Nous tenons à souligner l&#39;esprit de coopération de tous les membres du laboratoire Caldwell. Mouvements anormaux de recherche dans le laboratoire a été soutenu par la dystonie Bachmann-Strauss &amp; Parkinson Foundation, Royaume-Parkinson Foundation, American Association Maladie de Parkinson, la maladie de Parkinson Association de l&#39;Alabama, la Fondation Michael J. Fox pour la recherche sur le Parkinson, et une recherche de premier cycle.

Construction plasmide d&#39;expression Deux plasmides sont nécessaires: un pour expression tissu-spécifique du gène d&#39;intérêt et d&#39;une seconde comme marqueur de la transformation sélectionnable. Experimental plasmidique <ol><li> Sélectionnez un promoteur qui est exprimé dans le type de tissu / cellule d&#39;intérêt, par exemple, un nerf ou de muscle promoteur spécifique. Si l&#39;on est d&#39;exprimer des gènes multiples dans le même tissu, une cassette promoteur plasmide dans le système Gateway (Invitrogen) peuvent être utilisés. Cette approche permet l&#39;insertion d&#39;un gène d&#39;intérêt en aval du promoteur par 4 le clonage par recombinaison. Généralement, 2-5 kb de séquences en amont est suffisante pour avoir l&#39;expression correcte et précise. </li><li> L&#39;ADNc du gène d&#39;intérêt peut être cloné de deux façons: <ol><li> Clonage classiques utilisant des enzymes de restriction. </li><li> Pour le clonage de la passerelle, il est amplifié par PCR utilisant des amorces qui contiennent la passerelle att séquence B recombinaison. L&#39;ADNc amplifié est d&#39;abord recombinés dans le vecteur donneur pDONR201 pour créer le vecteur d&#39;entrée et ensuite transformé en E. coli souche DH5a. Après la sélection de recombinants succès et mini-prep isolation de l&#39;ADN, le vecteur d&#39;entrée est recombinée dans le vecteur de destination promoteur contenant de créer le plasmide d&#39;expression. Détails sur le clonage par recombinaison sont disponibles à partir du manuel soit Passerelle Invitrogen ou dans Caldwell et al. 5. </li></ol></li></ol> Marqueurs de sélection plasmidique Des exemples de plasmides marqueur transgénique comprennent rol-6 ou l&#39;utilisation du promoteur musculaire du corps murale unc-54 pour conduire l&#39;expression de protéines fluorescentes. Ces plasmides marqueur sont généralement disponibles au sein de la communauté de la recherche sur demande. Microinjection de C. elegans Préparation <ol><li> Effectuer isolement de l&#39;ADN des deux plasmides qui doivent être injectés. Les quantifier et les mélanger dans un rapport 1:1 de 50 ng / ul chacun. </li><li> Préparer coussinets agar: <ol><li> Faire une solution à 2% d&#39;agarose dans de l&#39;eau, la chaleur ou micro-ondes jusqu&#39;à dissolution. </li><li> Énonce plusieurs verres 22 x 50 mm sur un couvercle de paillasse. </li><li> En utilisant une pipette Pasteur, déposer une goutte de l&#39;agarose fondu sur un couvercle en verre et placer immédiatement un couvercle en verre seconde sur la baisse à un angle de 90 à la première. Répétez l&#39;opération pour plusieurs verres couvrir d&#39;autres. Le diamètre du disque aplati d&#39;agarose doit être comprise entre 15-20 mm. </li><li> Après l&#39;agarose solidifié (Cela ne prend que des moments), retirez le couvercle en verre et de permettre le pad à l&#39;air complètement sec (plusieurs heures pour la nuit). </li><li> Boutique des plaquettes dans une boîte en verre couvercle à la température ambiante. </li></ol></li><li> Faire chargeurs aiguille pour la solution d&#39;ADN: Chargeurs aiguille sont créés à partir de 100 ul tubes capillaires qui sont chauffés au milieu sur une flamme nue et rapidement tiré à environ deux fois leur longueur. Les deux moitiés sont cassé dehors une fois le tube capillaire se refroidit. Des stocks de 10 à 20 chargeurs de seringues pour l&#39;injection. Conserver en position verticale dans un rack microtube. Faites preuve de prudence pour ne pas se empaler sur les points. </li><li> Faire des aiguilles de microinjection: L&#39;aiguille est fabriquée à partir d&#39;un tube capillaire spéciale qui contient un filament de verre interne; ce filament sert d&#39;une mèche pour la solution d&#39;ADN. Ce sont tirés sur une machine à aiguille extracteur. Nous utilisons un Narishige PP-830 Extracteur avec un réglage de chaleur de 24,8. Plusieurs aiguilles sont tirés à la fois et sont stockées dans une petite boîte en plastique. Aiguilles multiples peuvent être facilement &quot;monté&quot; sur une bande de