<p class="jove_content"&gt; Nous remercions le Dr Shuang Liu pour la lecture critique du manuscrit. Le PCL12 construction était un cadeau sous forme Dr. Christopher D. Link. Ce travail a été soutenu par deux Science Foundation subventions nationales (0842708 et 1026958) et une subvention AHA (09GRNT2250529) pour FS.</p

1. Construction des vers transgéniques <ol><li> Transformation. <ol><li> Préparer plaquettes d&#39;injection. Déposer une goutte d&#39;eau chaude, 2% d&#39;agarose dissous dans l&#39;eau, sur une lamelle de verre. Placer rapidement d&#39;une seconde lamelle sur la goutte et tapoter sur elle. Après l&#39;agarose est solidifié, des lamelles de diapositives à part, et cuire la lamelle-pad dans un four sous vide à 80 ° CO / N. </li><li> Tirez pipettes. Nous utilisons une Sutter P-97 Extracteur de tirer 1/0.5 mm OD / ID borosilicate capillaires avec filament. Les pipettes sont forgés à pointe fermée qui est cassé ouvert à un stade ultérieur. </li><li> Préparer le mélange d&#39;injection. Faire le mélange d&#39;injection contenant l&#39;ADN d&#39;intérêt (20 ng / l par construction) plus vide ADN plasmidique à une concentration finale de 150 ng / ul. Centrifuger le mélange d&#39;injection pour éliminer tout contaminant. Cette étape est cruciale car les contaminants réduisent l&#39;efficacité de la transformation. Transférer le top 5 pl (débris et autres contaminants s&#39;accumulent dans le fond) dans un nouveau tube à be utilisé dans l&#39;injection. </li><li> Chargez mélange d&#39;injection par capillarité. La partie inférieure de la pipette est immergée dans le mélange d&#39;injection. Typiquement 0,5 pi sont suffisantes pour injecter 100 vers. </li><li> Chargez pipette d&#39;injection. Insérez la pipette sur le support du micromanipulateur et casser ouvert en frottant sa pointe contre le bord d&#39;une lamelle montée sur une lame de verre ou encore contre les débris sur le pavé agarose. Il s&#39;agit d&#39;une étape cruciale que des conseils trop grand dommage que le ver et trop petits conseils sont facilement bouché. La qualité de la pointe cassée peut être jugée par la forme et surtout par le débit. Le débit peut être évaluée par la taille des bulles qui coule de l&#39;extrémité ouverte immergé dans une goutte d&#39;huile de 700 des halocarbures en réponse à une pression d&#39;injection. </li><li> Transfert vers de tampon d&#39;injection. Déposer une goutte de 700 huile hydrocarbure, un tampon d&#39;injection et de transférer plusieurs (1 ou 2 pour les débutants) vers à l&#39;huile. Utilisez un ver choisir de pousser les vers le bas sur la touche jusqu&#39;à ce que leY adhérer à l&#39;agarose. Worms doivent être orientés en rangées avec des côtés ventrales dans la même direction. Évitez de toucher la tête de vis. Si après plusieurs tentatives les vers parviennent pas à adhérer à la garniture, le remplacer par un tampon frais ou augmenter agarose épaisseur et / ou la concentration. </li><li> Insérer la pipette dans le ver. En déplaçant la scène, positionnez le ver sous la pipette. Positionner la pipette dans le noyau central de la gonade, car son cytoplasme est partagé par de nombreux noyaux des cellules germinales. Cela augmente la probabilité de livrer ADN injecté à de nombreux descendants. La pipette doit se trouver pratiquement parallèle à la vis sans fin (~ 15 ° -25 ° d&#39;angle). Pousser verticalement la pointe de la pipette vers le bas du corps de la vis sans fin jusqu&#39;à ce que la peau est enfoncée. Puis appuyez doucement sur le manipulateur pour induire l&#39;insertion de pointe. Pour de meilleurs résultats injecter deux gonades. </li><li> Injecter la solution d&#39;ADN. Appliquer une pression à la pipette jusqu&#39;à ce que la houle gonades. Arrêter l&#39;écoulement et tirer le ver au large de la pipette. Testez l&#39;aiguille pour le flux, puis déplacezà l&#39;autre vis sans fin et les étapes d&#39;injection de répétition. </li><li> Récupérer les vers: Ajouter une goutte (~ 10 pi) de tampon de récupération sur les vers et incuber jusqu&#39;à ce que les vers commencent la natation. Ajouter un volume égal de M9, attendre jusque vers reprendre la natation et répéter plusieurs fois jusqu&#39;à ce que la solution est surtout M9. Transférer individuellement vers de plaques ensemencées. </li></ol></li><li> Intégration. <ol><li> Placez 40 en bonne santé, bien nourris, L4 vers dans une assiette fraîche </li><li> Irradier avec γ-ray avec 4000 rads pour 40 min. Transfert vers irradiés (P0), en OP50 plaques ensemencées frais (4 worms / plaque). Les vers peuvent également être irradiés avec une dose de 300 J / m 2 UVs. </li><li> Transfert 10-20 transformants F1 à partir de chaque plaque d&#39;assiettes individuelles, étiqueter les plaques avec le P0 origine correspondant. </li><li> Simple à 2-4 transformants F2 pour chaque F1 à plaques séparées. Vérifier la descendance F3 de transmission de 100% du marqueur de la transformation. Typiquement, 1-3% de la descendance d&#39;une wil ver irradiéJe dois un événement d&#39;intégration. </li><li> Faire stocks de trois ou plusieurs lignes de transformants indépendants. </li></ol></li></ol> 2. Tests comportementaux <ol><li> Age-synchronisation. <ol><li> Croître vers de la norme 10 cm plaques NGM + OP50 E. coli jusqu&#39;à une grande population d&#39;adultes gravides est atteint (3-5 jours). </li><li> Recueillir les vers dans des tubes de 50 ml Falcon en les suspendant dans un tampon M9 1 ml. </li><li> Ajouter 5 ml tampon M9 et centrifuger à 450 g pendant 3 min. Rejeter le surnageant. Répétez 3-4x. </li><li> A la fin de la dernière centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter 10 volumes de solution d&#39;hypochlorite de base (0,5 M NaOH, 1% d&#39;hypochlorite fraîchement mélangé) pour les vers granulés. Incuber à température ambiante pendant ~ 10 min. La réaction de lyse peut être contrôlée en plaçant une goutte de la réaction de lyse sur une lamelle couvre-objet et en examinant les vers au microscope. Lorsque environ 80% des vers sont cassé la réaction doit être arrêté. </li><li> Arrêter la réaction de lyse par Adding le même volume de tampon d&#39;oeufs stériles. </li><li> Ramassez les oeufs (et des carcasses) par centrifugation à 450 g pendant 5 min. </li><li> Lavez les œufs avec le tampon d&#39;œuf stérile 2-3x. </li><li> L&#39;incubation O / N dans un tampon M9 et les graines sur des plaques NGM standard. </li></ol></li><li> Essai de chimiotaxie. <ol><li> Préparer plusieurs morceaux de gélose environ 0.5x0.5x0.5 cm. Nous déposons l&#39;agar-agar dans une plaque de 10 cm et on coupe les morceaux de gélose à partir de là. </li><li> Faire tremper le morceau de gélose dans une solution contenant l&#39;attractif souhaité (à saturation, les concentrations quasi-saturation) pendant 2 heures. Attractifs typiques sont lysine (0,5 M), biotine (0,2 M). </li><li> Déposez un morceau de gélose dans une plaque d&#39;essai de 10 cm dans lequel l&#39;emplacement d&#39;un point de test et une tache de contrôle ont été marquées (figure 1A). Permettre l&#39;équilibrage et la formation d&#39;un gradient O / N (figure 1B). Préparer 5 plaques pour une expérience unique. </li><li> Avant l&#39;expérience, ajouter 10 ul de 20 mM NaN3 (anesthetic) à chaque endroit. </li><li> Placez 20 vers l&#39;âge synchronisées dans le centre de la plaque. Placer la plaque dans l&#39;incubateur à 20 ° C. </li><li> Après 1 heure, compter les animaux sur les points de test / contrôle et de calculer l&#39;indice de chimiotactisme (CI) comme suit: <img alt="Équation 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> où N, N essai et N Cnt., indiquent le nombre total d&#39;animaux, le nombre d&#39;animaux dans les lieux d&#39;essai et le nombre d&#39;animaux à l&#39;endroit de contrôle. </li></ol></li></ol> 3. Primaire embryonnaire Culture cellulaire <ol><li> Lyse vers tel que décrit dans l&#39;âge de la synchronisation. </li><li> Arrêter la réaction de lyse en ajoutant le même volume de tampon d&#39;œufs stériles et centrifuger à 450 g pendant 5 min. Jetez doucement surnageant en prenant soin de ne pas perdre oeufs granulés. Répétez 2 à 3 fois ou jusqu&#39;à ce que le surnageant soit clair. </li><li> Reprendre oeufs granulés (et des carcasses) Dans un tampon d&#39;oeuf stérile 2 ml et ajouter 2 ml de solution stérile de 60% de saccharose dans un tampon d&#39;oeuf. Mélanger cette solution jusqu&#39;à ce que les œufs sont complètement remises en suspension (comme ils ont tendance à former des amas sous centrifugation) à la main ou au vortex. </li><li> Centrifuger à 450 g pendant 15 min. </li><li> Soigneusement transférer surnageant (contenant les oeufs) dans un tube stérile. Jeter culot qui contient les carcasses et autres sous-produits de lyse. </li><li> Retirez le saccharose résiduel en remettant en suspension les oeufs dans un tampon d&#39;oeuf et la centrifugation à 450 g pendant 5 min. Recueillir délicatement et jeter le surnageant. Répétez 3x. </li><li> Sous une hotte laminaire remettre en suspension les œufs culot dans un tampon d&#39;œuf stérile contenant 1 U / ml chitinase à température ambiante pour digérer les œufs. Après 30 min de commencer à surveiller la réaction (sous un microscope de culture cellulaire inversée). Chaque lot de chitinase a une activité un peu différente. Typiquement, la digestion est terminée en 1 heure. </li><li> Quand environ 70-80% des œufs sont digérés par chitinase ajouter CM-15 (L-15 de culture cellulaire medium contenant 10% de sérum de veau foetal, 50 U / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine). Dissocier les cellules à l&#39;aide d&#39;une seringue avec une jauge 27. Filtrer la suspension cellulaire avec un 5,0 um filtre pour éliminer les embryons intacts, des amas de cellules et de larves. </li><li> Pellet de la suspension cellulaire dissociée par centrifugation à 450 g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre le culot dans un milieu de culture cellulaire CM-15. </li><li> cellules dissociées de plaque sur des lamelles de verre préalablement enduit avec de la lectine d&#39;arachide (0,1 mg / ml) dissous dans l&#39;eau. Remarque: les cellules doivent adhérer au substrat afin de se différencier. </li><li> Les cellules peuvent être conservés à température ambiante (16-20 ° C) dans l&#39;air pendant plus de 2 semaines. </li></ol>

