Ce travail a été soutenu par des fonds d&#39;amorçage de l&#39;Université de Pittsburgh et aux NIH AG028977 ALF

Aperçu Traditionnellement les vers transgéniques ont été générées par micro-injection d&#39;ADN transgénique dans le C. elegans germinale 1,2,3,4. Bien réussie, cette approche nécessitait des équipements spécialisés et le développement de l&#39;expérience avec l&#39;anatomie ver et la technique de micro-injection. Plus récemment bombardement biolistique a été développé comme une autre approche qui utilise des particules d&#39;or enrobées d&#39;ADN pour introduire un ADN étranger dans le 5,6 germinale. Cette approche exige un investissement de moins de temps en termes de pratique pour réussir. Le bombardement biolistique de C. elegans pour générer des vers transgéniques a une faible efficacité au niveau du ver individuels afin de succès nécessite une grande quantité d&#39;animaux. Ceux-ci peuvent être cultivées de diverses façons, mais nous utilisons des plaques d&#39;oeuf afin de réduire le travail et le nombre de plaques impliquées. Notre protocole commence avec la préparation des plaques d&#39;œufs et les vers, puis se concentre sur le protocole de bombardement à l&#39;aide de la Bio-Rad PDS-1000/He Hepta système. Nous avons adapté notre protocole en partie de travaux de Berezikov et al 7. Avec les bombardements, le gène unc-119 est généralement utilisé comme marqueur pour les animaux transgéniques. Worm souches portant cette mutation sont sévèrement coordination et à peine bouger, sont plutôt moche en apparence, et sont incapables de former des larves dauer 8. Le dauer est une étape de remplacement des larves qui est utilisée pour retarder le développement d&#39;un adulte reproducteur dans des conditions défavorables, et l&#39;entrée en dauer est réglementée par de multiples gènes 9. Plusieurs souches porteuses du gène unc-119 sont disponibles à partir du C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). L&#39;original DP38 souche (UNC-119 (ED3)) effectue également une formation sans lien avec Dauer-constitutifs (daf-c) mutation qui pourrait affecter les expériences en aval. Plusieurs laboratoires ont outcrossed cette mutation, et la souche HT1593 est disponible à partir de la CCG. Nous trouvons que les animaux transgéniques sont un peu plus facile à identifier avec la souche DP38 et ont tendance à utiliser cette souche pour la création d&#39;animaux transgéniques. Lorsque nécessaire, nous utilisons HT1593 au croisement des vers transgéniques pour enlever la mutation daf-c. Obtenir le DP38 les vers de se développer est l&#39;une des plus lentes étapes dans le protocole afin que nous conserver un stock de plaques de croissance tout en préparant les transgènes. L&#39;expression du marqueur unc-119 avec le gène d&#39;intérêt permet d&#39;identifier facilement les animaux exprimant le transgène basée sur le sauvetage de la motilité normale et 5 la taille du corps. L&#39;UNC-119 du gène peut être obtenu à partir de plusieurs sources, et les vecteurs en utilisant l&#39;ADN génomique unc-119, unc-119 promoteur et d&#39;ADNc, et l&#39;ADN génomique pour les petits C. briggsiae gènes sont utilisés 8,10. Nous avons récemment décrit un protocole simple d&#39;ajouter une cassette unc-119 à un plasmide contenant un gène de résistance à l&#39;ampicilline par recombinaison homologue 11 et une méthode pour modifier fosmides ver pour porter le gène unc-119 par recombinaison Cre-lox pour générer des animaux transgéniques 12. Les plasmides sont disponibles à partir Addgene Inc (Cambridge, MA). Alors que les efforts impliqués dans l&#39;exécution d&#39;un bombardement unique est significatif mais gérable, le travail supplémentaire à effectuer des bombardements multiples sur une seule journée est minime. Par conséquent, nous avons l&#39;habitude pôle de la production des vers transgéniques pour diminuer le travail nécessaire pour générer chacun. 