Ce travail a été soutenu par le NIH R01 GM50322 à PM Kane. Les auteurs remercient le Dr Rajini Rao, de l&#39;Université Johns Hopkins de fournir les levures pHluorin plasmides et des conseils sur les mesures de pH ratiométriques, et le Dr Gloria A. Martinez Munoz pour travailler sur ces protocoles pour notre laboratoire.

1. Mesure du pH Vacuolar in vivo en utilisant BCECF-AM <ol><li> Cultiver une culture liquide de 50 ml de la souche de levure à mesurer dans le milieu souhaité pendant une nuit. L&#39;objectif est d&#39;avoir des cellules en phase mi-log (DO600 (densité optique à 600 nm) d&#39;environ 0,8 pour la suspension). </li><li> Pellet les cellules de levure par centrifugation. Reprendre le culot dans 0,6 ml de milieu de croissance et la transférer dans un tube de centrifugation qui a été pesé antérieurement. Pellet les cellules à nouveau dans un centrifuger à 2000 g pendant 60 sec. Eliminer le surnageant aussi complètement que possible, puis peser le culot cellulaire. Reprendre le culot à une densité finale de 0,5 g / ml (p / v), une culture de ce volume va donner un culot cellulaire d&#39;environ 200 mg, et 200 pi de tampon seraient ajoutés pour donner un volume final de 400 pl. </li><li> Ajouter BCECF-AM à la suspension de cellules à une concentration finale de 50 mM à partir d&#39;un stock 12 mM préparée dans du DMSO. Bien mélanger puis incUbate les cellules à 30 ° C pendant 30 min. sur une plate-forme à bascule ou le tambour du rouleau. </li><li> Alors que les cellules sont en incubation, préparer des tampons d&#39;étalonnage. Le tampon d&#39;étalonnage contient 50 mM de MES (2 - (N-morpholino) éthanesulfonique), 50 mM de HEPES (4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique acide), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M d&#39;acétate d&#39;ammonium, 10 mM d&#39;azoture de sodium, et 10 mM de 2-désoxyglucose, et est ajusté au pH valeurs appropriées pour votre gamme d&#39;étalonnage avec NaOH ou HCl. (Attention: L&#39;azoture de sodium est très toxique et doit être manipulé avec soin.) Pour la mesure du pH dans les cellules de type sauvage, nous serions préparer plusieurs mélanges d&#39;étalonnage à pH 5,5 à 6,5, mais pour les mutants devraient avoir un pH vacuolaire plus alcaline ( mutants EGV), nous préparer supplémentaires, des tampons de pH plus élevés. </li><li> Aliquote de 2 ml de tampon d&#39;étalonnage pour chaque pH dans tubes coniques de 15 ml et ajouter monensin (Stock 15 mm) et nigéricine (Stock 2 mM) pour donner des concentrations finales de 110 pm monensin et 15 pm nigéricine, respectively. Mélangez bien sur un vortex. (Attention: les deux monensin et nigéricine sont toxiques et doivent être manipulés avec précaution.) </li><li> Lorsque la durée d&#39;incubation BCECF-AM est terminée, pellet la suspension cellulaire par centrifugation pendant 30 sec à 2000 xg dans une microcentrifugeuse. Resuspendre les cellules est de 1 ml de milieu de croissance dépourvu de glucose et centrifugeuse comme ci-dessus. Répétez cette étape de lavage une fois, puis remettre le culot dans 200 ul de milieu de croissance sans glucose. La place sur la glace. </li><li> Ajouter 20 ul de la suspension cellulaire dans chaque tube d&#39;étalonnage du pH préparé ci-dessus. Incuber à 30 ° C pendant 30-60 min. sur un tambour de rouleau. </li><li> Réglez le fluorimètre pour mesurer en alternance à des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation 450 nm et 490 nm, à la fois avec une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 535 nm. Réglez la température de la chambre de l&#39;échantillon à 30 ° C. Effectuer toutes les mesures avec une agitation continue du mélange dans la cuvette. </li><li> Ajouter 1,96 ml de 1 mM de MES (ajusté à pH 5 ou 7, selon le pH du milieu de culture des cellules d&#39;une le design expérimental). Ajouter 20 pl de suspension cellulaire dans la cuvette. Initier des mesures de fluorescence. Nous recueillons aussi des données temporelles ponctuelles dans différentes expériences de cinétique et continue. Pour les données cinétiques continues, nous