Financement: US Army Research &amp; Medical Materiel Command (USAMRMC) et géré par la télémédecine et avancée Technology Research Center. Shunxi Ji a contribué à la modification des seringues comme décrit ici.

1. Configuration du système Le système est constitué d&#39;un support et en concentrant réservoir (HCT) équipé d&#39;un mélangeur à un étage, un cisaillement élevé homogénéisateur en ligne, une pompe à rouleaux pour déplacer le fluide entre le HCT et l&#39;homogénéisateur, et un échangeur de chaleur (figure 1). <ol><li> Placez un, large ouverture 4 L récipient de collecte de verre stérilisé équipé de 2 ports de base et 3 ports secondaires sous le mélangeur en une seule étape. Abaissez la tête du batteur jusqu&#39;à l&#39;embouchure de la cuve et assurer un raccord étanche aux gaz en utilisant des joints en caoutchouc ou du ruban adhésif (pour éviter de contaminer l&#39;air ambiant de l&#39;espace de tête). </li><li> Monter un des ports de base (Figure 1, le port n ° 1) du HCT avec stérile 3/8 &quot;(ID) tuyau transparent, environ 10&quot; de long, munie d&#39;un robinet 3 voies à la pointe pour la collecte de l&#39;émulsion concentrée . </li><li> Monter le deuxième port de base (figure 1, le port # 2) stérile 3/8 &quot;(ID) des tubes, approximately 36 &quot;de longueur. Alimenter ce tube à travers une pompe à rouleaux. Monter l&#39;entrée de l&#39;homogénéisateur à cisaillement élevé avec un T-pièces, y compris deux ports et connecter comme suit: connecter les tubes du port n ° 2, à travers la pompe à galet et se connecter au port du côté de la pièce en T. Attachez l&#39;autre orifice à un réservoir d&#39;oxygène en utilisant un débitmètre à faible débit d&#39;oxygène gazeux. </li><li> Connecter le port de sortie du dispositif d&#39;homogénéisation à cisaillement élevé à l&#39;orifice d&#39;entrée d&#39;un échangeur de chaleur en ligne maintenue à 4 ° C. Connecter le port de sortie de l&#39;échangeur de chaleur à l&#39;orifice de retour du HCT (figure 1, le port n ° 3), la création d&#39;un système en boucle fermée. </li><li> Attacher un réservoir d&#39;oxygène (via un débitmètre) au HCT (figure 1, le port # 4). Fixer un écran de composition du gaz qui est ouvert à l&#39;atmosphère à l&#39;orifice supérieur de l&#39;HCT (figure 1, le port n ° 5). </li><li> Si la stérilité est souhaitée, stériliser les composants de verre et de métal avant chaque utilisation par autoclave. Stériliser les composants de tubes et co plastiquennectors par l&#39;oxyde d&#39;éthylène avant chaque utilisation. Ceci est particulièrement important si le produit doit être testé in vivo. </li></ol> 2. LOM Fabrication <ol><li> Placer 20 g de GMP 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC) et 10 g de cholestérol à la base du HCT. Ajouter 1 L d&#39;Plasma-Lyte A à l&#39;HCT et mélanger à la main pendant 1 minute, en intégrant autant que possible des lipides en phase aqueuse. </li><li> Abaisser le mélangeur en une seule étape dans la phase aqueuse, en veillant à ce que la tête de mélangeur est entièrement recouverte par la phase aqueuse. Assurez-vous que le haut de la HCT est étanche aux gaz (voir l&#39;étape 1.1 ci-dessus) et qu&#39;il n&#39;y a pas de ports secondaires ouvertes. Allumez la source de gaz connecté au port n ° 4 et attendre jusqu&#39;à ce que la fraction d&#39;oxygène de l&#39;espace libre du HCT atteint&gt; 95%. À 10 L / min (LPM), ce qui devrait prendre ~ 10 min. </li><li> Utilisation de la console en une seule étape, mélanger l&#39;émulsion de précurseur pendant 5 min à 5000 rpm. Le mélange obtenu doit apparaître blanc pâle et ne contiennent pas lipi visibled touffes. Une fois mélangé, le mélange eau-lipide utilisé peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 30 jours avant de l&#39;utiliser seul. </li><li> Premier l&#39;ensemble du système en boucle fermée avec l&#39;émulsion de précurseur en activant la pompe à galet à 1,3 LPM. Une fois que le système est amorcé, garder la pompe à 1,3 LPM. </li><li> Pour commencer la fabrication des OLM, mettez le cisaillement élevé homogénéisateur en ligne à 7500 rpm. Immédiatement par la suite, mettre en marche le flux d&#39;oxygène à la partie d&#39;entrée du dispositif d&#39;homogénéisation à 0,5 LPM. Gardez le mélangeur en une seule étape (dans le HCT) sur à 3500 rpm. LOM sont formées à l&#39;interface des pales de rotor et les écrans d&#39;émulseur au sein de l&#39;homogénéisateur en ligne (figure 2). En quelques minutes, le liquide doit être visiblement plus visqueux. Une approche plus rigoureuse est de déterminer la viscosité en fonction du temps, ce qui peut être fait par prélèvement des aliquotes de Port 1 lors de la fabrication et de l&#39;analyse avec un viscosimètre. Remarque: si des bulles d&#39;air visibles sont présents dans le tube sortant du mélangeur, de l&#39;oxygèneiront à l&#39;homogénéisateur en ligne est trop élevé. Titrer bas débit de gaz jusqu&#39;à ce que le fluide est opaque et ne contient pas de bulles de gaz visibles. </li><li> Faire fonctionner le système