pâte à modeler pour le stockage à long terme. </li><li> Pointe de l&#39;aiguille &quot;disjoncteurs&quot;: La pointe de l&#39;aiguille de microinjection est tiré si fine qu&#39;elle est effectivement fermé à son extrémité et doit être défoncé à l&#39;aide des tessons de verre petite couverture. Ce sont préparés par emballage de 18 x 18 mm couvercle en verre dans une serviette de papier et appliquer une pression doucement jusqu&#39;à ce qu&#39;elle se brise en plusieurs morceaux. Les éclats d&#39;une taille utile est d&#39;environ 3 x 4 mm. </li><li> Cultivez de type sauvage (N2) vers le stade adulte au début d&#39;injection en utilisant des procédures standard de 6. Préparer environ 100 bien mis en scène des vers / construire injecté. </li></ol> Procédure <ol><li> Ouvrez la vanne principale sur un réservoir d&#39;hélium qui est relié à un bras de l&#39;aiguille de microinjection et titulaire. Fermez la vanne de régulation pour permettre au gaz d&#39;entrer dans la ligne, amenant la pression à 35 psi. Notez que le gaz peut être libéré à l&#39;aide d&#39;une pédale. </li><li> Insérez un chargeur aiguille dans un tube pipetteur bouche standard (trouvés dans des récipients de tubes capillaires en verre) et d&#39;établir une petite quantité du mélange plasmide (~ 1 pl). </li><li> Le chargeur de l&#39;aiguille est bien placée dans l&#39;extrémité arrière d&#39;une aiguille d&#39;injection et délicatement insérées tout au long de la longueur del&#39;aiguille jusqu&#39;à sentir une résistance. Expulser la solution d&#39;ADN en soufflant doucement, puis retirer le chargeur. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans le bras de micro-injection, en prenant soin de le placer dans le joint en caoutchouc internes de petite taille. </li><li> Placer un tesson aiguille bris de glace couvre sur un bord d&#39;un tampon d&#39;agar. Couvrir le fragment, ainsi que toute la surface du pad agar-agar, avec de l&#39;huile d&#39;halocarbures. Placez le tampon d&#39;agar sur la scène d&#39;un microscope inversé. </li><li> Position de l&#39;aiguille dans le centre du champ visualisation en utilisant l&#39;objectif 4X et l&#39;illumination en champ clair, mais n&#39;ont pas encore l&#39;abaisser dans l&#39;huile. En outre, la position du bord interne de l&#39;éclat de verre de couverture dans le centre, puis se concentrer sur elle (toujours avec l&#39;objectif 4X). Abaissez l&#39;aiguille dans l&#39;huile, le ramenant dans le même plan focal que l&#39;éclat de verre de couverture. Soulevez le grossissement en passant à l&#39;objectif 40X. Recentrage sur le bord du tesson et repositionner la pointe de l&#39;aiguille, si nécessaire. </li><li> Pour ouvrir la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection, doucement pousser l&#39;aiguille contre le bord du verre couvre éclat, tandis que dans le même temps l&#39;application d&#39;une impulsion courte de gaz via la pédale. L&#39;aiguille sera suffisamment rompu ouvert lorsque de petites gouttelettes de liquide échapper à la fin de l&#39;aiguille. L&#39;excès de flux liquide due à une trop grande ouverture n&#39;est pas souhaitable, car elle va tuer les animaux. </li><li> Enlever le tampon d&#39;agar de la scène en levant l&#39;aiguille en place, mais ne changent pas l&#39;X ou l&#39;axe Y de position. Faites glisser le stade de dessous de l&#39;aiguille, retirer le tampon d&#39;agar et le placer sur un microscope à dissection. Transfert d&#39;un ver sur le pavé, en dessous de la surface de l&#39;huile. Si le ver se tortille, doucement caresser jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche le pad agar. Le ver humide doit adhérer à la sécheresse agarose. </li><li> Injection <ol><li> Placer rapidement le dos pad agar sur la scène, le centrage le ver dans le champ de vision. </li><li> Abaissez l&#39;aiguille dans le même plan d&#39;orientation que le ver. </li><li> Mettre le filtre à Hoffman éclairage (un type de filtre de contraste). Cela permet détails morphologiques du ver à devenir visibles. Si Nomarski / DIC optiques sont disponibles sur le champ inversé qui fonctionnera aussi bien. En utilisant l&#39;objectif 40X, se concentrer sur le &quot;grain&quot; centre syncytial de la gonade ver, en dessous du &quot;nid d&#39;abeille&quot; modèle des noyaux germinales (choisir le gonade est positionné sur le côté du ver face à l&#39;aiguille). </li><li> Ajustez la position de l&#39;aiguille jusqu&#39;à la pointe est également en discussion (le même plan que la