Alizarin Red-S (AR-S) staining and analysis of the composition of minerals in cell lysates using ultraviolet (UV) light or in vesicles using TEM imaging followed by EDX quantitation and ion mapping, we can infer that osteosarcoma Saos-2 and osteoblastic hFOB 1.19 cells reveal distinct mineralization profiles. Saos-2 cells mineralize more efficiently than hFOB 1.19 cells and produce larger mineral deposits that are not visible under UV light but are similar to hydroxyapatite (HA) in that they have more Ca and F substitutions.
The results obtained using these techniques allow us to conclude that the process of mineralization differs depending on the cell type. We propose that, at the cellular level, the origin and properties of vesicles predetermine the type of minerals.

We present a protocol to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. Their mineralization profiles were analyzed by Alizarin Red-S (AR-S) staining, ultraviolet (UV) light visualization, transmission electron microscopy (TEM) imaging and energy dispersive X-ray microanalysis (EDX).

Analyse des minéraux produits par hFOB 1.19 et Saos-2 cellules à l’aide de microscopie électronique à Transmission avec Energy Dispersive x-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Induite par le ligand de nucléation et croissance de nanoparticules métalliques de Palladium

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

Amélioration d’Extrusion de haute viscosité de microcristaux de Time-resolved série femtoseconde cristallographie à rayons x Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

Préparation d’échantillons biologiques pour la spéciation à température cryogénique à l’aide de la spectroscopie d’absorption de rayons X à haute résolution

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...