1. La préparation des plaques d&#39;oeufs Les vers unc-119 mutantes sont difficiles à croître sur des plaques NGM standard, car grâce à leur mobilité réduite, ils ont tendance à mourir de faim sur les pièces d&#39;une plaque en d&#39;autres parties de la plaque encore contenir des aliments. Plaques d&#39;œufs résoudre ce problème que la couche épaisse des aliments sur des plaques d&#39;oeuf permet unc-119 vers de terre pour ramper plus facilement et à prendre sur toute la plaque 7. Les plaques d&#39;œufs ont également l&#39;avantage de soutenir la croissance d&#39;un grand nombre de vers afin que moins de plaques sont nécessaires 13. Habituellement 5 plaques d&#39;œufs sont suffisantes pour pousser les vers pour un bombardement. La recette ci-dessous fait environ 50 plaques, mais peuvent être réduits de moitié à faire moins, si désiré. Les plaques d&#39;oeuf peut devenir facilement contaminés afin que nous utilisons à la fois les antibiotiques et les antifongiques dans les plaques et de n&#39;utiliser que des œufs produits par traitement à l&#39;hypochlorite pour l&#39;ensemencement des plaques. Jour 1: <ol><li> Préparer LB (400 ml) dans une bouteille de 500 ml. Autoclave pendant 20 minutes. </li><li> Verser environ 50 plaques de 10 cm en utilisant une NGA NGA litres avec 2% d&#39;agar. Nous ajoutons nystatine 10 ml par litre et la streptomycine à 200 pg / mL 13. </li><li> Cultiver une culture de 40 ml de nuit de OP50-1 dans LB avec 200 ug / ml de streptomycine. Cette souche est résistante la streptomycine et disponible auprès de la CCG. </li><li> Autoclave une bouteille de 500 ml pourlendemain. </li></ol> Jour 2: <ol><li> Séparez les jaunes d&#39;œufs de poule 10 dans le flacon stérile. Nous utilisons un séparateur jaune (disponible dans les magasins des ménages, y compris la cible). Shake. </li><li> Amener le volume à 400 ml avec LB. Secouer </li><li> Incuber à 60 ° C pendant 1 heure. </li><li> Laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Ajouter 40 ml d&#39;OP50-1. Secouer </li><li> Distribuer 5-8 ml de mélange par plaque. </li><li> Laisser les plaques à régler à la température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li></ol> Jour 3: <ol><li> Verser délicatement le liquide restant hors de plaques. Laisser sécher avec des couvercles sur les à température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li></ol> Jour 4: <ol><li> Mettez les plaques dans une boîte ou un sac en plastique et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. Ces plaques semblent être OK pour utiliser pendant 1-2 mois. </li></ol> 2. Semis Plaques Egg <ol><li> Développez le DP38 vers sur 6 assiettes NGA cm en ajoutant OP50 concentrée sur des plaques récemment affamés. Pour un bombardement simple, nous utilisons ~ 6 petites assiettes à des plaques de semences oeuf 5. Pour de multiples bombardements, nous utilisons les petites plaques de semences au lieu plaques 2 enrichi peptonée avant d&#39;ensemencer les plaques d&#39;oeufs. </li><li> Isoler les œufs des vers DP38 via l&#39;utilisation d&#39;hypochlorite de 13,14. Resuspendre les oeufs dans stériles tampons S-basale ou M9 13,14. </li><li> Ajouter les oeufs (&gt; 10 000 par plaque) pour le nombre approprié de plaques d&#39;oeuf. Cultivez les vers sur des plaques d&#39;oeuf à 20 ° C pendant 7-10 jours pour l&#39;utilisation d&#39;un bombardement. Les plaques seront prêts à utiliser une fois que les vers ont commencé à effacer la nourriture de l&#39;assiette. Ces plaques sont vraiment difficiles à affamer et croissante pour des durées plus longues seront d&#39;améliorer le rendement ver. </li></ol> Bombardement Nous préparons le stock d&#39;or à l&#39;avance et le garder