This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency&#8217;s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

1 Préparation des spécimens biologiques pour Cryo-fracture / Gel-gravure <ol><li> Utilisation d&#39;une formulation de fixateur EM classique tel que glutaraldéhyde à 2% + 2% de paraformaldehyde dans du tampon phosphate 0,1 M pendant 1 heure. à effectuer la fixation primaire de tissus biologiques. REMARQUE: Bien qu&#39;il soit souhaitable de geler certains types de spécimens sans fixation préalable, universels pathogènes à diffusion hématogène précautions prescrivent fixation appropriée lorsque l&#39;échantillon est constitué de tissus humains. </li><li> Après la fixation primaire, rincer l&#39;échantillon dans le même tampon additionné de 0,2 M de saccharose de pas plus de 1 heure. </li><li> Transférer le spécimen dans une solution cryoprotectrice consistant en 25% de glycerol dans du tampon phosphate 0,1 M pendant au plus 1 h. </li></ol> 2. de congélation et de stockage des échantillons En avance cryofracturation <ol><li> Sélectionnez or ou cuivre spécimens talons de taille et la forme de l&#39;échantillon approprié en cours de traitement (Figure 4 </strong&gt;). </li><li> En utilisant des pinces fines de qualité et / ou de petit calibre de la position des aiguilles de seringues de petits fragments de l&#39;échantillon sur le haut d&#39;une tubulure de prélèvement de métal. <ol><li> Réduire la teneur en liquide de l&#39;échantillon à un collant, un peu comme la consistance de la colle par soutirage de liquide à partir du bord de l&#39;embout avec un papier filtre. </li><li> Pour répliques simples, utiliser de petites aiguilles de seringues de calibre pour créer un monticule de tissu sur le talon. Pour deux répliques, inverser autre talon et le positionner exactement sur ​​le talon et le placer légèrement sur ​​la surface de l&#39;échantillon créer un sandwich (figure 5A). N&#39;appuyez pas sur l&#39;échantillon d&#39;entre les deux talons. </li></ol></li><li> Remplir deux navires de Dewar isolés avec de l&#39;azote liquide. NOTE: Le premier récipient recevant un poste de métal contenant un petit puits qui est utilisé pour liquéfier un petit volume de gaz propane à partir d&#39;une bouteille du commerce (Figure 5B). Le deuxième bâtiment est un stockage partitionné / récipient de maintien d&#39;une brèvement maintenir les échantillons congelés dans l&#39;azote liquide. <ol><li> Utilisation de la buse du cylindre positionné dans le puits de propane, d&#39;ouvrir le robinet de la bouteille et permet au gaz de s&#39;écouler dans le puits de la première cuve où il se liquéfie. NB: ATTENTION !! PROPANE est explosif, peut causer des blessures AU CONTACT congélation et asphyxiant. Utilisez propane seulement dans une hotte chimique homologué pour cet usage en prenant soin aussi d&#39;éviter les sources d&#39;inflammation étrangers, en utilisant des vêtements de protection contre les températures basses, et le maintien d&#39;une ventilation adéquate. </li><li> Aussi rapidement que possible, ramasser les spécimen de montage avec une pince fine de qualité et plongent dans le gaz liquéfié dans le premier récipient pendant plusieurs secondes, puis transférer rapidement à la deuxième cuve de maintien de l&#39;azote liquide (figure 5B). </li><li> Une fois les échantillons sont congelés, magasin sous azote liquide avant d&#39;être prêt à transférer à l&#39;usine de congélation-fracture. Transfert talons à un azote liquide contenant de Dewar de stockage plus étendue pourstockage si on le souhaite, les soins ne doit cependant veiller à ne pas laisser les talons à décongeler. </li></ol></li></ol> 3 Fonctionnement de la cryofracture instrument et de traitement des échantillons <ol><li> Chargement des échantillons sur le support en laiton et dans la chambre <ol><li> Charger l&#39;échantillon d&#39;or talons en double réplique porte-échantillon du type de livret ou dispositif serrer sous azote liquide et y maintenir jusqu&#39;au moment de les placer dans la chambre de spécimen (figure 6). </li><li> Lorsque la chambre a atteint un vide élevé (environ 2 x 10 -6 mbar) et la scène a été refroidie à la température de l&#39;azote liquide, éteindre la pompe, purger la chambre, et positionner les échantillons talons monté sur la table de