La fibrose tissulaire est la principale façon dont les organes échouent au fil du temps, en réponse à une inflammation chronique ou au vieillissement. Et en fait, je dirais que si vous ne mourez pas d’un agent infectieux ou d’un cancer, vous mourrez probablement de fibrose organique à mesure que vous vieillirez. Malheureusement, il n’y a pas beaucoup de grands modèles de souris pour imiter la fibrose des tissus humains.
Donc, ce que nous avons développé est un modèle de souris de la maladie de Crohn, c’est une maladie chez l’homme qui provoque la fibrose de l’intestin et est en grande partie intraitable. En fait, la seule façon que vous pouvez le traiter est par l’ablation chirurgicale du tissu fibrotique et la re-ligature de l’intestin. L’avantage de notre modèle est qu’il est entièrement pénétrirant dans toutes les souches de souris et il imite très étroitement la maladie humaine de Crohn et la fibrose persiste pendant plus d’un mois, qui est vraiment un modèle robuste.
La partie la plus difficile de cette procédure est la manipulation des souris et en particulier le gavage oral car cela nécessite beaucoup de pratique certification spéciale. Lors de l’exécution de cette procédure pour la première fois, il faut savoir que travailler avec Salmonella exige des précautions de sécurité appropriées et une technique stérile. L’élimination des déchets et des bactéries devrait être planifiée avant l’expérience.
La démonstration visuelle de cette procédure est très importante parce qu’elle implique la manipulation de Salmonella qui nécessite des précautions de sécurité spéciales ainsi qu’une technique stérile appropriée. Pour commencer cette procédure, établissez une plaque avec de l’agar LB contenant de la streptomycine à une concentration de 100 microgrammes par millilitre. À l’aide d’une boucle stérile d’inoculation, strier la plaque avec un stock de glycérol congelé de S typhimurium delta flèche a.
Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Les plaques de stries peuvent être conservées à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Un jour avant l’infection, dissoudre 0,5 grammes de streptomycine dans 2,5 millilitres d’eau pour préparer l’antibiotique.
Filtre stériliser la solution Streptomycin. Ensuite, utilisez une aiguille de gavage de calibre 22 à pointe bulbe avec une seringue d’un millilitre pour gavage oralement les souris avec 100 microlitres de la solution streptomycine. Ensuite, ajoutez trois millilitres de bouillon LB contenant de la streptomycine à une concentration de 50 microgrammes par millilitre à un tube de culture.
À l’aide d’une boucle d’inoculation, inoculer le bouillon LB avec une seule colonie. Incuber la culture aérobiement pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec des secousses à 200 rpm. Le jour de l’infection, effectuer deux dilutions consécutives d’une à 10 des cultures salmonella pendant la nuit avec PBS stérile pour préparer la dose finale d’infection.
Il en résulte un inoculum de 100 microlitres contenant environ trois millions d’unités formant des colonies. Après cela, utilisez une aiguille de gavage de calibre 22 à pointe bulbe avec une seringue millilitre pour gaver chaque souris avec 100 microlitres de salmonella préparée. Tout d’abord, définissez deux microtubes arrondis à verrouillage sécuritaire, ajoutez un millilitre de PBS stérile et une perle en acier inoxydable autoclavée à chaque tube.
Pré-peser les tubes avant la collecte des tissus. Après avoir euthanasié des souris, réséquez leurs tissus cécals et spléniques, en s’assurant de recueillir les tissus des animaux individuels dans des tubes séparés. Pesez chaque tube pour déterminer le poids des tissus.
Utilisez un appareil de moulin à mélangeur pour homogénéiser les tissus à 30 hertz pendant 15 minutes. Ensuite, transférez 900 microlitres de PBS dans chaque puits d’un méga bloc de 96 puits de deux millilitres. Pipette 100 microlitres de tissu homogénéise dans le premier puits, et bien mélanger.
Effectuer des dilutions en série en ajoutant 100 microlitres aux puits suivants, jusqu’à ce qu’une dilution de 10 à la sixième dilution négative soit obtenue. Plaque 10 microlitres de chaque dilution en triplicates sur l’agar LB qui contient de la streptomycine. Ensuite, comptez les unités moyennes de formation de colonies et déterminez les unités formant la colonie par gramme de tissu tel que décrit dans le protocole textuel.