gonade &quot;grain&quot;). </li><li> Insérer délicatement l&#39;aiguille dans le centre de la gonade et appliquer une brève impulsion de pression de gaz d&#39;expulser une goutte ou deux de l&#39;ADN dans le bras des gonades. Vous devriez observer une vague de propagation de liquide dans la gonade distale. Ne présumez pas plus de liquide est préférable, car trop de liquide peut couler dans le virage proximale du bras gonades, qui peut arrêter la production d&#39;ovocytes. Si possible, selon la position du ver, injecter le bras gonades d&#39;autres de la même manière. </li><li> Il est important de travailler rapidement tout en injectant un ver, car il peut facilement se dessèchent. La décision d&#39;injecter le bras gonades seconde dépend de la rapidité avec laquelle vous pouvez repositionner l&#39;aiguille et le ver. L&#39;ensemble du processus devrait idéalement prendre moins de 1-2 minutes. </li></ol></li><li> Retirez le couvercle en verre de la scène et placez-le sur un microscope à dissection. Appliquer 1 microlitre de M9 tampon (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm de NaCl, 1 mM MgSO 4) directement sur ​​le ver injecté (cela pourrait entraîner submergeant la pointe de la pipette en dessous de la surface de l&#39;huile d&#39;halocarbures). Le tampon doit réhydrater le ver, il sera alors flotter la surface du tampon d&#39;agarose. Transfert du ver à une plaque régulière en utilisant un pick ver. Le coussin d&#39;agarose peuvent être réutilisées plusieurs fois jusqu&#39;à ce qu&#39;il est devenu trop saturé de tampon et les vers ne plus adhérer. </li></ol> Sélection transgéniques <ol><li> Ver injecté, le P 0 génération, sont transférés à chaque nouvelle, les plaques des bactéries ensemencées (60 mm) et autorisé à reproduire. Typiquement, les animaux injectés sont incubées à 20 ° C pendant 2-3 jours jusqu&#39;à ce que la progéniture apparaissent. </li><li> La progéniture F 1 sont observés pour les preuves du marqueur transgénique (telles que la fluorescence) en utilisant un stéréomicroscope fluorescentes. Chaque fluorescentes, porteuse F 1, un animal cloné est séparément sur ​​une nouvelle plaque (depuis la progéniture de chaque F 1 sont considérées comme une ligne distincte). Le 1 F hermaphrodites sont autorisés à reproduire. Là encore, cela est généralement effectuée au moins 20 ° C pendant 2-3 jours jusqu&#39;à ce que la progéniture apparaissent. </li><li> La génération F 2 est observée pour les animaux transgéniques ainsi. F 2 animaux qui ont hérité et d&#39;exprimer le tableau transgéniques sont considérées comme un «stable» en ligne. REMARQUE: Lors de la F 1 erâge, il peut y avoir beaucoup d&#39;animaux transgéniques, mais ils ne sont pas stables. La majorité des animaux transgéniques F 1 ne seront pas propagées dans F 2 lignées stables. REMARQUE: Pour le contrôle de la variabilité du nombre de copies du gène, de générer un minimum de trois lignes indépendantes stable par la construction injecté. </li><li> Chaque ligne indépendante stables devraient être maintenues sur une ligne distincte des vers. Chaque ligne peut être propagé par le transfert de plusieurs animaux transgéniques pour une nouvelle plaque à chaque génération, ce qui doit être effectuée en utilisant un stéréomicroscope fluorescentes si le marqueur de sélection est fluorescent. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de: - Injecter directement dans le centre de la gonade - Ne pas injecter trop de liquide - Travailler rapidement pour empêcher la dessication. Si vous rencontrez des problèmes avec l&#39;aiguille, comme elle est cassée trop grand, il est préférable de refaire une aiguille neuve, plutôt que d&#39;essayer d&#39;injecter avec une aiguille de moins idéale. La génération des vers transgéniques a de nombreuses applications telle...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil, Voltalef</td>
<td>Hulle 10S</td>
<td>elfatochem, France</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 18x18 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 22x50 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 ul Capillary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary for Needles</td>
<td>"Kwik-Fil"</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microINJECTOR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research</td>
<td>MINJ-1000</td>
<td>Scope, Stage, Manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting, with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

