Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention de la combinaison études national de recherches néerlandais, Catalyse contrôlée par le design des produits chimiques (NRSC-catalyse) de la recherche. Dr HY Steensma et le Dr van Heusden GPH de l&#39;Université de Leiden sont reconnus pour leur soutien à l&#39;expression recombinante de S. cerevisiae Nar1.

1. Préparation de l&#39;installation et Solutions <ol><li> Préparer la solution tampon contenant 100 mM de Tris, 250 mM de NaCl et 10% de glycerol à pH 8,5. Purger le tampon par rinçage avec de l&#39;argon. Introduire le tampon dans une chambre anaérobie. </li><li> Diviser le tampon en deux portions. Pour une partie (tampon A) ajouter 1 mM de DL-dithiothréitol (DTT, M 154,25 g / mol) et 1 mM de L-cystéine. L&#39;autre partie (tampon B) ne contient pas d&#39;agents de réduction. </li><li> Préparer des solutions oxydantes et de réducteur. Ajouter 1 ml de solution de 2, 20 et 200 mM de ferricyanure de potassium (FIC, M 329,26 g / mol) et de dithionite de sodium (SD, M 174,11 g / mol) dans du tampon B. anaérobie </li><li> Préparer médiateur mélange comme suit: <ol><li> Ajouter 160 uM de chacun des médiateurs redox suivants et 50 mM de NaCl au tampon B: N, N, N &#39;, N&#39; tétraméthyl-p-phenylendediamine (TMPD, M 237,17 g / mol, E &#39;0 0,276 V) , 2,6-dichloro indophénol(DCIP, M 290,08 g / mol, E &#39;0 0,217 V), l&#39;éthosulfate de phénazine (PSE, M r 334,4 g / mol, E&#39; 0 0,055 V), bleu de méthylène (M r 319,85 g / mol, E &#39; 0,011 0 V), résorufine (M r 235,17 g / mol, E &#39;0 -0,051 V), Indigodisulphonate (M r 466,35 g / mol, E&#39; 0 -0,125 V), le 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone ( M r 174,15 g / mol, E &#39;0 -0,145 V), d&#39;anthraquinone-2-sulfonate (M r 328,28 g / mol, E&#39; 0 -0,225 V), phénosafranine (M r 322,8 g / mol, E &#39;0 -0,252 V), la safranine O (M r 350,84 g / mol, E &#39;0 -0,280 V), rouge neutre (M r 288,8 g / mol, E&#39; 0 -0,340 V), benzyl viologène (M r 409,4 g / mol, E &#39;0 -0,350 V), et viologène de méthyle (M r 257,16 g / mol, E&#39; 0 -0,440 V). </li><li> Envelopper la bouteille dans une feuille d&#39;aluminium pour protéger le médiateurs de la lumière. </li></ol></li><li> Préparer 10 mg / ml S. cerevisiae des protéines Nar1 angine marqués (181 uM, M r 55,2 kDa) dans le tampon A. express S. cerevisiae Nar1 dans E. coli en tant que protéine streptococcique marqués en utilisant un vecteur d&#39;expression pET24a. Purifier la protéine dans une chambre anaérobie utilisant des milieux de chromatographie de Strep-Tactin (IBA) et on purifie en utilisant un système de purification de protéine comme purificateur Akta (GE Healthcare). </li><li> Préparer la configuration redox de titrage dans une chambre anaérobie comme suit: <ol><li> Raccorder une électrode de référence Ag / AgCl et une électrode en fil de platine dans le récipient de titrage. Reliez les deux électrodes à un voltmètre qui peut mesurer des mV jusqu&#39;à V. </li><li> Insérez un petit barreau d&#39;agitation. </li><li> Placer le récipient de titrage ci-dessus d&#39;un agitateur magnétique. </li><li> Remplir le récipient de titrage avec du tampon B, médiateur solution de mélange et la solution de protéine à jusqu&#39;à 2 ml, ce est à dire à des concentrations finales de protéine de 72 uM et 38 uM de chaquemédiateur. Remarque: en fonction de la concentration en protéine et le médiateur requis concentrations les quantités des trois solutions doit être ajusté. </li><li> Agiter pendant 30 min et basculer sur le voltmètre. </li></ol></li><li> Préparer 10 propres tubes quartz EPR de verre. Introduire les tubes dans la chambre anaérobie. </li><li> Remplir un petit (environ 200 ml) de Dewar d&#39;azote liquide à l&#39;azote liquide. </li></ol> 2. Effectuez titrage redox <ol><li> Attendez jusqu&#39;à ce que le potentiel de la solution est stable. Note: Dans la pratique, cela signifie que le potentiel dérive inférieure à 1 mV par minute. </li><li> Notez le potentiel donné par le voltmètre. </li><li> Dessinez le premier échantillon de 200 pi et les injecter dans un tube EPR. </li><li> Boucher le tube avec un bouchon en caoutchouc et retirer le tube de la chambre anaérobie. </li><li> Congeler le tube dans l&#39;azote liquide comme suit: Attention! Ceci doit être fait lentement, sinon le tube va se rompre. <ol><li> Insérez d&#39;abord le tip du tube dans l&#39;azote liquide. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce qu&#39;un sifflement se fait entendre. Remarque: Cela peut prendre jusqu&#39;à 10 secondes. </li><li> Introduire lentement le reste du tube de telle sorte que la partie d&#39;échantillon est complètement immergé. </li></ol></li><li> Ajouter une petite aliquote de 1 à 2 pi de la solution 2 mM SD à la solution dans le récipient de titrage pour abaisser le potentiel de la solution à -0,6 V. Note: Si plus de 10 pi doit être ajoutée, passer à la solution 20 mM. Comme il est très difficile de Poise à une valeur potentielle spécifique, les valeurs réelles enregistrées sur le voltmètre sont écrites et utilisées pour construire la courbe de titrage. </li><li> Dessinez un échantillon tel que décrit dans l&#39;étape 2.3 à 2.5. </li><li> Notez le potentiel réel donné par le voltmètre. </li><li> Ajouter oxydant jusqu&#39;à ce que le potentiel a augmenté de circa 50 mV. Commencer par addition d&#39;une petite quantité aliquote de 1 à 2 pi de la solution 2 mM FIC. Si plus de 10 pi doit être ajoutée, passer à la solution 20 mM. </li><li> Notez how beaucoup des solutions a été ajoutée. Remarque: ce est nécessaire de corriger la dilution de l&#39;échantillon au cours du titrage. </li><li> Dessinez un échantillon tel que décrit dans les étapes 2.3 à 2.5. </li><li> Notez le potentiel réel donné par le voltmètre. </li><li> Répétez les étapes 2,9 et 2,12 jusqu&#39;à ce que la gamme de potentiel de -0,6 V à 0,2 V a été couvert et tous les 10 tubes EPR sont remplis chacun avec 200 pi. Remarque: Comme le volume avec chaque retrait est réduit le positionnement des électrodes peut être nécessaire d&#39;ajuster avoir un bon contact avec la solution, sans ingérence de l&#39;agitation. Il peut être difficile de mesurer le potentiel après retrait du dernier échantillon et donc le potentiel de cet échantillon peut être moins précise. </li><li> Eventuellement, stocker les échantillons congelés EPR dans l&#39;azote liquide jusqu&#39;à ce que les mesures EPR peuvent avoir lieu. </li></ol> 3. mesurer des échantillons de titration à l&#39;aide EPR Spectroscopie et analyse des données <ol><li> EPR spectres rendu de la différenteéchantillons de titrage comme suit: <ol><li> Utilisation d&#39;une pompe à vide poussé pour évacuer un cryostat à quartz à &lt;10 -5 bar. </li><li> Mettre sur le refroidissement de l&#39;eau de l&#39;aimant EPR. Ouvrez le débit d&#39;air sec à travers la cavité EPR. </li><li> Allumez l&#39;alimentation de l&#39;aimant et l&#39;ordinateur de l&#39;EPR. </li><li> Exécuter un programme d&#39;étalonnage de fréquence. Définissez les paramètres de mesure EPR. Branchez le cryostat à l&#39;hélium liquide Dewar. Refroidir la cavité pour 9-16 K. </li><li> Présentez l&#39;échantillon EPR dans la cavité. Relever le spectre EPR. </li></ol></li><li> Identifier les différentes espèces EPR et d&#39;utiliser le meilleur spectres de quantifier les signaux. Atteindre EPR quantification par double intégration des spectres et comparatif avec le spectre d&#39;un cuivre externe solution standard mM CuSO 10 HCl 4/10 mM / 2 M NaClO 4. 8 </li><li> Faire la courbe de titrage comme suit: <ol><li> Tracer l&#39;amplitude du signal EPR à un g-valeur qui est caractéristique de la paramagnétiques espèces d&#39;intérêt par rapport au potentiel. </li><li> Changez l&#39;échelle de l&#39;amplitude du signal EPR à un spins / échelle de la molécule en utilisant la quantification EPR de l&#39;étape 3.2. </li><li> Corriger l&#39;amplitude du signal de chaque échantillon pour la dilution qui se est produit en raison des additions d&#39;oxydant ou un agent réducteur. </li><li> Corriger le potentiel du potentiel de l&#39;électrode point médian de référence Ag / AgCl. Remarque: L&#39;électrode de référence Ag / AgCl (saturé avec KCl) a un potentiel médian de 0,194 V par rapport à l&#39;électrode d&#39;hydrogène standard (SHE) à 25 ° C. Par conséquent, si le potentiel sur le voltmètre indique environ -0,6 V, le potentiel par rapport à la SHE est -0,4 V. </li></ol></li><li> Monter le signal à l&#39;équation de Nernst comme suit: Pour une espèce qui est paramagnétique dans l&#39;état réduit: <img alt="Equation 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq1.jpg" width="200" /> Pour une espèce paramagnétique dans l&#39;oEtat xidized: <img alt="Equation 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq2.jpg" width="200" /> Pour une espèce qui est paramagnétique dans un état intermédiaire: <img alt="Équation 3" fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq3.jpg" width="220" /> Ces équations sont valables pour des réactions d&#39;oxydoréduction dans laquelle un électron est transféré, alors n = 1. E = potentiel en Volts E m = potentiel milieu en Volt F = constante de Faraday = 96480 C · mol -1 R = constante des gaz = 8,314 J · K -1 · mol -1 T = Température en Kelvin </li></ol>

