Nous remercions le Dr Diane Baronas-Lowell pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Charles E. Schmidt College FAU des sciences Subvention de démarrage et une bourse d&#39;études du vieillissement de la Fondation médicale Ellison à KJ

1. XLD (xylose-lysine-désoxycholate) des plaques de gélose gélose XLD est un milieu de croissance sélective de Salmonella, qui apparaît comme des colonies noires sur des plaques de gélose XLD. Toutefois, s&#39;il n&#39;y a pas des préoccupations de contamination, une plaque régulière LB peut être substitué. <ol><li> Peser 5,5 g XLD agar et remettre en suspension dans 5 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Bien mélanger jusqu&#39;à ce que tous agar est humide. Ajouter 95 ml d&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à ce que tous les grumeaux et le milieu est complètement remises en suspension. </li><li> Faire bouillir le milieu pour dissoudre complètement (ne pas l&#39;autoclave). </li><li> Refroidir le milieu à la température ambiante à 50 ° C. </li><li> Verser 25 ml d&#39;agar dans chacune 95 x 15 mm (diamètre x hauteur) plaque (plaques scellées avec du Parafilm peuvent être conservés à 4 ° C pendant 1 mois). </li></ol> 2. Nématode Croissance moyenne (NGM) ARNi alimentation Plaques C. Préparation d&#39; des plaques NGM elegans a été décrit précédemment une9. Voici une procédure est décrite brièvement à ajouter l&#39;antibiotique ampicilline et l&#39;ARNi inducteur chimique isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dans le support NGM pour fabriquer les plaques d&#39;alimentation d&#39;ARNi. <ol><li> Dissoudre 3 g de NaCl et 2,5 g Bacto peptone dans 1 L d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Ajouter 17 g de gélose Bacto dans les médias. </li><li> Autoclaver le support pendant 45 minutes et refroidir le support à 50 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Ajouter les solutions suivantes: 1 ml de cholestérol (5 mg / ml dans de l&#39;éthanol à 95%), 1 ml de 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO 4, et 25 ml de 1 M de tampon phosphate de potassium (pH 6,0). Mélangez bien. </li><li> Ajouter 1 ml de 1 M d&#39;IPTG et 500 ul d&#39;ampicilline (100 mg / ml dans de l&#39;eau stérile). </li><li> Bien mélanger la solution et verser dans les 60 x 15 mm (diamètre x hauteur) des plaques de Pétri en utilisant une aide Pipet et 25 ml de pipettes sérologiques suivants procédures stériles. Remplir chaque plaque avec 12 ml de gélose. Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 1 mois. </li></ol> Le gène de l&#39;autophagie essentiel bec-1 est utilisé comme un exemple d&#39;examiner la fonction d&#39;un gène de l&#39;hôte dans la défense contre l&#39;infection à Salmonella. Les procédures expérimentales sont illustrées à la Figure 1 et le Tableau 1. Le protocole de préparation des animaux RNAi-traités pour une infection résulte, avec le jour de chaque étape expérimentale donnée entre parenthèses. <ol><li> Inoculer bec-1 ARNi alimentation et de contrôler le vecteur vide L4440 ARNi nourrir les bactéries en plaçant un flocon de -80 ° C bactéries congelées dans 2 ml de milieu LB additionné de 100 mg / ml d&#39;ampicilline (Jour 1). Répétez cette étape une fois par semaine pendant toute l&#39;expérience d&#39;avoir des bactéries ARNi frais. Rangez la culture dans le réfrigérateur à 4 ° C lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. </li><li> Ensemencer 100 ml de culture bactérienne nuit ARNi sur des plaques de RNAi. Préparer trois bec-1 ARNi et commande trois vide vEctor plaques ARNi. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit (Jour 2). </li><li> Retirer les plaques d&#39;ARNi de 37 ° C incubateur et les laisser refroidir à la température ambiante sur le banc. Pick-up bien nourris L4 type sauvage hermaphrodites N2 et les transfèrent à Bec-1 ARNi et contrôlent vides vecteur plaques de RNAi. Placez trois vers par plaque, sur des plaques en triple. Le même jour, préparer des plaques ARNi comme décrit dans l&#39;étape 3.2 (Jour 3). </li><li> Incuber les plaques d&#39;ARNi avec des vers dans l&#39;incubateur à 20 ° C pour 36-40 h et de transfert vers Fresh plaques d&#39;ARNi correspondants préparés à l&#39;étape 3.3. Après les vers sont transférés, incuber les plaques à 20 ° C incubateur pendant 64 heures (jour 4). </li></ol> 4. Préparer Salmonella de l&#39;infection <ol><li> Streak Salmonella -80 ° C stock congelé sur une plaque de gélose XLD et incuber la plaque à 37 ° C pendant la nuit (Jour 5 </strong&gt;). </li><li> Choisissez une colonie de Salmonella noir bien isolé et l&#39;inoculer dans 2 ml de milieu LB à 37 ° C avec agitation pendant la nuit (Jour 6). </li><li> Seed 80 ml ​​Salmonella culture de la nuit sur ​​une C. elegans 60 x 15 mm (diamètre x hauteur) plaque de gélose NGM et préparer 6 plaques au total. Incuber les plaques à température ambiante pendant 6 heures. La culture bactérienne doit sécher et former une pelouse sur la plaque (jour 7). </li></ol> 5. Worms Infect ARNi traités avec Salmonella <ol><li> Transfert bec-1 ARNi traités et témoins vides vecteur ARNi traité hermaphrodites L4 N2 (de la descendance des vers mis en place à l&#39;étape 3) des plaques de Salmonella. Placez 40 vers par plaque 3 plaques pour chaque groupe. Incuber les plaques à vis sans fin à 20 ° C pendant 48 heures (Jour 7). </li><li> Préparer un ensemble de plaques d&#39;ARNi frais comme décrit dans les étapes 3.1 et 3.2 (Jour 7 et <strong&gt; Jour 8). </li><li> Après 48 heures de l&#39;infection, transférer vers infectés par Salmonella sur les plaques d&#39;ARNi correspondants préparés à l&#39;étape 5.2 et incuber à 20 ° C (Jour 9). </li></ol> 6. Survival Assay <ol><li> Note la survie des vers tous les jours et transférer vers les plaques ARNi correspondant fraîches pendant la période de ponte. Préparer une série de plaques de RNAi frais avant chaque transfert de ver comme décrit dans les étapes 3.1 et 3.2. Toucher le corps de vis sans fin (de la tête, partie centrale et la queue) délicatement avec un fil de platine fin aplatie. Un ver est marqué comme mort si aucun mouvement du corps du ver est observée. </li><li> Note la survie des vers par jour ou tous les deux jours, et de les transférer vers des plaques ARNi correspondant frais deux fois par semaine après les vers ne pondent. </li><li> Après tous les vers meurent, regrouper les données de survie à partir de plaques en triple comme un ensemble de données. Entrez les données de survie de chaque groupe dans le logiciel statistique approprié tel que GraphPad Prisme pour générer des courbes de survie et d&#39;effectuer de Kaplan-Meier analyse de survie. L&#39;expérience est répétée au moins une fois pour confirmer la conclusion. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole.">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">The C. elegans Sequencing Consortium. 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G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2, 1-10 (2001).</li><li>Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA-mediated+interference+feeding+strategy+to+screen+for+genes+involved+in+body+size+regulation+in+the+nematode+C+elegans.">Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li><li>Fraser, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li><li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+mediated+by+ced-3+and+ced-4+protects+Caenorhabditis+elegans+from+Salmonella+typhimurium-mediated+killing.">Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).</li><li>Melendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+genes+are+essential+for+dauer+development+and+lifespan+extension+in+C.+elegans.">Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans.</a> Science. 301, 1387-1391 (2003).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