prenons des mesures toutes les 6 sec pendant 5 min, puis ajouter le glucose à une concentration de glucose finale de 50 mM, et continuer mesure pendant 5-10 min. Pour des mesures de temps seul point, nous prenons des mesures généralement à 1 et 5 min. après addition de cellules dans la cuvette, ajouter le glucose comme dans les mesures cinétiques, puis une autre mesure 5 min. après l&#39;addition de glucose. Ces ajouts peuvent être variés, et des composants supplémentaires (inhibiteurs, etc) peuvent également être ajoutés. </li><li> Après les mesures expérimentales sont terminées, retirez les tubes d&#39;étalonnage à partir de la 30 ° C incubation et de transférer la totalité du volume de 2 ml pour chaque dans la cuvette de fluorimètre. Mesurer la fluorescence avec les mêmes paramètres (voir 1.8) toutes les 5 sec sur un total de 30 secondes pour chaque échantillon. </li><li>Exporter des données de fluorescence à Microsoft Excel. (Pour notre fluorimètre, ce qui nécessite l&#39;exportation des données sous forme de texte sous forme délimité par des tabulations et l&#39;importation dans Excel.) D&#39;obtenir une courbe d&#39;étalonnage en calculant le ratio de fluorescence à 490 nm à 450 nm pour chaque mélange d&#39;étalonnage. Le rapport de fluorescence est ensuite tracée en fonction du pH pour obtenir une courbe d&#39;étalonnage. </li><li> Convertir les données expérimentales de rapport de fluorescence et de calculer le pH à l&#39;aide de la courbe standard. PH vacuolaire peut alors en fonction du temps (cinétique de changements de pH) ou par rapport sous diverses conditions (Figure 1) ou dans différentes souches mutantes. </li></ol> 2. Mesure du pH cytosolique in vivo en utilisant pHluorin de levure <ol><li> Transformer la souche de levure souhaitée avec la pHluorin de plasmide de levure par des protocoles standard, et sélectionner les transformants sur un minimum sans uracile de milieu supplémenté (SC-uracile). </li><li> Cultiver une culture liquide de 50 ml de cellules transformées dans SC-uracile à la phase mi-log (OD <sub&gt; 600 = 0,8 ou plus bas). </li><li> Préparer des normes d&#39;étalonnage comme décrit pour le pH vacuolaire, mais tampon à une plage de pH appropriée pour la mesure du pH cytosolique, généralement pH 8.6. Aliquote de 2 ml de solution d&#39;étalonnage ajusté au pH désiré dans plusieurs tubes coniques de 15 ml. Ajouter monensin et nigéricine comme décrit ci-dessus (1.4) et bien mélanger. </li><li> Récolter les cellules par centrifugation comme décrit ci-dessus, et remettre le culot dans 600 ul du milieu de croissance. Transfert à un tube de pesée, et sédimenter les cellules par centrifugation à 5000 rpm pendant 30 sec. Reprendre le culot dans 1 ml de milieu de croissance sans glucose (SC-uracile,-glucose), sédimenter les cellules et répétez. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant aussi complètement que possible et peser le culot cellulaire. Resuspendre les cellules à une densité finale de 0,5 g / ml dans du SC-uracile sans glucose. </li><li> Ajouter 20 pl de suspension cellulaire dans chaque tube de tampon d&#39;étalonnage et bien mélanger sur un agitateur vortex. Incuber à 30 ° C sur un rotor de tambour de filage pendant 60 min. </li><li> Mettre en place le fluorimètre pour l&#39;excitation aux longueurs d&#39;onde 405 et 485 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 508 nm. Procéder à un seul point du temps ou des mesures cinétiques et l&#39;ajout de glucose comme décrit ci-dessus pour la mesure BCECF. </li><li> Mesurer la fluorescence d&#39;échantillons d&#39;étalonnage et tracer une courbe d&#39;étalonnage pour BCECF (voir 1.10-1.11). Une parcelle de rapport de fluorescence en fonction du pH est linéaire sur la plage de la plupart des mesures de pH cytosolique (pH 6,0-8,0) 9, la mesure du rapport de fluorescence de manière expérimentale sont facilement convertis au pH. </li></ol>

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. 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N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêts à déclarer.

Nous avons utilisé ces protocoles pour répondre à un certain nombre d&#39;aspects de l&#39;homéostasie du pH. Par exemple, nous avons comparé les réponses cytosolique et le pH des cellules mutantes et de type sauvage V-ATPase déficient 4,5. Nous avons également examiné les effets des conditions de croissance modifiées, le pH extracellulaire, en particulier sur la réponse du pH vacuolaire de glucose 3. Surtout, les réponses que nous observons sont cohérents avec d&#39;autres méthodes d...

homéostasie du pH est un processus dynamique et très réglementé dans tous les organismes 1,2. Processus biochimiques sont strictement réglementées par le pH et les environnements intracellulaires sont accordés sur des gammes de pH étroite pour permettre une activité optimale des enzymes résidentes. Cependant, l&#39;homéostasie du pH intracellulaire peut être contestée par des changements rapides dans l&#39;environnement pH, les changements métaboliques et certaines voies de signalisation. En outre, le pH intracellulaire peut se servir comme un signal important. Enfin, de nombreux organites maintenir des valeurs de pH luminales qui sont distincts du cytosol environnante et indispensable au bon fonctionnement des organites spécifiques. Saccharomyces cerevisiae actions d&#39;un certain nombre de mécanismes d&#39;homéostasie du pH avec eucaryotes supérieurs 2. Dans les organites acides de la voie d&#39;endocytose / lysosomale, le pH est principalement contrôlée par l&#39;ATPase vacuolaire translocation de protons hautement conservée (V-ATPase), agissant de concert avec de nombreux échangers dépendant du gradient de pH. Toutes les cellules eucaryotes ont aussi des mécanismes d&#39;exportation de protons. Chez les champignons et les plantes, une seconde, la pompe à protons distinct à la membrane plasmique, PMA1, les exportations protons métaboliques et l&#39;on croit être le déterminant majeur de pH cytosolique et du potentiel de membrane plasmique. La flexibilité génétique de S. cerevisiae et son importance commerciale, en ont fait un modèle très intéressant et important pour l&#39;étude de l&#39;homéostasie du pH 2. En plus d&#39;être les principaux moteurs de organite acidification, V-ATPase sont très réglementés et enzymes de notre laboratoire s&#39;intéresse aux mécanismes de régulation V-ATPase comprendre. Pour atteindre cet objectif, nous avons eu recours à des mesures de pH in vivo de pH vacuolaire et cytosolique: 1) suivre les réponses à l&#39;évolution des conditions extracellulaires, comme la privation de glucose et readdition, 2) d&#39;examiner les effets des mutations qui compromettent l&#39;activité V-ATPase, et 3) d&#39;explorer la coornation des organelles et la membrane plasmique pompes à protons 3-5. Ces expériences ne sont devenus possibles grâce à l&#39;élaboration d&#39;indicateurs de pH ratiométriques robustes qui se prêtent à utiliser dans les cellules de levure. . Plant et al ont d&#39;abord montré que BCECF (2&#39;7&#39;-bis-(2-carboxyéthyl) -5 - (et 6)-carboxyfluorescéine), qui a été largement utilisé pour mesurer le pH cytosolique dans les cellules de mammifères, s&#39;accumule dans la vacuole de la levure au lieu de le cytosol 6. Cette différence de BCECF localisation a été attribué aux nombreuses enzymes hydrolytiques dans la vacuole, qui sont susceptibles responsable du clivage de l&#39;ester méthylique de BCECF acétoxy-AM (ester acétoxyméthylique de BCECF) et vacuolaire rétention 6. Ali et al. 7 développées mesure du pH vacuolaire utilisant BCECF et adapté ces mesures à un format de lecteur de plaques à fluorescence. Brett et al. Introduit pHluorin de levure en tant que moyen de mesure du pH cytosolique dans la levure par l&#39;expression d&#39;un r plasmidiqueatiometric GFP sensible au pH 8 sous le contrôle d&#39;un promoteur spécifique de levure 9. Les spectres d&#39;excitation des deux BCECF et la levure pHluorin sont sensibles au pH, si elles sont utilisées comme indicateurs de pH ratiométriques dans lequel le rapport de fluorescence à deux longueurs d&#39;onde d&#39;excitation, mesurée à une longueur d&#39;onde d&#39;émission, fournit une mesure de pH 8,10. Ces levures capteurs de pH vacuolaire et cytosolique ont été utilisées pour les deux mesures unicellulaires et basée sur la population. Mesures monocellulaires 6,11 sont réalisées par microscopie à fluorescence et une analyse d&#39;image. Fluorescence vacuolaire ou cytosolique à deux longueurs d&#39;onde est mesurée pour chaque cellule. Les mesures basées sur la population sont réalisées soit dans un lecteur de microplaques avec des capacités de fluorescence appropriés ou dans un fluorimètre. Nous avons généralement fait nos mesures dans un fluorimètre, car il permet un accès facile pour l&#39;ajout d&#39;éléments tels que le glucose au cours de conmesures cinétiques continue. Nos protocoles de laboratoire courants pour la mesure du pH vacuolaire et cytosolique sont énumérés ci-dessous, les deux sont également facilement adapté aux essais en microplaques.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

Vacuolar et pH cytosolique sont très réglementés dans les cellules de levure et d&#39;occuper un rôle central dans l&#39;homéostasie globale du pH. Nous décrivons les protocoles de mesure radiométrique de pH in vivo en utilisant des fluorophores sensibles au pH localisés dans la vacuole ou cytosol. PH vacuolaire est mesurée en utilisant BCECF, qui se localise dans la vacuole dans la levure lors de son introduction dans les cellules, sous sa forme d&#39;ester d&#39;acétoxyméthyle. PH cytosolique est mesuré avec une GFP sensible au pH exprimé sous le contrôle d&#39;un promoteur de levure, la levure pHluorin. Les méthodes de mesure des ratios de fluorescence dans des suspensions de cellules de levure dans un fluorimètre sont décrits. Grâce à ces protocoles, des mesures ponctuelles de temps simples de pH dans des conditions différentes ou dans différents mutants de levure ont été comparées et les variations de pH au cours du temps ont été surveillés. Ces méthodes ont également été adaptés au format du lecteur de plaque à fluorescence pour des expériences à haut débit. Avantages de mesures de pH ratiométriques par rapport aux autres apapproches en cours d&#39;utilisation, les problèmes potentiels et les solutions expérimentales, et les perspectives pour le futur usage de ces techniques sont également décrites.

La figure 1 présente les données de pH vacuolaire obtenus sur des cellules de levure de type sauvage cultivées dans un milieu riche (extrait de levure-peptone-dextran; YEPD) tamponnée à pH 5 avec 50 mM MES. Nous cultivons souvent les cellules dans un milieu tamponné parce que le pH du milieu peut changer de façon spectaculaire au cours de la croissance pendant la nuit, surtout pour un milieu minimal, et nous avons constaté que le pH du milieu de croissance peut influencer les réponses de pH vac...

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Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

PH vacuolaire et cytosolique peut être mesurée en levures vivantes (<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;) Cellules en utilisant des colorants fluorescents ratiométriques localisés dans des compartiments cellulaires spécifiques. Nous décrivons les procédures pour mesurer le pH vacuolaire avec BCECF-AM, qui se localise dans la vacuole de la levure, et le pH cytosolique avec une GFP sensible au pH quotientométrique cytosolique (levure pHluorin).

Mesure du pH vacuolaire et cytosolique<em&gt; In Vivo</em&gt; En cellule de levure Suspensions

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

measurement-vacuolar-cytosolic-ph-vivo-yeast-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

19.7K vues.  SUNY Upstate Medical University. PH vacuolaire et cytosolique peut être mesurée en levures vivantes ( S. cerevisiae) Cellules en utilisant des colorants fluorescents ratiométriques localisés dans des compartiments cellulaires spécifiques. Nous décrivons les procédures pour mesurer le pH vacuolaire avec BCECF-AM, qui se localise dans la vacuole de la levure, et le pH cytosolique avec une GFP sensible au pH quotientométrique cytosolique (levure pHluorin).

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In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

In vivo la micro-circulation de mesure dans le muscle squelettique par voie intra-vitale microscopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

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Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

L&#39;imagerie à haute résolution et d&#39;analyse de l&#39;individu Astral microtubules Dynamique dans la levure bourgeonnante

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Microscopie 4D de levure

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Effet des protéines fluorescentes sur des partenaires de Fusion utilisant les épreuves de toxicité Polyglutamine chez la levure

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...