pendant 15 min, puis éteignez l&#39;homogénéisation de cisaillement élevé et l&#39;entrée de l&#39;oxygène à elle. Continuez à faire fonctionner le mélangeur en une seule étape dans le HCT jusqu&#39;à l&#39;émulsion est supprimé; atténue cette séparation de phase et maintient le produit relativement uniforme à l&#39;intérieur de la HCT. Remarque: Le volume de l&#39;émulsion rempli de gaz devrait augmenter d&#39;environ 2 à 3 fois pendant la phase de série de la concentration. Si ce n&#39;est pas, vérifier pour s&#39;assurer que l&#39;oxygène s&#39;écoule dans l&#39;homogénéisateur à cisaillement élevé et que les concentrations de lipides dans l&#39;émulsion de précurseur sont corrects. Efficacité de la production diminue à mesure que diminue la concentration en lipides. </li></ol> 3. Collection, Concentration, l&#39;évaluation, et le stockage des OLM <ol><li> Attacher une stérile, modifié 140 ml luer-lock seringue au robinet d&#39;arrêt connecté au port de base n ° 1 sur le récipient de collecte. Dresser 100 ml de liquide. Fermer hermétiquement la seringue et répéter jusqu&#39;à ce que tout le liquide a été retiré. <ol><li> Modifier seringues en retirant 100 ml d&#39;air dans la seringue et scier l&#39;excédent piston et matériau de la seringue au-dessus de la marque de 140 ml alors. Remplissez et seringues vides en utilisant une pince à griffes de dresser le piston. Cette modification permet plus facile centrifugation. </li></ol></li><li> seringues à centrifuger avec la fin plafonné orientée vers le bas dans un réfrigérateur (4 ° C) seau centrifuger à 225 g pendant 10 min. </li><li> Trois couches de matériau apparaissent après centrifugation. Expulser la couche inférieure de l&#39;excès de phase aqueuse trouble et jeter. La seconde couche est blanc lumineux et contient OLM concentrés. Transférer la mousse concentrée pour une seringue étanche aux gaz au moyen d&#39;un robinet à trois voies pour empêcher la contamination du gaz ambiant. Jeter la couche finale, qui contient de l&#39;oxygène libre de LOM rompus. </li><li> la qualité de la mousse peut être évaluée en atteignant ≥ 90% de gaz de la mousse concentré. Calculmangé concentration de gaz de la manière suivante: Gaz =% en volume [(poids de la mousse / volume de mousse) - 1] x 100 <ol><li> A titre de témoin seconde qualité, de la taille des microbulles par obscurcissement de lumière afin de déterminer si la taille des particules est comprise dans la plage attendue. Il est à noter que le changement dans le temps d&#39;homogénéisation ou de la formulation peut modifier la taille des bulles. </li></ol></li><li> Fermer hermétiquement la seringue en verre avec un ajustement luer-lock. OLM concentrés peuvent être dilués avec de Plasma-Lyte A au moment de l&#39;utilisation. Les seringues peuvent être stockés à 22, 4, ou -20 ° C; des températures plus froides peuvent fournir une meilleure stabilité durée de vie 7. </li></ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaled-Up+Production+of+Monodisperse,+Dual+Layer+Microbubbles+Using+Multi-Array+Microfluidic+Module+for+Medical+Imaging+and+Drug+Delivery.">Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).</li><li>Szijjarto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Perfluorocarbon+Gases+on+the+Size+and+Stability+Characteristics+of+Phospholipid-Coated+Microbubbles:+Osmotic+Effect+versus+Interfacial+Film+Stabilization.">Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization.</a> Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).</li><li>Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid-Stabilized+Microbubble+Foam+for+Injectable+Oxygen+Delivery.">Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery.</a> Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).</li><li>Kv&#229;le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+fractionation+of+gas-filled+microspheres+by+flotation.">Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation.</a> Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).</li><li>Dressaire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+polygonal+nanopatterning+of+stable+microbubbles.">Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles.</a> Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).</li><li>Kheir, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Manufacture+of+Concentrated+Oxygen+Gas-Filled+Microparticles+for+Intravenous+Oxygen+Delivery.">Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. , (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les étapes les plus importantes à la création concentrés OLM, très oxygénés comprennent: 1) veiller à ce que l&#39;espace libre dans le HCT reste entièrement oxygéné; 2) veiller à ce que la pureté des excipients lipidiques est optimal (y compris les conditions de stockage et d&#39;utilisation des produits BPF); 3) faire en sorte que les lipides en poudre se mélangent complètement avec la phase aqueuse avant l&#39;amorçage du système; et 4) portant une attention particulière à l&#39;augmentation de la ...