C. elegans est un simple organisme modèle génétique qui mange des bactéries comme source d&#39;éléments nutritifs. Ainsi, il est aisé de substituer sa nourriture bactérienne normale avec un agent pathogène intestinal pour enquêter sur les interactions entre C. elegans et l&#39;agent pathogène choisi. Ici, un protocole est décrit à combiner infection à Salmonella et C. elegans ARNi alimentation de traitement pour examiner le rôle des gènes de l&#39;hôte dans la défens...

Le nématode du sol vivant librement Caenorhabditis elegans est un organisme simple et génétiquement traitable modèle utilisé pour étudier plusieurs questions biologiques. C. elegans existe dominante comme hermaphrodites auto-fertilisation. Les mâles sont spontanément générées par des non-disjonction du chromosome X durant la gamétogenèse 1,2. En présence d&#39;une alimentation abondante, C. elegans développer en continu à travers quatre stades larvaires à l&#39;âge adulte. La température influe aussi C. développement elegans; On observe un développement plus rapide à des températures plus élevées. En laboratoire, C. elegans est cultivé à une température standard de 20 ° C sur gélose ensemencée avec la bactérie Escherichia coli (souche OP50) que la nourriture 1,2. Dans la dernière décennie, C. elegans est devenu un organisme invertébré pour étudier les interactions hôte-pathogène 3-5. Dans la nature, C. elegans mange des bactéries comme nutrient la source 1,2. Sa nourriture de laboratoire bactérienne normale, OP50, peut être facilement remplacé par d&#39;autres agents pathogènes d&#39;étudier les interactions entre C. elegans et n&#39;importe quel agent pathogène choisi. Dans ces conditions, l&#39;intestin est le site primaire de l&#39;infection. En effet, une large gamme de pathogènes bactériens a été montré pour infecter léthalement C. elegans 5.3. La bactérie Salmonella Gram négatif est un agent pathogène gastro-intestinal qui provoque une maladie d&#39;origine alimentaire humaine dans le monde 6,7. C. elegans est un bon hôte de modèle pour Salmonella typhimurium que cette bactérie se réplique et présente infections intestinales persistantes 8-10. C. elegans a été utilisé pour identifier à la fois roman et les facteurs précédemment connu virulence de Salmonella 11. Fait intéressant, l&#39;C. système immunitaire elegans limite efficacement la réplication de la bactérie Salmonella. Il a été rapporté précédemment que inhibition des gènes de l&#39;autophagie rend réplication accrue de Salmonella dans C. elegans, entraînant la mort précoce de vers infectées 10. Macroautophagie (ci-après appelé autophagie) est un processus dynamique impliquant le réarrangement des membranes intracellulaires de séquestrer cytoplasme et des organites pour la livraison vers le lysosome pour dégradation 12. Autophagy a été rapportée pour limiter la réplication de Salmonella dans C. elegans et chez les mammifères 10,13. Le C. génome elegans a été le premier génome eucaryote multicellulaire séquencé; il est sensible à l&#39;ARNi traitement 14-16. En outre, l&#39;ARNi peut être administré efficacement en soumettant les vers à ingérer des bactéries contenant de l&#39;ARN à double brin du gène cible, connu sous le nom de RNAi alimentation 16,17. Bibliothèques d&#39;alimentation ARNi du génome entier ont été générés pour l&#39;ARNi du génome de dépistage 16,18. Ici, une infection pro Salmonellaprotocole est couplé avec l&#39;ARNi alimentation pour permettre de tester C. gènes elegans d&#39;intérêt pour leur capacité à protéger contre l&#39;infection à Salmonella.

<table><tbody><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD agar</td><td>EMD Chemicals</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella typhimurium&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 95 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 x 15 mm&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Serological pipet</td><td>Fisher</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Express Pipet-Aid</td><td>Fisher</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000 shaking incubator&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol to infect caenorhabditis elegans with salmonella typhimurium

Dans la dernière décennie, C. elegans est devenu un organisme invertébré pour étudier les interactions entre hôtes et pathogènes, y compris la défense de l&#39;hôte contre les bactéries gram-négatif bactérie Salmonella typhimurium. Salmonella établit une infection persistante dans l&#39;intestin de C. elegans et entraîne la mort précoce des animaux infectés. Un certain nombre de mécanismes de l&#39;immunité ont été identifiés en C. elegans pour se défendre contre les infections à Salmonella. Autophagy, une voie de dégradation lysosomale évolutif conservé, a été montré pour limiter la réplication de Salmonella dans C. elegans et chez les mammifères. Ici, un protocole est décrit à infecter C. elegans avec Salmonella typhimurium, dans laquelle les vers sont exposés à Salmonella pendant une durée limitée, semblable à une infection à Salmonella chez l&#39;homme. infection à Salmonella raccourcit considérablement la durée de vie de C. elegans &lt;/ Em&gt;. Utilisation du gène de l&#39;autophagie essentiel bec-1, par exemple, nous avons combiné cette méthode d&#39;infection à C. elegans ARNi alimentation approche et montré ce protocole peut être utilisé pour examiner la fonction de C. gènes de l&#39;hôte elegans dans la défense contre l&#39;infection à Salmonella. Depuis C. elegans génome des bibliothèques entières de RNAi sont disponibles, ce protocole permet à l&#39;écran complètement pour C. gènes elegans qui protègent contre les salmonelles et d&#39;autres agents pathogènes intestinaux utilisant des bibliothèques de l&#39;ARNi du génome entier.