<ol>
	<li>Lippard, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).</li><li>Bertini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).</li><li>Leger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+Electrokinetics:+Using+Protein+Film+Voltammetry+To+Investigate+Redox+Enzymes+and+Their+Mechanisms.">Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms.</a> Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).</li><li>Hagen, W. 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J., Muhlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hydrogenase-like+Nar1p+is+Essential+for+Maturation+of+Cytosolic+and+Nuclear+Iron-Sulphur+Proteins.">The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins.</a> EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).</li><li>Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Iron-Sulfur+Cluster+Assembly+(CIA)+System:+Factors,+Mechanism,+and+Relevance+to+Cellular+Iron+Regulation.">Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation.</a> J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).</li><li>Aasa, R., V&#228;nng&#229;rd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+Signal+Intensity+and+Powder+Shapes.">EPR Signal Intensity and Powder Shapes.</a> A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., M&#252;hlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nar1p,+a+conserved+eukaryotic+protein+with+similarity+to+Fe-only+hydrogenases,+functions+in+cytosolic+iron-sulphur+protein+biogenesis.">Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis.</a> Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).</li><li>Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferene+-+a+new+spectrophotometric+reagent+for+iron.">Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron.</a> Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).</li><li>Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarase+A+from+Escherichia+coli:+purification+and+characterization+as+an+iron-sulfur+cluster+containing+enzyme.">Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme.</a> Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).</li><li>Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch, ., Landa, I., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+Redox+Chemistry:+a+Re-evaluation.">Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation.</a> FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).</li><li>Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+relative+contributions+of+redox+and+steric+issues+to+laccase+specificity+towards+putative+substrates.">An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates.</a> Organic &amp; biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

La série de 13 médiateurs redox permet un équilibre redox dans la solution dans la gamme de -0,45 à 0,3 V par rapport à SHE (tableau 1 et figure 3). Bien au-dessus et en dessous de ces potentiels tous les médiateurs sont soit complètement réduits ou complètement oxydés et donc pas davantage l&#39;équilibre redox avec les centres actifs de la protéine peuvent se produire. Ce est une notion importante, car parfois dans la littérature titrages redox sont effectuées avec seule...

Il est frappant de constater que les procédés chimiques les plus fondamentaux maintien de la vie sur cette planète, la photosynthèse, fixation de l&#39;azote et de la respiration, sont catalysées par de grands complexes de protéines contenant un large éventail de cofacteurs redox organiques et inorganiques. Il a été estimé qu&#39;environ 30% de toutes les protéines contiennent un ou plusieurs cofacteurs métalliques. 1,2 Identifier et caractériser les cofacteurs redox peuvent être établies par électrochimie directe (par exemple, le film protéines voltamétrie) ou titrages redox. Les deux techniques sont complémentaires dans leur nature et leur applicabilité. Voltampérométrie propose détermination rapide du potentiel du point milieu et de la cinétique de transfert d&#39;électrons de cofacteurs qui peuvent réagir avec une surface d&#39;électrode. 3,4 Habituellement, cela fonctionne bien pour des protéines de transfert d&#39;électrons, tels que le cytochrome c ou ferrédoxine. Et il fonctionne parfois pour des protéines plus complexes qui ont été immobilisés sur une surface d&#39;électrode. La connaissance détaillée de lanature des cofacteurs dans la protéine doit être disponible, comme le voltamogramme ne donnera aucune information directe sur l&#39;identité du cofacteur. Titrages redox sont plus laborieux à exécuter et exigent des quantités mg de protéine. Toutefois, ils fournissent des informations sur le potentiel point médian et l&#39;identité du cofacteur. 5 En outre, dans un seul titrage plusieurs cofacteurs dans une protéine peuvent être contrôlées. Le principe d&#39;un titrage redox est que la protéine active redox ou une enzyme est chimiquement réduite ou oxydée. Afin de se assurer que les cofacteurs réagissent avec les médiateurs réducteur ou oxydant redox sont utilisés. Ces médiateurs redox réagissent également avec une électrode de sorte que le potentiel de la solution peut être mesurée. Les médiateurs agissent comme un tampon redox et se équilibrent entre les cofacteurs dans la protéine et l&#39;électrode. Après chimiquement brandissant le potentiel à la valeur désirée, un échantillon est prélevé et rapidement congelés dans de l&#39;azote liquide à AWAit une analyse plus approfondie des techniques spectroscopiques. Spectroscopie RPE est particulièrement utile à cet égard car il peut être utilisé pour mesurer quantitativement centres métalliques paramagnétiques ou des radicaux organiques. Le titrage redox peut être effectué dans deux directions: de bas en haut ou de haut en bas potentiel milieu. Le choix dépend de la stabilité des cofacteurs l&#39;étude. Souvent, il est sage de commencer à faible potentiel et ajouter oxydant par paliers successifs à augmenter le potentiel. Cela se appelle un titrage oxydatif et est décrite ici. Ici, nous montrons le titrage redox de l&#39;amas fer-soufre contenant des protéines Nar1 de Saccharomyces cerevisiae. Cette protéine est impliquée, probablement une protéine d&#39;échafaudage, dans le cytosolique fer-soufre pôle biosynthétique machines (CIA voie). 6,7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference electrode (Ag/AgCl)</td>
			<td style="width:101px;">Radiometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EPR spectrometer</td>
			<td style="width:101px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) &#183;(HCl)2</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">637-01-4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">620-45-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenazine ethosulfate (PES)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">10510-77-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">122965-43-9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resorufin, sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">34994-50-8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Indigodisulfonate (indigo carmine)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">860-22-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-hydroxy-1,4-naphtaquinone</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">83-72-7</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">153277-35-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenosafranin</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">81-93-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safranin O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">477-73-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral red</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">553-24-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1102-19-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1910-42-5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epr monitored redox titration of the cofactors of saccharomyces cerevisiae nar1

Résonance paramagnétique électronique (RPE) surveillée titrages redox sont une méthode puissante pour déterminer le potentiel milieu de cofacteurs dans les protéines et d&#39;identifier et de quantifier les cofacteurs dans leur état redox détectable. La technique est complémentaire de l&#39;électrochimie directe (voltamétrie) approche, car il ne offre pas d&#39;informations sur les taux de transfert d&#39;électrons, mais ne établit l&#39;état des cofacteurs redox identité et dans la protéine à l&#39;étude. La technique est largement applicable à ne importe quelle protéine contenant une résonance paramagnétique électronique (RPE) cofacteur détectable. Un titrage typique nécessite 2 ml avec une concentration de protéine du cofacteur dans la plage de 1 à 100 uM. La protéine est titré avec un réducteur chimique (dithionite de sodium) ou l&#39;oxydant (ferricyanure de potassium) pour poises l&#39;échantillon à un certain potentiel. Un fil de platine et une électrode de référence Ag / AgCl sont reliés à un voltmètre pour mesurer le potentiel de la solution de protéine. Un ensemble de 13 médiateurs redox différentes est utilisé pour équilibrer entre les cofacteurs redox de la protéine et les électrodes. Les échantillons sont prélevés à différents potentiels et les spectres résonance paramagnétique électronique, caractéristiques pour les différents cofacteurs redox dans la protéine, sont mesurés. Le tracé de l&#39;intensité du signal par rapport au potentiel de l&#39;échantillon est analysée en utilisant l&#39;équation de Nernst, afin de déterminer le potentiel du point milieu cofacteur.

Le titrage redox du cluster fer-soufre contenant des protéines Nar1 de Saccharomyces cerevisiae a abouti à l&#39;identification de trois cofacteurs différents: Nar1: une grappe [3FE-4S], un centre [4Fe-4S] et un mononucléaires centre Fe (Figure 1) . Les signaux EPR sont caractérisés par leurs valeurs de g: pour la [3FE-4S] + g z 2,01, 2,00 g croisé (figure 1B); pour la [4Fe-4S] +, z g 2,02 g 1,93 y, x 1,82...

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EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR surveillé Redox titrage des cofacteurs de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

epr-monitored-redox-titration-cofactors-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

13.4K vues.  Delft University of Technology. The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

Vidéo: EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Recherche

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purification de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire protéine exprimée dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.