Caenorhabditis elegans transgéniques peuvent être facilement créées via la micro-injection d&#39;une solution d&#39;ADN plasmidique dans l&#39;une des gonades. L&#39;ADN plasmidique réorganise pour former concatémères extrachromosomique qui sont héritées de façon stable, mais pas avec la même efficacité que les chromosomes réelle 2. Un gène d&#39;intérêt est co-injecté avec un marqueur évident phénotypiques, comme rol-6 ou GFP, pour permettre la sélection d&#39;animaux transgéniques sous un microscope à dissection. Le gène exogène peut être exprimée à partir de son promoteur natif pour les études de localisation cellulaire. Alternativement, le transgène peut être piloté par un promoteur différent tissu-spécifique d&#39;évaluer le rôle du produit du gène dans la cellule ou un tissu particulier. Cette technique entraîne efficacement l&#39;expression des gènes dans tous les tissus de C. elegans à l&#39;exception des cellules germinales de l&#39;embryon ou au début 3. Création d&#39;animaux transgéniques est largement utilisé pour une gamme de paradigmes expérimentaux. Cette vidéo montre la procédure de micro-injection pour produire des vers transgéniques. Par ailleurs, la sélection et le maintien de lignées transgéniques stables C. elegans est décrite.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Cette vidéo montre la technique de microinjection dans la gonade de C. elegans pour créer des animaux transgéniques.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

52.7K vues.  University of Alabama. Cette vidéo montre la technique de microinjection dans la gonade de C. elegans pour créer des animaux transgéniques.

Vidéo: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection d&#39;embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Recherche

Biologie

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagerie C. elegans Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

L&#39;activation de l&#39;apoptose par micro-injection cytoplasmique du cytochrome C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Mesurer les effets des bactéries sur<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportement aide d&#39;un test de rétention d&#39;oeufs

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

La génération d&#39;transgénique<em&gt; Hydra</em&gt; Par micro-injection d&#39;embryons

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l&#39;utilisation des Métazoaires organisme modèle<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...