conservés à 4 ° C pour les utiliser. Il faut également des souillures et tachetée 10 cm plaques NGA. Les plaques doivent être sans tache versé à l&#39;avance et a permis de sécher complètement pour faciliter l&#39;absorption du liquide ajouté avec les vers. Le jour du bombardement, nous laver les vers d&#39;abord, puis commencer à préparer l&#39;ADN des particules revêtues d&#39;or. Nous ajoutons ensuite les vers sur les plaques sans tache NGA et terminer le lavage des particules d&#39;or et de les transférer au macrocarriers. Préparation de particules d&#39;or: <ol><li> Peser 60 mg de particules d&#39;or dans un tube 1.7mL et laisser tremper dans de l&#39;éthanol 70% pendant 15 min. Centrifuger brièvement pour précipiter les particules d&#39;or. </li><li> Lavez 3 fois dans de l&#39;eau stérile et centrifuger brièvement à chaque fois pour collecter de l&#39;or. </li><li> Resuspendre l&#39;or dans 1 ml de glycérol stérile à 50%. C&#39;est la solution stock d&#39;or et de particules peuvent être stockés pendant des mois à 4 ° C. </li></ol> Worms: <ol><li> Faites flotter le DP38 vers les plaques en oeuf avec le tampon S-basale ou M9 et les transférer à un tube de 50 ml conique. </li><li> Conserver les tubes sur le banc jusqu&#39;à ce que les vers sont dans le fond. Puis aspirez le tampon et ajouter des nouvelles S-basale ou M9. Lavez 2 ou 3 fois, jusqu&#39;à ce tampon est relativement claire de débris. Gardez les vers à cette étape jusqu&#39;à ce que le revêtement ADN est terminée. </li><li> Aspirer et laisser environ 2-3 ml de tampon par des vers dans un bombardement. Transfert à une plaque de 10 cm NGA souillures sur la glace. Il est important de minimiser le volume transféré comme la plaque NGA auront besoin de sécher complètement avant de bombardement. Soyez sûr de couvrir toute la surface de la plaque avec les vers. </li><li> Laisser sécher la plaque sur la glace. La glace empêcher les vers de grumeaux pendant le séchage. </li></ol> Cette étape est importante: la plaque doit être sec et les vers dispersé uniformément sur la plaque de NGA. Garder les vers sur la glace les empêche de se déplacer sur la plaque et l&#39;agrégation en tas. Préparation d&#39;ADN (pour un bombardement): <ol><li> Mélanger dans un tube 1.7mL: <ul><li> 50 pl des particules d&#39;or. Resuspendre soigneusement avant d&#39;ajouter. </li><li> 50 pl d&#39;ADN (10-15ug). Nous voyons peu de différence entre l&#39;ADN circulaire ou linéaire. Habituellement, nous utilisons Qiagen cartouches Midiprep pour la purification d&#39;ADN (Qiagen Inc, Valencia, CA). </li><li> 50 pl 2,5 M CaCl 2. Cette solution est stable pendant plusieurs semaines à température ambiante. </li><li> 20 pi 0,1 M spermidine. La spermidine est instable en solution aqueuse. Nous faisons aliquotes spermidine 70μl et conserver à -20 ° C. Nous ajoutons ensuite 1 ml d&#39;eau juste avant l&#39;utilisation pour obtenir une solution 0.1M. Cette solution doit être préparée fraîche pour chaque bombardement. En général, nous vortex les particules d&#39;or dans un tube 1.7mL à basse vitesse et ajoutez le CaCl 2, de l&#39;ADN et la spermidine / goutte à goutte tout en protamine vortex. Pour les gens qui ont transfectées avec du phosphate de calcium de cette technique est familière. Nous avons également utilisé la protamine lieu de spermidine avec de très bons résultats 15. Nous préparons une nouvelle solution (1mg/ml) dans de l&#39;eau et nouse 50 pl au lieu de la 20 pi de spermidine. Si nous utilisons la protamine, nous avons l&#39;habitude incuber le mélange à la température ambiante pendant 10 minutes au lieu de placer sur la glace. Protamine n&#39;a pas besoin d&#39;être conservés congelés et est une poudre au lieu d&#39;un liquide. </li></ul></li><li> Incuber le mélange sur la glace pendant 30 minutes, mélangez