l&#39;échantillon le plus rapidement possible . </li><li> Mettez la pompe, rétablir vide poussé, et utiliser des contrôles de la scène et de la température de bras électroniques pour ajuster la température de la table de l&#39;échantillon à 100 ° C et de l&#39;azote liquide directement sur le bras microtome et bring à la température de l&#39;azote liquide. </li></ol></li><li> Le processus de fracture <ol><li> Après la réalisation de vide élevé, une température de l&#39;étage de -100 ° C et bras microtome à la température de l&#39;azote liquide, ouvrir à distance le support double réplique de l&#39;échantillon fracturation ainsi les spécimens sur les supports d&#39;échantillon (gel fracture_movie1.mov). </li><li> Dans le cas des échantillons destinés à la rupture suite à la gravure, l&#39;utilisation d&#39;une lame de rasoir maintenue dans un dispositif de serrage sur le bras microtome à raser (à savoir, la rupture) de la surface des échantillons à la place de l&#39;étape 3.2.1 (gel-etch_movie2.mov). </li><li> Si l&#39;étape de gravure par congélation est ajouté à réaliser, positionner le bras microtome refroidi sur les surfaces de rupture de l&#39;une à plusieurs minutes. NOTE: Cette manœuvre sera sublime (c&#39;est à dire, gravure) de l&#39;eau de la surface fracturée. L&#39;effet de cette manoeuvre est de révéler de véritables surfaces de cellules, la matrice extracellulaire et / ou d&#39;assemblages moléculaires par sublimation de l&#39;eau, en plus de framage faces traversant la bicouche lipidique des membranes. </li></ol></li><li> observation de métal et le soutien de réplique évaporation en utilisant des canons à électrons <ol><li> Activer le pistolet platine / électronique de carbone ou de la résistance et laisser évaporer une couche mince (environ 2 nm) de platine / carbone sur la surface fracturée d&#39;un angle de 30 ° - 45 °. Cela nécessite généralement environ à 15 - 20 sec. </li><li> Activez l&#39;électron de carbone ou de la résistance pistolet comme à l&#39;étape 3.3.1 et évaporer une mince couche de carbone à la surface de l&#39;échantillon fracturé directement à la verticale (90 °) à apporter un soutien à la réplique. Cela nécessite généralement environ à 15 - 20 sec. </li></ol></li><li> Récupération des répliques <ol><li> À la fin de la réplication observation et la stabilisation de carbone, éteignez la pompe à vide, évacuation de la chambre, et supprimer le spécimen de montage de l&#39;instrument. </li><li> En utilisant une paire de pinces fines de qualité supprimer chaque talon de modèle d&#39;or de la doubleréplique livret / pince et laisser décongeler pendant plusieurs secondes avant de baisser légèrement le talon sur une surface de l&#39;eau dans une plaque de place (Figure 7). REMARQUE: La réplique de carbone / platine contenant du matériau d&#39;échantillon adhérent flottera sur la surface de l&#39;eau. </li><li> Manœuvrer les répliques à l&#39;aide soit d&#39;une boucle de fil fin ou d&#39;une grille de microscope électronique de cuivre conventionnelle tenue par une pince de qualité fine et le transfert à une autre plaque spot contenant du dichromate de sodium à 5% dans de l&#39;acide sulfurique à 50% pour une à plusieurs heures. NOTE: Ce bain digère la matière de l&#39;échantillon biologique réelle de la réplique. Pleine force de Javel peut être remplacé par la solution d&#39;acide dichromate / sulfurique. </li><li> Lorsque la digestion est terminée, de transférer la réplique à une surface arrière de l&#39;eau propre et récupérer sur une grille de microscopie électronique en cuivre standard. (REMARQUE: Les répliques peuvent se fragmenter en petits morceaux lors de la digestion, mais même de très petites répliques peut contenir des informations importantes et devrait être retrieved et examiné.) magasin réplique soutenir les réseaux disponibles dans le commerce en cases de la grille où ils resteront stables pendant des années avec une manipulation en douceur. </li></ol></li></ol> 4. ultrastructurale examen de cryofracture / Répliques de gravure <ol><li> Voir répliques dans un microscope électronique en transmission à une tension d&#39;accélération typiquement de 50 à 80 kV. </li><li> Enregistrer des images pertinentes sur le film de TEM standard ou avec un appareil photo numérique haute résolution. </li></ol>