A 20 ° C, la durée de vie médiane de type sauvage vers N2 est de 17 jours (figure 2A et Tableau 2). L&#39;infection à Salmonella diminue de manière significative la durée de vie médiane de vers N2 à 10,5 jours (p = 0,0002, log-rank test) (figure 2A ). Si un C. gène elegans joue un rôle important dans la défense contre l&#39;infection à Salmonella, il est prévu que son inhibition peut ...

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A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans a émergé comme un nouveau modèle génétique pour étudier les interactions hôte-pathogène. Ici, nous décrivons un protocole pour infecter C. elegans avec Salmonella typhimurium couplé avec la technique d&#39;interférence double-brin ARNi pour étudier le rôle des gènes de l&#39;hôte dans la défense contre l&#39;infection à Salmonella.

Un protocole d&#39;infecter<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Avec<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

11.5K vues.  Florida Atlantic University.  C. elegans a émergé comme un nouveau modèle génétique pour étudier les interactions hôte-pathogène. Ici, nous décrivons un protocole pour infecter C. elegans avec Salmonella typhimurium couplé avec la technique d'interférence double-brin ARNi pour étudier le rôle des gènes de l'hôte dans la défense contre l'infection à Salmonella. 

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent In Vivo pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

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Génétique

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Séparation automatique des<em&gt; C. elegans</em&gt; Façon variable colonisé par une bactérie pathogène

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Immunologie et infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

À haut débit de dosage de phénotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Test à haut débit pour mesurer l’apport alimentaire et la durée de vie de Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Pleins feux sur l’auteur : Explorer la relation entre la lipotoxicité et l’ICFEp 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantifier l’apport alimentaire chez Caenorhabditis elegans en mesurant la clairance bactérienne

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Sciences du comportement

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Utilisant le protozoaire Paramecium caudatum comme vecteur d’Infections d’origine alimentaire chez les larves de poisson zèbre

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

Fibrose intestinale induite par l'infection chronique à Salmonella

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Étude de l’immunité héréditaire dans un modèle d’infection à Microsporidia à Caenorhabditis elegans

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection or damage. Currently, the widely used mice models of sepsis include lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxemia, cecal ligation and puncture (CLP), and monobacterial infection model systems. This protocol describes a method to study the host responses during Salmonella Typhimurium infection-induced septic peritonitis in mice. S. Typhimurium, a Gram-negative intracellular pathogen, causes typhoid-like disease in mice.
This protocol elaborates the culture preparation, induction of septic peritonitis in mice through intraperitoneal injection, and methods to study systemic host responses. Furthermore, the assessment of bacterial burden in different organs and the flow cytometric analysis of increased neutrophil numbers in the peritoneal lavage is presented. Salmonella Typhimurium-induced sepsis in mice leads to an increase in proinflammatory cytokines and rapid infiltration of neutrophils in the peritoneal cavity, leading to lower survival.
Every step in this protocol has been optimized, resulting in high reproducibility of the pathogenesis of septic peritonitis. This model is useful for studying immunological responses during bacterial sepsis, the roles of different genes in disease progression, and the effects of drugs to attenuate sepsis.

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

This protocol describes the induction of Gram-negative monobacterial sepsis in a mouse model system. The model is useful in investigating the inflammatory and lethal host responses during sepsis.

Caractérisation de la péritonite septique induite par Salmonella Typhimurium chez la souris

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Un protocole d'infecter

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent In Vivo pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes

Séparation automatique des

À haut débit de dosage de phénotype

Quantifier l’apport alimentaire chez Caenorhabditis elegans en mesurant la clairance bactérienne

Quantifier l’apport alimentaire chez Caenorhabditis elegans en mesurant la clairance bactérienne

Quantifier l’apport alimentaire chez Caenorhabditis elegans en mesurant la clairance bactérienne

Utilisant le protozoaire Paramecium caudatum comme vecteur d’Infections d’origine alimentaire chez les larves de poisson zèbre

Fibrose intestinale induite par l'infection chronique à Salmonella

Étude de l’immunité héréditaire dans un modèle d’infection à Microsporidia à Caenorhabditis elegans

Caractérisation de la péritonite septique induite par Salmonella Typhimurium chez la souris