Microbulles composés de protéines, de polymère, et des obus de lipides ont été développés en tant que vecteurs pour l&#39;administration de médicaments, la thérapie génique et les agents de contraste ultrasonores 1-5. Parce que ces utilisations thérapeutiques nécessitent persistance microbulles intravasculaire, ces microbulles sont généralement remplis de gaz moléculaire, de poids élevés inertes tels que les hydrocarbures perfluorés 6, qui ont une faible solubilité dans le sang et stabilisent le 3,4 bulle. Récemment, des microbulles d&#39;oxygène à base de lipides (OLM) ont été conçus pour administrer des doses thérapeutiques de l&#39;oxygène, ce qui peut préserver l&#39;apport d&#39;oxygène aux organes cibles et prévenir l&#39;instabilité hémodynamique pendant les périodes d&#39;obstruction des voies respiratoires ou hypoxémie 7. Émulsions conçus pour la livraison de gaz par voie intraveineuse ont besoin de différents éléments de conception que ceux utilisés pour les agents de contraste ultrasonores ou administration ciblée des médicaments. En premier lieu, parce que le corps consomme de grandes quantités de gaz d&#39;oxygène (~ 200 ml / min), OLM doivent être produites etinjecté sur une grande échelle. Il faut pour cela que le procédé de fabrication soit efficace. Deuxièmement, le processus de fabrication doit être en boucle fermée afin d&#39;éviter la contamination de l&#39;azote à travers l&#39;exposition de LOM (qui doit être rempli avec 100% d&#39;oxygène) à l&#39;air ambiant. Troisièmement, parce que le but de LOM est la livraison de gaz par voie intraveineuse, la fraction de gaz de LOM doit être maximisée, en reconnaissant les limites imposées par la viscosité de l&#39;émulsion 7. Enfin, comme avec n&#39;importe quel injectable par voie intraveineuse, un contrôle précis de la distribution de taille des particules est indispensable pour éviter l&#39;obstruction microvasculaire 8. Il existe plusieurs méthodes établies pour la fabrication de micro-bulles. La sonication utilise une grande intensité, à basse fréquence ultrasonore appliquée à l&#39;interface air-liquide d&#39;une émulsion qui comprend un agent tensio-actif, tel qu&#39;un phospholipide amphipathique, en présence d&#39;un ciel gazeux pour produire des microbulles 7,9. Ce processus peut être commandé en faisant varier ultrala fréquence du son, la puissance et la durée d&#39;impulsion, et la distribution de la taille résultante peuvent être adaptées pour produire des micro-bulles d&#39;une distribution de taille spécifique, bien que la sonication est rarement utilisé dans la fabrication de micro-bulles cliniquement utilisés. Fusion est l&#39;agitation mécanique intense d&#39;un tensioactif et de gaz dans un système fermé, qui est également difficile à l&#39;échelle en place pour accueillir de grands volumes 2. Microfluidique à base de gouttelettes permet un contrôle précis de la distribution de taille des microbulles de 10 à 13. Bien que traditionnellement difficile d&#39;extrapoler, multi-canal, la microfluidique à haut débit ont été décrits qui augmentent l&#39;efficacité de la production de microbulles 13. Microbulles fabriqués en utilisant une de ces méthodes peuvent nécessiter des processus de réduction de la taille de post-production, telles que le fractionnement centrifuge 14,15 et 16,17 microbulles flottation. Une autre méthode connue pour la fabrication de micro-bulles très stables au cisaillement est homogenization 6, ce qui peut se traduire par un motif hexagonal de