Ouvrez Fidji, qui est un logiciel d’imagerie open source et faites glisser et déposez le fichier d’image tif sur la barre d’outils. Sur la barre de menu, sélectionnez Image, Type, RGB pile pour diviser l’image en canaux rouges, verts et bleus. Faites glisser la barre horizontale au bas du panneau pour mettre le canal au vert.
Ouvrez l’image, ajustez, seuilz l’outil. Ajustez les limites minimales et maximales pour éliminer les signaux d’arrière-plan. Une fois que le seuil désiré est défini, fermez l’outil de seuil et passez à l’analyse, aux mesures définies, à la zone de cochée, à la fraction de zone, à la limite au seuil et à l’étiquette d’affichage.
Obtenez la sélection des tissus avec les sélections à main levée ou polygone sélections outil et mesurer la zone pour cent positif pour le collagène en cliquant sur Analyser, Mesurer. Ensuite, normalisez la zone absolue positive pour la coloration du collagène à la zone tissulaire. Le traitement de streptomycine suivi de l’infection orale avec la flèche de delta de typhimurium de S mène à l’inflammation intestinale robuste et à la fibrose, particulièrement dans le cecum.
Les charges pathogènes typiques de 100 millions à un milliard d’unités de formation de colonies peuvent être récupérées par gramme de cecum chez les animaux infectés, tandis que 10 000 unités formant des colonies peuvent généralement être récupérées par gramme de rate. L’évaluation de la fibrose dans les sections cécales tachées de picrosirius rouge indique la fibrose de pointe 21 jours après l’infection, alors qu’une grande partie de la pathologie est résolue par jour 42 après infection. Une préparation approfondie des matériaux est essentielle car cette expérience nécessite plusieurs jours de mise en place.
La préparation des plaques LB et salmonella et streptomycine doit être faite de façon aseptique. Avant l’expérience, assurez-vous que l’expérimentateur connaît bien le protocole animal ainsi que les dangers pour la sécurité. Lors de l’évaluation de la charge de collagène, l’expérimentateur peut choisir d’effectuer d’autres analyses biologiques, telles que le séquençage de l’ARN pour évaluer les profils d’expression des gènes ou la cytométrie du flux pour évaluer les sous-ensembles de cellules immunitaires ou un tissu ELISA pour évaluer les profils de cytokine.
Ainsi, notre modèle est particulièrement bon pour imiter une maladie humaine appelée maladie de Crohn où vous obtenez la fibrose de l’intestin, qui est en grande partie intraitable et la seule façon que vous pouvez le traiter est d’enlever une section de l’intestin et de le recoudre ensemble et j’espère qu’il ne revient pas. Notre modèle est très robuste et nous avons déjà montré que le ciblage des lymphoïdes innés de type trois, un facteur de transcription appelé alpha brut, ou interleukine 17 améthère la maladie et prévient la fibrose. Notre modèle est particulièrement bon pour identifier les facteurs qui jouent dans la pathogénie de la maladie de Crohn et la fibrose intestinale et nous sommes déjà sur la voie d’identifier un certain nombre de cibles qui pourraient être traitées thérapeutiquement pour soulager les maladies inflammatoires de l’intestin.
Notre modèle est déjà entré dans le même accès ILC3 ou alpha NIL17 peut être en jeu dans d’autres maladies fibrotiques et ceux-ci comprennent des choses comme le psoriasis, la sclérose en plaques, la fibrose pulmonaire idiopathique. Il est donc possible que le ciblage de ces mêmes facteurs pourrait soulager la fibrose dans ces maladies ainsi. Bien que le flux mutant de Salmonella ne soit pas virulent, il est important de suivre les protocoles standard de sécurité des risques biologiques donnés par l’installation.
En outre, puisque les vapeurs de formaldéhyde sont connues pour être cancérigènes, il est important de travailler derrière une hotte de fumée pendant l’étape de fixation.