<ol>
	<li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lewy+body+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li><li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myositis:+review+of+recent+literature.">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li><li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies.">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li><li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer's+disease+A+beta40/42+amyloid+peptides.">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li><li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding.">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li><li>DL, R. i. d. d. l. e., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+II.">C. elegans II.</a> Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).</li><li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+role+of+k++channel+oxidation+in+Mammalian+brain.">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li><li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging.">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li><li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q-VD-OPh,+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties.">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li><li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous décrivons ici une approche combinée, pour étudier les aspects cellulaires et moléculaires de l&#39;aide amylopathies C. elegans. Les avantages de cette approche sont les suivants: 1.) Faible coût C. elegans est maintenu dans un plat normale Petri ensemencées avec des bactéries, à la température ambiante. 2) génétique puissants. Les animaux transgéniques peuvent être obtenus en quelques mois et un large éventail de séquences promotrices est disponible pour conduire l&#39;expression d...

bêta-amyloïde (Aß) est un peptide de 36 à 43 acides aminés qui est formé après clivage séquentiel de la protéine précurseur de l&#39;amyloïde (APP) par β et γ d&#39;une secrétases. La γ-sécrétase traite l&#39;extrémité C-terminale du peptide Aß et est responsable de ses longueurs variables 5. Les formes les plus courantes de Aß sont Aß 40 et Aß 42, ce dernier étant le plus souvent associée à des états pathologiques tels que AD 5. A des concentrations élevées Aß forme β-feuilles qui s&#39;agrègent pour former des fibrilles amyloïdes 6. Fibrilles dépôts sont la principale composante des plaques séniles autour des neurones. Les deux plaques et diffusables, les oligomères de Aß non-plaque, sont pensés pour constituer le sous-jacent pathogènes de Aß. Etude en laboratoire des amylopathies neuronales est compliquée par le fait que ces conditions progrès avec le temps. Par conséquent, il est important de développer animaux génétiquement traitable modèles-complémentaire à des souris-avec durée de vie courte. Ces modèles peuvent être utilisés pour élucider les aspects spécifiques de amylopathies-général cellulaire et moléculaire et en raison de leur simplicité, de les aider à capturer l&#39;essence du problème. Le ver Caenorhabditis elegans chutes est cette catégorie. Il a une durée de vie courte, ~ 20 jours et dans les processus cellulaires de base supplémentaires, y compris la régulation de l&#39;expression génique, le trafic des protéines, de la connectivité neuronale, synaptogenèse, la signalisation cellulaire et la mort sont similaires à des mammifères 7. Les caractéristiques uniques du ver comprennent la génétique puissants et l&#39;absence d&#39;un système de navire, qui permet d&#39;étudier les lésions neuronales indépendamment des dommages vasculaires. D&#39;autre part, l&#39;absence d&#39;un cerveau limite l&#39;utilisation de C. elegans pour étudier de nombreux aspects de la neurodégénérescence. En outre, la reproduction et l&#39;identification des distributions anatomiques des lésions ne peuvent être exécutées dans cet organisme. Autre limitetions comprennent la difficulté d&#39;évaluer les différences dans les profils d&#39;expression des gènes et des troubles du comportement complexe et fonction de mémoire. Nous décrivons ici les méthodes pour générer C. elegans modèles de amylopathies.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>1. NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J637</td>
			<td>17 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-peptone</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J636</td>
			<td>2.5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 975 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3045</td>