et périodiquement pour maintenir les particules d&#39;or en suspension. Puis centrifuger brièvement et aspirer le surnageant. </li><li> Laver avec de l&#39;éthanol 300μl de 70%. Spin brièvement. </li><li> Laver avec de l&#39;éthanol à 100% 1ml. Spin brièvement. </li><li> Remettre en suspension dans 170μl d&#39;éthanol 100%. </li></ol> Préparation de macrocarriers: <ol><li> Rincez 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) dans le 2-propanol. Mettez-les sur du papier absorbant et les laisser sécher à température ambiante. </li><li> Ajouter 20 pi de l&#39;ADN / or mélange au centre de chaque macrosupport. Soyez sûr à droite avant le vortex de pipetage pour garder l&#39;or en suspension. </li><li> Laissez l&#39;éthanol s&#39;évapore. </li></ol> 3. Bombardement Veillez à effectuer un bombardement vierge avant l&#39;expérience de rincer l&#39;hélium dans le système. <ol><li> Mettez la pompe à vide et fermer piège pompe à vide. Nous utilisons une pompe à vide sans huile. </li><li> Allumez le réservoir d&#39;hélium. Vérifier que la pression est ≥ 2200psi. </li><li> Disque de rupture Wet (1350 psi) dans le 2-propanol, la mise en conservant plafond pour hepta adaptateur. </li><li> Vis adaptateur dans PDS-1000 du système et serrez avec la clé dynamométrique fournie. </li><li> Placez le 7 macrocarriers dans le support et le siège avec l&#39;outil fourni. Puis mettre un écran d&#39;arrêt hepta et le fond sur le support. Retournez le support et placez sur la deuxième étagère du haut. Le côté or repéré de l&#39;macrocarriers doit être orientée vers le bas à ce point. </li><li> Alignez les trous dans le haut du porte-macrosupport avec les prises de l&#39;adaptateur hepta. </li><li> Placer la plaque recouverte d&#39;NGA vers (hors couvercle) sur l&#39;étagère du bas dans la chambre de bombardement. </li><li> Totalement ouvert le vide débit bouton sur le PDS-1000. Appuyez sur le bouton jusqu&#39;à ce vac chambre atteint 26 En Hg. Puis passez à tenir la position pour maintenir le vide. </li><li> Appuyez et maintenez le bouton de tir jusqu&#39;à ce ruptures disque. Cela se produira lorsque la pression atteint 1350psi. Parfois, cela prend 50 à 20 secondes pour se produire. Relâchez le bouton. </li><li> Communiqué de vide de la chambre (position d&#39;évent), et retirez la plaque. </li><li> Tourner à vide et hors d&#39;hélium. </li><li> Incendie à plusieurs reprises jusqu&#39;à la ligne ne contient pas d&#39;hélium (jauge d&#39;hélium doit marquer 0 psi). </li><li> Éteignez le système PDS-1000. </li></ol> La récupération après le bombardement Worm: <ol><li> Laisser la plaque bombardés à 20 ° C pendant 20 minutes. </li><li> Float les vers de la plaque avec 10 ml de tampon S-basale ou M9. </li><li> Mettez les vers 0.5mL le 20 - 10 cm repéré plaques NGA. </li><li> Laisser à 20 ° C de température ou la salle (22-24 ° C) pendant environ 2 semaines avant de vérifier les vers secourus. </li><li> Ecran pour les vers avec le phénotype unc-119 (+) avec un microscope à dissection. Le moment optimal pour le dépistage est, après les plaques ont faim, depuis les vers ont sauvé avantage de survie par rapport aux non-secourues vers. </li><li> Générer une ligne individuelle de chaque plaque de 10 cm qui contenaient des vers secourus. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le succès du protocole en ce qui concerne l&#39;obtention d&#39;animaux transgéniques dépend du transgène particulier. Pour le promoteur: transgènes rapporteur GFP, nous avons obtenu jusqu&#39;à 20 lignes. Un résultat plus typique est de 30 à 10 lignes. Jusqu&#39;à 30% des lignées transgéniques sont des lignes intégrées, mais cela est aléatoire et nous allons effectuer des bombardements multiples sur une seule journée, si une ligne intégrée est particulièrement souhaitée.