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The author has nothing to disclose.

Dans les années suivantes de son introduction et la disponibilité commerciale, la lyophilisation fracture / procédures de gravure ont été largement utilisés pour les enquêtes de structure de la membrane biologique. En effet, les meilleurs points de vue de certains des spécialisations structurales de membranes ont été obtenus dans des préparations cryofracture / gravure. Ces études ont contribué non seulement à la compréhension de l&#39;organisation structurale des membranes, mais aussi fourni des indicati...

Le concept et l&#39;application pratique de la transformation cryofracture des échantillons biologiques a été introduit par Steere 1 plus de la moitié il ya un siècle. L&#39;appareil approprié début composants disparates en une unité autonome de travail 1. L&#39;appareil initial a été modifié et affiné dans des instruments disponibles dans le commerce afin de répondre au besoin critique pour la manipulation à distance, le maintien de vide poussé, et l&#39;évaporation du carbone et des métaux pour produire une réplique appropriée pour l&#39;examen par microscopie électronique à transmission (figure 1 et figure 2). L&#39;instrument typique se compose d&#39;une chambre à vide élevé avec la table d&#39;échantillon et ayant des bras microtome peut réguler des débits d&#39;azote liquide (figure 1). La chambre abrite aussi deux canons à électrons, pour stabiliser une évaporation de carbone positionné à un angle de 90 ° de la platine porte-objet et l&#39;autre pour les platinum / carbone ombrage à un angle ajustable, 15 ° - 45 ° (Figure 2). L&#39;alimentation de l&#39;appareil est appliqué à faire fonctionner la pompe à vide et des panneaux électroniques réguler réglage de la température et de l&#39;électron contrôle des armes à feu. Conçu à l&#39;origine comme un moyen de parvenir à une meilleure imagerie de virus, de gel-fracture gagné encore plus de popularité en tant que technique pour l&#39;examen et l&#39;analyse des membranes cellulaires et leurs spécialisations 2, 3. En effet, cette procédure a fait partie intégrante d&#39;élucider les relations structure / fonction des cellules et des tissus et la plupart de ces études se tiennent comme des contributions classiques de biologie cellulaire et moléculaire 4-9. Le principal objectif et la justification du développement de la technique de congélation-fracture était de limiter les artefacts observables au microscope électronique la résolution découlant de la fixation chimique et traitement utilisé dans la microscopie conventionnelle d&#39;électrons biologique. Ici le but est de limiter chimiquefixation et à congeler l&#39;échantillon avec une vitesse suffisante et souvent en présence d&#39;un cryoprotecteur afin de limiter la formation de cristaux de glace et d&#39;autres objets de congélation. Plus récemment, cette technique a trouvé un regain d&#39;intérêt des biologistes moléculaires et chercheurs en science des matériaux pour l&#39;examen des nanoparticules et des nanomatériaux. Images cryofracture et gel-gravure présentent un caractère tridimensionnel et sont parfois confondus avec des photographies au microscope électronique à balayage. Cependant, les préparations de fracture par congélation sont examinés par microscopie électronique à transmission et leur contribution majeure aux études morphologiques en haute définition est la représentation unique d&#39;éléments de structure / fonction des membranes cellulaires. Cryo-fracture traitement est initié par congélation des cellules et des tissus avec une vitesse suffisante pour limiter la cristallisation de la glace et / ou avec l&#39;utilisation d&#39;agents cryoprotecteurs tels que le glycérol. Les échantillons sont ensuite fracturées sous vide et un représentantlica est généré par l&#39;évaporation de carbone et le platine sur la surface fracturée. L&#39;échantillon initial est digéré de la réplique qui est récupéré sur une grille standard de l&#39;échantillon EM. Une autre erreur d&#39;interprétation commune des images de fracture par congélation, c&#39;est qu&#39;ils représentent la surface des cellules. Toutefois, le principe de base de cryofracture est que les membranes biologiques sont répartis à travers la bicouche lipidique par le processus de rupture (figure 3). Ce processus dans les membranes biologiques donne deux faces de rupture, une qui indique l&#39;organisation de la moitié de la membrane adjacente au cytoplasme, le PF-face, et qui montre la moitié de la valve bimoléculaire de la membrane qui est adjacente à la extracellulaire milieu, l&#39;EF-face. La surface des cellules de véritables ne sont pas représentés dans les images de fracture par congélation, mais apparaissent uniquement lorsque l&#39;étape supplémentaire ultérieure de gel de gravure en suivant la procédure de rupture est utilisé. Afin de graver efficacement des échantillons prélevés antérieurement fracturés pour révéler detai de surfacel, les échantillons doivent être congelés à un rythme rapide et sans unetchablecryoprotectant. La gravure de l&#39;eau à partir de la surface de l&#39;échantillon fracturé qui révèlent des caractéristiques sous-jacentes est réalisée en positionnant le bras microtome de refroidissement au-dessus de la platine porte-objet de créer un différentiel de température entre la phase de maintien de l&#39;échantillon et le bras microtome de refroidissement qui amène l&#39;eau à se sublimer à partir de la surface. Lorsque l&#39;eau est sublimée à partir de la surface de l&#39;échantillon fracturé lors de la manoeuvre de gravure par congélation, puis les aspects de surfaces réelles de cellules, la matrice extracellulaire, des structures cytosquelettiques, et des assemblages moléculaires peuvent être révélées à haute résolution. Ainsi gel fracture et le gel gravure ne sont pas des termes interchangeables mais reflète un processus par étapes dont la dernière peut-être pas nécessaire ou souhaitable en fonction des besoins de l&#39;étude. Après la cryofracture / gel de mordançage procédures, les surfaces fracturées sont soumis à l &#39;évaporation dirigéstive couches de carbone et de platine, afin de fournir un appui et d&#39;imagerie à contraste de la réplique. Le / carbone imagerie évaporation du platine peut être unidirectionnelle ou rotatif et est accompli par résistance ou des canons à électrons. Observation unidirectionnelle à partir d&#39;un angle connu, généralement de 30 ° - 45 °, est utile dans l&#39;exercice de certains calculs morphométriques. Les échantillons qui ont été soumis à profondeur de gravure sont généralement rotatif ombre et les images résultantes de ces spécimens sont photographiquement inversés pour l&#39;évaluation. L&#39;historique ainsi qu&#39;un objectif actuel du / technique de gel-gravure cryofracture est de limiter la fixation et le traitement chimique spécimen objets qui sont associés à des procédures plus classiques de transmission de microscopie électronique. Cependant, cette technique présente un avantage substantiel dans sa capacité à conférer détail en trois dimensions, et donc de faciliter l&#39;acquisition de données morphométriques dans biologique, la science des matériaux, et nspécimens anotechnology. Procédures cryofracture et gel-gravure sont complexes et à multiples facettes et certains aspects de son application sont personnalisés. Cette présentation offre une vue de l&#39;enquête sur les principales caractéristiques du processus et le lecteur est renvoyé à des protocoles complets publiés 10, 11 afin de traiter les détails et personnaliser le processus pour les besoins de recherche spécifiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td>
			<td style="width:71px;">Balzers</td>
			<td style="width:119px;">BAF400T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard buffers</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">standard aldehyde fixatives</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium dichromate</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation</td>
			<td style="width:71px;">Technotrade International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Freon</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for electron microscopy</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy

Cryo-fracture / gel de mordançage décrit un processus par lequel des spécimens, généralement biologique ou nanomatériaux dans la nature, sont gelés, fracturée, et reproduit pour générer un rapport carbone / platine &quot;jeter&quot; destiné à l&#39;examen par microscopie électronique à transmission. Les échantillons sont soumis à des vitesses de congélation ultra-rapides, souvent en présence d&#39;agents cryoprotecteurs pour limiter la formation de cristaux de glace, à la suite de la fracture de l&#39;échantillon à la température de l&#39;azote liquide refroidi sous vide poussé. La surface résultante est répliqué fracturé et stabilisé par l&#39;évaporation de carbone et le platine à partir d&#39;un angle qui confère une surface tridimensionnelle détaillée de la distribution. Cette technique s&#39;est avérée particulièrement éclairante pour l&#39;étude des membranes cellulaires et de leurs spécialisations et a considérablement contribué à la compréhension de la forme cellulaire de la fonction des cellules liées. Dans ce rapport, nous passons en revue les exigences de l&#39;instrument et le protocole technique pour effectuergel-fracture, la nomenclature et les caractéristiques des plans de fracture associée, variations de la procédure conventionnelle, et les critères d&#39;interprétation des images de fracture par congélation. Cette technique a été largement utilisée pour l&#39;enquête ultrastructurale dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et est très prometteur comme une technique d&#39;imagerie moléculaire pour émergents, nanotechnologies, matériaux et études scientifiques.

Le principe clé de cryofracture l&#39;interprétation des images est que des plans de fracture traversent la bicouche lipidique des membranes donnant deux faces de rupture, appelé par convention, le PF-face (plasma fracture-face) et EF-face (extracellulaire fracture-face) (Figure 3). Le PF-face est la moitié de la membrane bicouche lipidique adjacente au cytoplasme de la cellule et l&#39;EF-face est la moitié de la membrane bicouche lipidique adjacent au milieu extracellulaire. La technique de cong?...

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Techniques et d&#39;améliorations du traitement cryofracture des échantillons biologiques et des nanomatériaux, pour examen par microscopie électronique à transmission de base sont décrites. Cette technique est une méthode préférée pour révéler caractéristiques ultrastructurales et les spécialisations des membranes biologiques et pour obtenir des données dimensionnelles et spatiales niveau ultrastructural en sciences des matériaux et produits de la nanotechnologie.

Éléments techniques fondamentales de cryofracture / Gel-gravure dans biologique Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K vues.  The University of North Carolina at Chapel Hill.  Techniques et d'améliorations du traitement cryofracture des échantillons biologiques et des nanomatériaux, pour examen par microscopie électronique à transmission de base sont décrites. Cette technique est une méthode préférée pour révéler caractéristiques ultrastructurales et les spécialisations des membranes biologiques et pour obtenir des données dimensionnelles et spatiales niveau ultrastructural en sciences des matériaux et produits de la nanote...

Vidéo: Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Recherche

Biologie

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse de microscopie du début de l&#39;embryogenèse dans les Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopie de levure Fission Lifecycle sexuelle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caractérisation de calcification Events Utilisation en direct optiques et Electron Microscopy Techniques dans un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Préparation et observation d&#39;échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Microscopie électronique à balayage par blocs série (SBF-SEM) d’échantillons de tissus biologiques

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Préparation de grille cryo-microscopique électronique pour des études résolues dans le temps à l’aide d’un nouveau système robotique, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Stratégies d’optimisation de l’acquisition de données de tomographie électronique cryogénique

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Congélation rapide à l’aide d’un dispositif de congélation sandwich pour une bonne conservation ultrastructurale des échantillons biologiques en microscopie électronique