phospholipide stabilisateur sur la surface à microbulles 18. S&#39;appuyant sur ​​ce concept, nous décrivons l&#39;incorporation d&#39;un cisaillement élevé homogénéisateur en ligne pour créer OLM d&#39;auto-assemblage 19. Dans ce processus, l&#39;homogénéisation utilise des lames en rotation rapide à proximité de deux beaux écrans maille émulseur, créant un fort cisaillement mécanique et hydraulique pour la création de micro-bulles. Concentration de série de l&#39;émulsion lipidique à travers ce système produit une fraction de gaz de plus en plus concentrées, qui peuvent être encore plus concentré par centrifugation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:405px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td>
			<td style="width:141px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770365</td>
			<td>Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:141px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C75209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plasma-Lyte A</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">80089-818</td>
			<td>Alternatively can use NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Glass collection vessel</td>
			<td style="width:141px;">Specialty Glass, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gas composition (oxygen) monitor</td>
			<td style="width:141px;">Precision Medical</td>
			<td style="width:119px;">PM5900L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sarns 8000 roller pump</td>
			<td style="width:141px;">Calicut Medical</td>
			<td style="width:119px;">16407</td>
			<td>Part of a modular perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">BIOtherm Heat Exchanger</td>
			<td style="width:141px;">Medtronic</td>
			<td style="width:119px;">ECMOtherm-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Verso laboratory in-line mixer</td>
			<td style="width:141px;">Silverson Machines, Inc</td>
			<td style="width:119px;">TH-IL-102-VERSO</td>
			<td>Use multistage workheads and front-end extension with T piece</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">T-piece for Silverson Verso inlet port</td>
			<td style="width:141px;">Process Innovations</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">L5M-A laboratory mixer</td>
			<td style="width:141px;">Silverson Machines, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NC0136483</td>
			<td>Use mesh emulsor screen (fine)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Rochester-Ochsner toothed forceps</td>
			<td style="width:141px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-812-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">140 mL syringe</td>
			<td style="width:141px;">Kendall Healthcare Monoject&#160;</td>
			<td style="width:119px;">8881114030</td>
			<td>Ensure there is a luer lock.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IX71 Inverted light microscope</td>
			<td style="width:141px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Retiga-2000R microscope camera</td>
			<td style="width:141px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;">RET-2000R-F-M-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Accusizer 780A Autodilution</td>
			<td style="width:141px;">PSS-NICOMP Particle Sizing Systems</td>
			<td style="width:119px;">Out of production</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacture of concentrated, lipid-based oxygen microbubble emulsions by high shear homogenization and serial concentration

microbulles remplies de gaz ont été mis au point en tant que contraste ultrasonore et des agents de libération de médicaments. Les microbulles peuvent être produits par traitement à l&#39;aide des tensioactifs sonication, une agitation mécanique, des dispositifs microfluidiques, ou l&#39;homogénéisation. Récemment, des microbulles d&#39;oxygène à base de lipides (OLM) ont été conçus pour fournir de l&#39;oxygène par voie intraveineuse en cas d&#39;urgence médicale, inversant hypoxémie de la vie en danger, et de prévenir tout dommage ultérieur d&#39;organes, l&#39;arrêt cardiaque et la mort. Nous présentons les méthodes pour la production à l&#39;échelle-up de microbulles hautement oxygénées à l&#39;aide d&#39;une boucle fermée à cisaillement élevé d&#39;homogénéisation. Le processus peut produire 2 L de LOM concentrées (90% en volume) en 90 min. Les bulles résultantes ont un diamètre moyen d&#39;environ 2 pm, et un profil rhéologique conforme à celle du sang lorsqu&#39;il est dilué à 60% en volume. Cette technique produit OLM à haute capacité et à haute pureté de l&#39;oxygène, ce qui suggère que cette technique peut être utile pour les laboratoires de recherche translationnelle.

Homogénéisation à cisaillement élevé permet la production efficace (c&#39;est à dire dans un après-midi) de LOM suffisantes pour une étude sur l&#39;animal et ne nécessite pas de compétences techniques. Une fois compétent, jusqu&#39;à 2 litres de concentré OLM peut être fabriqué en 90 min. taille de microbulles et de la morphologie a été évaluée par microscopie optique et par obscurcissement. Quand un échantillon de 10 pi de OLM a été visualisé, OLM sphérique...

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Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Nous décrivons des procédés pour la fabrication de grandes quantités de micro-bulles d&#39;oxygène à base de lipides (OLM) conçus pour la délivrance par voie intraveineuse de l&#39;oxygène en utilisant une homogénéisation à cisaillement élevé et la concentration en série.

Fabrication de concentré, de l&#39;oxygène à base de lipides microbulles émulsions par cisaillement élevé homogénéisation et la concentration de série

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K vues.  Harvard Medical School.  Nous décrivons des procédés pour la fabrication de grandes quantités de micro-bulles d'oxygène à base de lipides (OLM) conçus pour la délivrance par voie intraveineuse de l'oxygène en utilisant une homogénéisation à cisaillement élevé et la concentration en série. 

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Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

Introduction à l&#39;échographie destruction des microbulles ciblées Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Recherche

Bio-ingénierie

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

Caractéristiques des précipitations formées polyéthylène Microgels glycol sont commandés par le poids moléculaire des réactifs

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

Génération de cisaillement d&#39;adhésion Carte Utilisation SynVivo réseaux microvasculaires synthétique

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Synthèse de l&#39;or nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Fabrication and Drug Delivery Applications de soie Nanoparticules

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for electrical conduction between cardiomyocytes. The current method for quantifying this space by manual segmentation is slow and has low spatial resolution.We developed an algorithm that uses serial image dilations of a binary outline to count the number of pixels between two opposing 2 dimensional edges.This algorithm requires fewer man hours and has a higher spatial resolution than the manual method while preserving the reproducibility of the manual process.In fact, experienced and novice investigators were able to recapitulate the results of a previous study with this new algorithm.The algorithm is limited by the human input needed to manually outline the perinexus and computational power mainly encumbered by a pre-existing pathfinding algorithm.However, the algorithm&#39;s high-throughput capabilities, high spatial resolution and reproducibility make it a versatile and robust measurement tool for use across a variety of applications requiring the measurement of the distance between any 2-dimensional (2D) edges.

The purpose of this algorithm is to continuously measure the distance between two 2-dimensional edges using serial image dilations and pathfinding. This algorithm can be applied to a variety of fields such as cardiac structural biology, vascular biology, and civil engineering.

Quantification des Distances intermembranaire avec Serial Image dilatations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Nettoyage catalytique de plante oxygénées espèces In Vivo par des nanoparticules d’oxyde de cérium anioniques

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to nanomolar ranges, several orders of magnitude less than many physiological ligand concentrations. Optical nanostructures called zero mode waveguides (ZMWs), which are 100&#8722;200 nm in diameter apertures fabricated in a thin conducting metal such as aluminum or gold, allow imaging of individual molecules at micromolar concentrations of fluorophores by confining visible light excitation to zeptoliter effective volumes. However, the need for expensive and specialized nanofabrication equipment has precluded the widespread use of ZMWs. Typically, nanostructures such as ZMWs are obtained by direct writing using electron beam lithography, which is sequential and slow. Here, colloidal, or nanosphere, lithography is used as an alternative strategy to create nanometer-scale masks for waveguide fabrication. This report describes the approach in detail, with practical considerations for each phase. The method allows thousands of aluminum or gold ZMWs to be made in parallel, with final waveguide diameters and depths of 100&#8722;200 nm. Only common lab equipment and a thermal evaporator for metal deposition are required. By making ZMWs more accessible to the biochemical community, this method can facilitate the study of molecular processes at cellular concentrations and rates.

Described here is a nanosphere lithography method for parallel fabrication of zero mode waveguides, which are arrays of nanoapertures in a metal-clad glass microscopy coverslip for single molecule imaging at nano- to micromolar concentrations of fluorophores. The method takes advantage of colloidal crystal self-assembly to create a waveguide template.

Fabrication de guides d’ondes en mode zéro pour la microscopie à molécule unique à haute concentration

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...