			<td>1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>25 ml of 1M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Potassium phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>108.3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>35.6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>118 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>48 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4880</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. CM-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11415</td>
			<td>450 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. Other Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon 700 oil</td>
			<td>Halocarbon Products</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &mu;m Acrodisc Syringe Filter</td>
			<td>PALL Co.</td>
			<td>4199</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6137-5UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans model system for amylopathy study

Amylopathy est un terme qui décrit la synthèse anormale et l&#39;accumulation de bêta-amyloïde (Aß) dans les tissus avec le temps. Aß est une caractéristique de la maladie d&#39;Alzheimer (MA) et se trouve dans la démence à corps de Lewy, la myosite à inclusions et l&#39;angiopathie amyloïde cérébrale 1-4. Amylopathies développer progressivement avec le temps. Pour cette raison, les organismes simples avec une durée de vie courte peuvent aider à élucider les aspects moléculaires de ces conditions. Ici, nous décrivons les protocoles expérimentaux pour étudier la neurodégénérescence Aß induite par l&#39;utilisation des Caenorhabditis elegans du ver. Ainsi, nous construisons vers transgéniques par injection d&#39;ADN codant pour Aß humain 42 dans les gonades syncytial des hermaphrodites adultes. Des lignées transformantes sont stabilisés par une intégration mutagenèse induite. nématodes âge synchronisée par la collecte et l&#39;ensemencement de leurs oeufs. La fonction de neurones exprimant Aß 42 est testé dans des essais comportementaux opportuns (essai de chimiotaxies). Cultures primaires de neurones obtenus à partir d&#39;embryons sont utilisés pour compléter les données comportementales et de tester les effets neuroprotecteurs de composés anti-apoptotiques.

Avec nos protocoles, nous étudions les effets de l&#39;homme Aß 42 oligomères sur la fonction neuronale 8. Un fragment codant Aß humain 42 et le signal de séquence codant pour un peptide artificiel de vecteur d&#39;incendie pPD50.52 été amplifié à partir d&#39;assemblage PCL12 9 en utilisant des amorces qui introduisent un site d&#39;une endonucléase de restriction Sma aux extrémités. Le fragment a été ensuite inséré dans une construction contenant une séquenc...

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A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le ver<em&gt; C. elegans</em&gt;. Nous montrons comment construire vers exprimant Aß humain<sub&gt; 42</sub&gt; Dans les neurones et comment tester leur fonction dans des tests comportementaux. Nous montrons en outre comment obtenir cultures primaires de neurones qui peuvent être utilisés pour les tests pharmacologiques.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

10.4K vues.  University of Medicine and Dentistry of New Jersey. Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le ver C. elegans. Nous montrons comment construire vers exprimant Aß humain 42 Dans les neurones et comment tester leur fonction dans des tests comportementaux. Nous montrons en outre comment obtenir cultures primaires de neurones qui peuvent être utilisés pour les tests pharmacologiques.

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Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans</emModèle>

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Recherche

Neurosciences

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Méthodes pour étudier les mécanismes d&#39;action des antipsychotiques dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un test pour mesurer les effets de l&#39;éthanol sur la vitesse de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambres agarose à long terme de l&#39;imagerie calcique<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

UNE<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensemble d&#39;aversion en cuivre à base d&#39;état nutritionnel

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

Imagerie des épines dendritiques chez Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Évaluation de la dynamique et de l’orientation des microtubules dans les neurones de Caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...