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Bombardement biolistique est une méthode simple pour introduire un ADN étranger dans de nombreux organismes, y compris C. elegans 1,5,6,7,16. Elle repose sur des particules d&#39;or formant un complexe avec l&#39;ADN en présence de CaCl 2. Polyamines cationiques, tels que la spermidine, de protéger l&#39;ADN de la dégradation de la nucléase in vivo. Depuis la spermidine est une molécule instable, il est important de le stocker dans de petites aliquotes à -20 ° C, et de faire la bo...

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Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gold particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Inbio gold</td>
<td>BD021</td>
<td>1micron</td>
</tr>
<tr>
<td>Midiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td> P4505</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macrocarriers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2335</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDS-1000/He Hepta System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2257</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rupture disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nystatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N1638</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP</td>
<td>100556</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of transgenic c. elegans by biolistic transformation

Le nombre de laboratoires utilisant le C nématodes vivant libre elegans est en croissance rapide. La popularité de ce modèle biologique est attribué à un temps de génération rapide et courte durée de vie, entretien facile et peu coûteux, génome entièrement séquencé, et le tableau des ressources et des animaux mutants ARNi. De plus, l&#39;analyse de la C. elegans du génome a révélé une grande similitude entre les vers et les vertébrés supérieurs, ce qui suggère que la recherche dans les vers pourrait être un complément important aux études effectuées chez la souris tout ou cellules cultivées. Une partie puissant et important de la recherche ver est la possibilité d&#39;utiliser des animaux transgéniques pour étudier la localisation des gènes et leur fonction. Les animaux transgéniques peuvent être créées soit par micro-injection de la lignée germinale ver ou par l&#39;utilisation de bombardement biolistique. Bombardement est une technique plus récente et est moins familier à un certain nombre de laboratoires. Nous décrivons ici un protocole simple de générer des vers transgéniques par bombardement biolistique avec des particules d&#39;or en utilisant le Bio-Rad PDS-1000 du système. Par rapport à la microinjection d&#39;ADN dans les cellules germinales hermaphrodites, ce protocole a l&#39;avantage de ne pas nécessiter de compétences particulières de l&#39;opérateur en ce qui concerne l&#39;identification d&#39;anatomie ver ou d&#39;effectuer la microinjection. En outre plusieurs lignées transgéniques sont généralement obtenus à partir d&#39;un bombardement unique. Aussi, contrairement à la micro-injection, bombardement biolistique produit des animaux transgéniques avec les deux tableaux extrachromosomique et des transgènes intégrés. La capacité d&#39;obtenir des lignées transgéniques intégrés permet d&#39;éviter l&#39;utilisation de protocoles mutagène d&#39;intégrer l&#39;ADN étranger. En conclusion, le bombardement biolistique peut être une méthode intéressante pour la production d&#39;animaux transgéniques, en particulier pour les enquêteurs ne s&#39;intéressent pas à investir le temps et les efforts nécessaires pour devenir habile à la microinjection.

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Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Des vers transgéniques sont couramment utilisés dans<em&gt; C. elegans</em&gt; Recherche. Décrite est un protocole simple, mais efficace, d&#39;introduire des transgènes dans les vers utilisant bombardement biolistique avec des particules d&#39;or enrobées d&#39;ADN. L&#39;effort et les résultats des bombardements se comparent favorablement avec microinjection pour la génération d&#39;animaux transgéniques.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

21.8K vues.  University of Pittsburgh. Des vers transgéniques sont couramment utilisés dans C. elegans Recherche. Décrite est un protocole simple, mais efficace, d'introduire des transgènes dans les vers utilisant bombardement biolistique avec des particules d'or enrobées d'ADN. L'effort et les résultats des bombardements se comparent favorablement avec microinjection pour la génération d'animaux transgéniques.

Vidéo: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Recherche

Biologie

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Paradigmes pour la caractérisation pharmacologique de C. elegans mutants transmission synaptique

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Culture<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En Axenic Liquid Media et création d&#39;transgéniques Worms par bombardement de microparticules

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Methods Article

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique