Cette recherche a été financée par l&#39;Institut national de numéros de subventions santé R01NS050452 et R01EB009429. La fabrication des puces en porte à faux a été réalisée à l&#39;extérieur par des collaborateurs à l&#39;installation de NanoFabrication situé à l&#39;Université Cornell. Tout l&#39;équipement utilisé dans le procédé de fabrication en porte à faux a été localisé dans cette installation. Un merci spécial à Mandy Esch et Jean-Matthieu Prot pour leur aide avec cantilever micro-fabrication. animation de la vidéo de la fonctionnalité de console a été généré par Charles Hughes, Alex Zelenin et Eric Imperiale du Laboratoire de réalité synthétique à l&#39;ICU.

1.-faux fabrication de puces Détails illustrés des étapes de fabrication décrites sont fournies sur la figure 1. <ol><li> Placez plaques de silicium sur isolant (SOI) dans un four et cuire au four à 125 ° C pendant 20 min pour les déshydrater. </li><li> Déposer une couche épaisse d&#39;oxyde de silicium de 1,5 pm sur la couche de poignée de la plaquette SOI déshydraté au moyen d&#39;un Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) outil. </li><li> Placer la plaque sur le mandrin de spin d&#39;enduction de la couche de dispositif vers le haut. Assurez-plaquette est centrée, de distribuer 2 ml de P20 amorce sur le centre de la plaque, et tournent à 3000 tours par minute pendant 60 secondes à une accélération de 1000 rpm / sec. P20 amorce favorise l&#39;adhérence du vernis photosensible à la couche de dispositif. </li><li> Bien que la tranche est encore sur le mandrin tournette, distribuer 2 ml de S1818 résine photosensible sur le centre de la plaquette, et centrifuger à 3000 tours par minute pendant 60 secondes à une accélération de 1000 tours par minute / seconde à obtain une épaisse couche de résine photosensible de 1,5 um. </li><li> Placer la plaque sur une plaque chauffante et effectuer une cuisson douce à 115 ° C pendant 1 min. </li><li> Effectuer une exposition Contact avec les UV dur à l&#39;aide d&#39;un masque d&#39;alignement de contact de photolithographie afin de transférer le motif du masque en porte à faux de la résine photosensible sur la couche de l&#39;appareil. Calculer le temps d&#39;exposition en fonction de l&#39;exposition valeur énergétique de 125 mJ / cm 2 pour S1818 résine photosensible. </li><li> Développer la résine photosensible par immersion de la plaquette dans un MIF développeur 726 de résine photosensible pour 1 min en agitant doucement la tranche d&#39;avant en arrière. </li><li> Rincer la plaquette avec (DI) de de-ionisée et sécher, de préférence en utilisant un outil essoreuse de rinçage (SRD). </li><li> Retirer la résine photosensible à partir du bord de la plaquette (jusqu&#39;à 5 mm du bord) en utilisant un tampon de coton trempé dans de l&#39;acétone. </li><li> Chargez la plaquette dans un outil Deep Reactive Ion Etch (DRIE), avec le côté de résine photosensible vers le haut, et exécuter une recette pour graver la couche de silicium motifs par la devicouche CE. Les fonctions de la couche d&#39;oxyde enterrée comme un arrêt de gravure, de manière à effectuer une attaque chimique de 50% à 100% de cycles que l&#39;on attend d&#39;être nécessaire pour assurer une gravure complète. </li><li> Placer la plaque dans une solution de bain de résine photosensible à chaud pendant 20 minutes pour enlever la résine photosensible. Transférer la tranche à une rapide décharge-Rince (QDR) pour rincer la tranche avec de l&#39;eau DI. Après la bande de résine photosensible, charger la plaquette dans un outil de SRD à rincer et sécher la plaquette. Vérifier la plaquette sous un microscope à assurer la configuration en porte à faux apparaît comme prévu. </li><li> Déposer une couche de 1 um d&#39;épaisseur d&#39;oxyde de silicium non dopé sur la couche de dispositif de la plaquette à l&#39;aide d&#39;un outil de PECVD. Cette fonction de couche d&#39;oxyde en tant que couche de protection pour les leviers au cours des étapes de traitement. </li><li> Placer la plaque sur le mandrin de spin d&#39;enduction de la couche de poignée orientée vers le haut pour commencer le traitement de la face arrière de la plaquette. Assurer plaquette est centrée, de distribuer 2 ml de P20 amorce sur le centre de la plaque, et tournent à 3000 tours par minutependant 60 secondes à une accélération de 1000 rpm / sec. </li><li> Bien que la tranche est encore sur le mandrin tournette, 2 ml de distribuer SPR220-4.5 résine photosensible sur le centre de la plaquette, et centrifuger à 2000 tours par minute pendant 45 secondes à une accélération de 1000 tours par minute / seconde pour obtenir une épaisseur de couche de 6,5 pm résine photosensible. </li><li> Placer la plaque sur une plaque chaude de proximité pour effectuer une cuisson douce à 115 ° C pendant 2 min. </li><li> Utilisation d&#39;une photolithographie de contact d&#39;alignement capable de recto / verso alignement, aligner le masque de la fenêtre du côté arrière de la configuration en porte à faux du côté avant et effectuer une exposition aux UV de contact dure, afin de transférer le motif sur le masque de la fenêtre du côté arrière de la résine photosensible sur la couche de poignée. Utilisez un temps d&#39;exposition calculée sur la base de l&#39;exposition valeur énergétique de 480 mJ / cm 2 pour SPR220-4.5 résine photosensible. </li><li> Après l&#39;exposition aux UV, que les plaquettes restent dans une zone sombre pendant 30 min avant l&#39;étape de traitement suivante. </li><li> Développer la résine photosensible par trempage de la plaque enun développeur 726 MIF de résine photosensible pendant 2 min en agitant doucement la tranche d&#39;avant en arrière. </li><li> Rincer la plaquette avec (DI) de de-ionisée et sécher, de préférence en utilisant un outil essoreuse de rinçage (SRD). </li><li> Placer les tranches dans un four à 90 ° C pendant 12 heures. </li><li> Graver la couche d&#39;oxyde de silicium sur la face arrière de la tranche en utilisant un système de RIE avec des gaz fluorés et une recette pour la gravure de l&#39;oxyde. L&#39;oxyde à motifs sur la face arrière de la plaquette joue le rôle d&#39;un masque de gravure pour la suite du traitement. Inspecter les plaquettes au microscope pour s&#39;assurer que l&#39;oxyde de silicium exposé dans la fenêtre est complètement décapée. </li><li> Retirer la résine photosensible sur le bord de la plaquette (jusqu&#39;à 5 mm du bord) en utilisant un tampon de salle blanche trempée dans de l&#39;acétone. </li><li> Charger la plaquette dans un outil de DRIE et de fonctionner avec une recette pour graver la couche de poignée motif jusqu&#39;à une profondeur de 500 um avec le fonctionnement de la couche d&#39;oxyde enterrée dans un arrêt de gravure. Diviser cette gravure en plusieurs pistes pour éviter un échauffement excessif de lagaufrette, ce qui provoque la gravure du silicium incompatible. Cette étape de gravure élimine complètement le silicium sous les encorbellements. </li><li> Réaliser une étape de gravure humide en utilisant 25% de HF dilué agent de gravure, à enlever la couche d&#39;oxyde enterrée en dessous des consoles et la couche protectrice d&#39;oxyde au-dessus des consoles. REMARQUE: Cette étape libère la surface inférieure des consoles de silicium et ouvre une nouvelle fenêtre pour fournir un accès à la sonde en porte à faux avec le laser aussi. </li><li> Rincer la plaque à l&#39;aide d&#39;une série de DI bains d&#39;eau et sécher soigneusement avec de l&#39;azote. Depuis les consoles sont pris en charge uniquement par leurs bases, ne pas utiliser de sprays d&#39;eau puissant DI ou un gaz inerte directement sur les consoles. </li><li> Cliver les puces individuelles à partir de la tranche le long des lignes de clivent les produits au cours de l&#39;étape de gravure de la couche poignée. </li></ol> 2. culture cellulaire <ol><li> Préparer 13F lamelles selon des méthodes 17 précédemment publiés. REMARQUE: Si 13F anserslips ne sont pas disponibles, toute surface hydrophobe avec un angle de contact au-dessus de 95 ° peut être utilisé. </li><li> Stériliser puces en porte-lamelles et 13F dans une solution d&#39;éthanol à 70% et laisser sécher à l&#39;air dans une hotte à flux. </li><li> Placez puces individuelles en porte à faux au-dessus de 13F lamelles dans une plaque 12 puits standard. </li><li> Enduire les cantilevers avec la modification d&#39;un biopolymère ou d&#39;une surface optimisé pour le type de cellules utilisées selon les protocoles de culture cellulaire standard. </li><li> Re-suspendre les cellules dans leur milieu de croissance spécifique à la concentration désirée. NOTE: Ce protocole se traduira par un nombre important de cellules tombant à travers la fenêtre en porte à faux et qui n&#39;adhère pas à la surface du cantilever souhaitée. préparations de cellules doivent donc être faits 3-4x plus concentré que pour les préparations de lamelle standard. Par exemple, l&#39;ensemencement de cellules satellites de muscle squelettique de rat est généralement réalisée en utilisant une densité d&#39;ensemencement de 500 à 700 cellules / mm carré 15,16, Et sont utilisés avec des substrats en porte à faux à 2000 cellules / mm carré. des expériences d&#39;optimisation doivent être effectuées avec de nouvelles sources de cellules pour déterminer une densité d&#39;ensemencement appropriée. </li><li> Pipeter 200 ul de la suspension cellulaire sur la surface de la puce en porte à faux assurant la bulle de support recouvre les fenêtres entièrement en porte à faux. Si le milieu évacue à travers la fenêtre et ne forme pas de bulles statique au-dessus des consoles remplacer la lamelle couvre-13F et retenter le placage. </li><li> Transférer la plaque contenant les jetons à un incubateur et permettent aux cellules d&#39;adhérer pendant au moins 1 heure (de préférence 2-3 h). </li><li> Après cette période de placage, utiliser des pinces stériles pour transférer la puce à un bien propre, sans une lamelle 13F, et haut la culture avec 1 ml de milieu de croissance. </li><li> Retour de la plaque dans l&#39;incubateur. </li><li> Maintenir les cellules en fonction de leur protocole standard pour l&#39;entretien in vitro sur des lamelles. Pour les cellules des muscles squelettiques,un commutateur de composition de milieu pour induire la formation de myotubes une fois que les cellules deviennent confluentes sera nécessaire. </li></ol> 3 Configuration du matériel et des logiciels d&#39;analyse Cantilever Déviation <ol><li> Placez une boîte de culture chauffée dans le stade d&#39;un microscope droit électrophysiologie. </li><li> Ajouter 3 ml du milieu d&#39;alimentation, les cellules sont mises en suspension dans le moment (+ 10 mM de HEPES) de la platine du microscope chauffée. </li><li> Montage d&#39;électrodes en acier inoxydable à l&#39;intérieur de la boîte de culture chauffé à une distance de séparation de 15 mm et de les relier à un générateur d&#39;impulsions, capable de produire des impulsions de stimulation du champ de variation de l&#39;intensité, la fréquence et la forme d&#39;onde, pour permettre au système de produire une stimulation de champ de cellules, le cas échéant. </li><li> Visser un laser Hélium-Néon, monté sur des étages de translation XY, à la face inférieure de la table de microscope et de l&#39;ajuster de telle sorte que le faisceau laser est dirigé à travers le fond de la boîte de culture chauffé à une relativ 30 ° d&#39;anglee par rapport au plan de la console. </li><li> Visser un module photo-détecteur à quadrants, monté sur les scènes de translation XY, à la face inférieure de la platine du microscope et régler la position de sorte que les terres de faisceau laser réfléchi dans le centre des 4 quadrants. Figure 2 donne un aperçu du matériel mis en place nécessaire pour mettre en œuvre le protocole décrit. </li><li> Écrire un programme de logiciel pour contrôler les actionneurs linéaires qui scannent à travers les consoles. Écrire le programme de logiciel, en référence à l&#39;organigramme présenté à la figure 3. L&#39;interface graphique programmé pour être utilisé avec ce système est présenté à la figure 4. </li></ol> 4. enregistrement Cantilever Déviation données <ol><li> Allumer le matériel d&#39;analyse en porte à faux et le logiciel associé. </li><li> Insérez la thermistance de la scène chauffée dans le milieu et attendre pour lire 37 ° C. </li><li> Insérez la puce en porte à faux dans la scène avec le cantilevers orientés vers le côté droit de la scène. </li><li> Allumer la source de lumière du microscope. </li><li> La mise au microscope pour amener les bords des consoles en vue et utiliser le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur pour positionner le faisceau laser sur la pointe du cantilever 1 REMARQUE: En supposant que les consoles sont orientés vers la droite de la scène, cantilever 1 est l&#39;un positionné dans le coin supérieur gauche de la matrice et le nombre descendent jusqu&#39;à 16 en bas à gauche. Cantilever 17 est dans la position en haut à droite et tourne à 32 en bas à droite (figure 5A). </li><li> Appuyez sur &quot;play&quot; sur le logiciel d&#39;enregistrement. </li><li> Positionner le photo-détecteur de sorte que le signal indique &quot;0&quot; dans les deux x et y trames en ajustant les moteurs pas à pas commandant le photo-détecteur. </li><li> Réglez cantilever 1 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur (Figure 4). </li><li> Déplacez le laser à la pointe du cantilever 16, répéter l&#39;étape 4.7., Et mettre cantilever 16 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur. </li><li> Déplacez le laser à la pointe du cantilever 32, répéter l&#39;étape 4.7., Et mettre en porte à faux 32 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur. </li><li> Déplacez le laser à la pointe du cantilever 17, répéter l&#39;étape 4.7., Et mettre en porte à faux 17 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur. </li><li> Coupez la source de lumière du microscope et le plafonnier dans le laboratoire. </li><li> Appuyez sur &quot;enregistrer&quot; sur le logiciel d&#39;enregistrement. </li><li> Réglez le matériel générateur d&#39;impulsions à 40 ms, 5 V impulsions à une fréquence de 1 Hz, et allumer la machine. NOTE: En option, emploient des protocoles de stimulation optimisés pour les sources de cellules spécifiques à ce stade, les paramètres indiqués sont des lignes directrices fondées sur des données recueillies à l&#39;aide de sources 12,13,15,16 cellulaires humaines et de rongeurs. </li><li> En utilisant le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur, régler le matériel pour numériser à travers le réseau 32 en porte à faux, l&#39;arrêt pendant 5 secondes à chaque sure. </li><li> Lorsque l&#39;analyse des 32 consoles est terminée, éteignez le stimulateur, puis arrêtez le logiciel d&#39;enregistrement et d&#39;élever le fichier de données. </li><li> Examinez la trace enregistrée de chaque console de preuves de l&#39;activité contractile. Prenez note de chaque porte à faux avec les réponses positives. Une contraction est définie comme étant un pic si la déviation est au moins de 0,1 V au-dessus de la ligne de base. </li><li> Retirez toutes les consoles non-sensibles du protocole de numérisation sur le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur. </li><li> Les cantilevers actifs peuvent ensuite être réanalysés sans stimulation afin d&#39;obtenir une lecture de l&#39;activité contractile spontanée de la cellule. </li><li> Exécuter des analyses large avec ou sans stimulation électrique de champ, après l&#39;addition d&#39;un composé thérapeutique dans le milieu pour observer son effet sur la sortie fonctionnelle des cellules en culture. </li><li> Réaliser des évaluations de la fatigue en stimulant électriquement les cellules pendant de longues périodes et les niveaux de contr de numérisation<html> Actility de mesurer combien de temps il faut pour force maximale de descendre en dessous d&#39;un certain seuil. </li><li> Dans les expériences où les motoneurones sont maintenues en co-culture avec les muscles, mesurer la formation de la jonction neuromusculaire par le traitement des motoneurones-myotubes cantilever co-cultures avec un stimulant neuronal (tel que le glutamate) ou inhibiteur de la synaptique (par exemple, d-tubocurarine) et de balayage pour augmentations et les diminutions de l&#39;activité spontanée respectivement 16. </li><li> Effectuer des analyses spécifiques comme dicté par les besoins des expériences prévues. </li></ol> 5 Analyse des données Cantilever Déviation <ol><li> Utilisez modifié les équations de Stoney 15 (détaillées ci-dessous) pour convertir les données en porte à faux brut de déviation (en Volts) en une lecture de stress dans la couche de cellules ou myotubes (en Pascals), et une mesure directe de la force contractile cellulaire (en nano-Newton): annonce / 51866 / 51866eq1.jpg &quot;/&gt; l&#39;équation 1 <img alt="Equation 2" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg" /> Equation 2 </li><li> Où δ = cantilever béquillage et le stress produites par les myotubes, σ c = contrainte produite par les myotubes, en supposant un film d&#39;épaisseur uniforme sur toute la largeur de la poutre, C détecteur = le coefficient spécifique au système concernant la tension de mesure à laser sur la photo -detector, θ = l&#39;angle du laser et du détecteur par rapport au plan de la poutre, E Si = le module d&#39;élasticité de silicium, t Si = l&#39;épaisseur du cantilever, t f = épaisseur de myotubes, v Si = coefficient de poison de silicium, L = longueur en porte à faux, P = longueur du chemin laser à partir de la pointe de cantilever à détecteur, et w <sub&gt; Si = la largeur de la poutre. Un schéma expliquant les termes utilisés dans ces équations est présenté à la figure 6. </li><li> En supposant que la myotubes est un film uniforme, la force dans la myotubes est égale à la force dans le film, ce qui conduit à l&#39;équation 3, en assimilant le calcul de la force contre le stress et la zone de section transversale de la cellule présumée qui a été utilisé pour l&#39;application de Stoney de équation. <img alt="Équation 3" fo:content-width="1.5in" src="files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg" /> Équation 3 </li><li> Après la collecte de données fonctionnelles, fixer des puces en porte à faux pour l&#39;analyse immunocytochimique ou utiliser des cellules pour l&#39;analyse des protéines ou de l&#39;ADN en utilisant des techniques standard. </li><li> En option, retourner les cellules à l&#39;incubateur au lieu de préparer pour l&#39;analyse moléculaire afin de réévaluer la performance fonctionnelle à un point de temps plus tard. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+A+maturation+model+promoting+long-term+survival+of+myotubes,+structural+development+of+the+excitation-contraction+coupling+apparatus+and+neonatal+myosin+heavy+chain+expression.">Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression.</a> Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).</li><li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+novel+serum-free+cell+culture+model+of+skeletal+muscle+differentiation+by+systematically+studying+the+role+of+different+growth+factors+in+myotube+formation.">Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).</li><li>Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+determinants+of+neuronal+survival+and+growth+on+self-assembled+monolayers+in+culture.">Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture.</a> Brain research. 630, 136-147 (1993).</li><li>Hickman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+pattern+design+for+in+vitro+cellular+networks+using+surface+photochemistry.">Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry.</a> Journal of Vacuum Scienc., &amp; Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).</li><li>Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+rat+embryonic+motor+neurons+in+a+defined+system.">Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system.</a> Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).</li><li>Rumsey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Node+of+Ranvier+formation+on+motor+neurons+in+vitro.">Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro.</a> Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).</li><li>Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial+Surface+patterning+of+self+assembled+monolayers+for+controlling+neuronal+cell+behavior.">Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior.</a> International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).</li><li>Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+fetal+spinal+cord+stem+cell+line,+NSI-566RSC,+and+its+induction+to+functional+motoneurons.">Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).</li><li>Varghese, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+target+for+amyloid+beta+toxicity+validated+by+standard+and+high-throughput+electrophysiology.">A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology.</a> PLoS ONE. 5, e8643 (2010).</li><li>Natarajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cardiomyocytes+on+microelectrode+arrays+as+a+functional,+high+information+content+drug+screening+platform.">Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform.</a> Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).</li><li>Davis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Cortical+Oligodendrocyte-Embryonic+Motoneuron+Co-Culture:+An+Axon-Oligodendrocyte+Interaction+Model.">Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model.</a> Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).</li><li>Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+In+Vitro+Feed-Forward+Networks.">Engineered In Vitro Feed-Forward Networks.</a> J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Les étapes essentielles de l&#39;analyse microscopique des consoles de preuve de contraction cellulaire sont le placement de la puce de porte à faux à l&#39;intérieur de la platine du microscope, et l&#39;alignement ultérieur du laser et photo-détecteur à l&#39;extrémité des leviers de coin dans la matrice. Si ce n&#39;est pas fait correctement, le logiciel ne pourra pas extrapoler les positions des consoles restantes dans le tableau, qui pourrait conduire à l&#39;accumulation de faux négatifs lors de la coll...

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell&#8217;s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models11. 
Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology14, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney&#8217;s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection15. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR. 
This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="690">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:299px;">Name of material/ equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Primary rat muscle growth medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Neurobasal medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">21103-049&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">B27 (50x)</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">17504044</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1x</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Glutamax (100x)</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">35050061</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1x</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">G5 supplement</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">17503-012&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1x</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRG400B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRB600B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Ciliary Neurotrophic Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRC400A</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">40 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Neurotrophin-3</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRN500B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Neurotrophin-4</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRN501B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Acidic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">13241-013&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">P2654</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Cardiotrophin-1</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRC700B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Heparin Sulphate</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">D9809&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">100 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">L5158&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Vitronectin</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">V0132</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">100 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Primary rat muscle differentiation medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">NB Activ 4</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Brain Bits LLC</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">NB4-500</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Class 2 red diode laser</td>
			<td>Newport</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Photo-detector</td>
			<td>Noah Industries</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Model 2100 Pulse stimulator</td>
			<td>A-M systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Multiclamp 700B Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Patch clamp microscope and stage</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Delta T4 culture dish controller</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Axoscope software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37oC, 5% CO2 incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Class 2 microbiological flow hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipettes and tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of microscale silicon cantilevers to assess cellular contractile function in vitro

Le développement de tests in vitro prédictifs et biologiquement pertinents repose sur la promotion des systèmes de culture cellulaire polyvalents qui facilitent l&#39;évaluation fonctionnelle des cellules ensemencées. A cet effet, la technologie de micro-cantilever offre une plate-forme permettant de mesurer les fonctions de contraction d&#39;une gamme de types de cellules, y compris squelettique, cardiaque, et les cellules musculaires lisses, grâce à l&#39;évaluation de la contraction induite par le substrat de pliage. Application des réseaux multiplexés en porte à faux fournit les moyens pour développer des protocoles modérée à forte capacité d&#39;évaluation de l&#39;efficacité des médicaments et de la toxicité, le phénotype de la maladie et de progression, ainsi que les interactions neuromusculaires et autre cellule-cellule. Ce manuscrit fournit les détails de fabrication de tableaux en porte à faux fiables à cet effet, et les méthodes requises pour mener des cellules de culture sur ces surfaces. Une description plus détaillée est fournie sur les mesures nécessaires pour effectuer anal fonctionnelleyse de types de cellules contractiles maintenu sur de tels réseaux à l&#39;aide d&#39;un laser selon l&#39;invention et d&#39;un système photo-détecteur. Les données représentatives présente les points saillants de la précision et de la nature reproductible de l&#39;analyse de la fonction contractile possible d&#39;utiliser ce système, ainsi que le large éventail d&#39;études à laquelle cette technologie peut être appliquée. L&#39;adoption généralisée de succès de ce système pourrait fournir aux enquêteurs les moyens d&#39;effectuer des études fonctionnelles, à faible coût rapides in vitro, conduisant à des prévisions plus précises de la performance des tissus, le développement de la maladie et la réponse au traitement thérapeutique.

Culture réussie des cellules contractiles sur des consoles est une procédure relativement simple, en utilisant des techniques classiques de culture cellulaire (figure 5). Le pourcentage de consoles supportant les cellules contractants varie en fonction du type de cellule en cours d&#39;examen et la technique de culture spécifique utilisé. En utilisant des cellules embryonnaires primaires dérivées de membres postérieurs chez le rat, l&#39;activité contractile a été détecté sur 12% des cantile...

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Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Ce protocole décrit l&#39;utilisation de leviers de silicium micro-échelle que les surfaces souples de culture pour mesurer la contractilité des cellules musculaires in vitro. Contraction cellulaire provoque une flexion en porte à faux, qui peut être mesuré, enregistré et converti en lectures de force, en fournissant un système non invasif pour la mesure et s&#39;adaptent fonction contractile in vitro.

L&#39;utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

utilization-microscale-silicon-cantilevers-to-assess-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

10.1K vues.  University of Central Florida.  Ce protocole décrit l'utilisation de leviers de silicium micro-échelle que les surfaces souples de culture pour mesurer la contractilité des cellules musculaires in vitro. Contraction cellulaire provoque une flexion en porte à faux, qui peut être mesuré, enregistré et converti en lectures de force, en fournissant un système non invasif pour la mesure et s'adaptent fonction contractile in vitro. 

Vidéo: Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological research. Perhaps the most widely used physical force to achieve noninvasive manipulation of small particles has been dielectrophoresis(DEP).1 However, DEP on its own lacks the versatility and precision that are desired when manipulating cells since it is traditionally done with stationary electrodes. Optical tweezers, which utilize a three dimensional electromagnetic field gradient to exert forces on small particles, achieve this desired versatility and precision.2 However, a major drawback of this approach is the high radiation intensity required to achieve the necessary force to trap a particle which can damage biological samples.3 A solution that allows trapping and sorting with lower optical intensities are optoelectronic tweezers (OET) but OET's have limitations with fine manipulation of small particles; being DEP-based technology also puts constraint on the property of the solution.4,5
This video article will describe two methods that decrease the intensity of the radiation needed for optical manipulation of living cells and also describe a method for orientation control. The first method is plasmonic tweezers which use a random gold nanoparticle (AuNP) array as a substrate for the sample as shown in Figure 1. The AuNP array converts the incident photons into localized surface plasmons (LSP) which consist of resonant dipole moments that radiate and generate a patterned radiation field with a large gradient in the cell solution. Initial work on surface plasmon enhanced trapping by Righini et al and our own modeling have shown the fields generated by the plasmonic substrate reduce the initial intensity required by enhancing the gradient field that traps the particle.6,7,8 The plasmonic approach allows for fine orientation control of ellipsoidal particles and cells with low optical intensities because of more efficient optical energy conversion into mechanical energy and a dipole-dependent radiation field. These fields are shown in figure 2 and the low trapping intensities are detailed in figures 4 and 5. The main problems with plasmonic tweezers are that the LSP's generate a considerable amount of heat and the trapping is only two dimensional. This heat generates convective flows and thermophoresis which can be powerful enough to expel submicron particles from the trap.9,10 The second approach that we will describe is utilizing periodic dielectric nanostructures to scatter incident light very efficiently into diffraction modes, as shown in figure 6.11 Ideally, one would make this structure out of a dielectric material to avoid the same heating problems experienced with the plasmonic tweezers but in our approach an aluminum-coated diffraction grating is used as a one-dimensional periodic dielectric nanostructure. Although it is not a semiconductor, it did not experience significant heating and effectively trapped small particles with low trapping intensities, as shown in figure 7. Alignment of particles with the grating substrate conceptually validates the proposition that a 2-D photonic crystal could allow precise rotation of non-spherical micron sized particles.10 The efficiencies of these optical traps are increased due to the enhanced fields produced by the nanostructures described in this paper.

Plasmonic tweezers and photonic crystal nanostructures are shown to produce useful enhancements in the efficiency and orientation control of optically trapping micro- and nano-particles.

L&#39;utilisation de nanostructures cristal plasmonique et photoniques pour la manipulation des micro-et nanoparticules améliorée

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Recherche

Bio-ingénierie

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

Assemblage in vitro de la semi-artificielle machine moléculaire et son utilisation pour la détection de lésions de l&#39;ADN

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantification de Global diastolique fonction de l&#39;analyse basée sur la modélisation cinématique de transmitral débit via le formalisme de remplissage diastolique paramétrée

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse Inhomogénéité mélange dans un dispositif microfluidique par Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to rapidly consume hexose and pentose mixed sugars in enzyme saccharified undetoxified hydrolyzates and to accumulate over 40 g/L ethanol.

Techniques pour l&#39;évolution de la levure robuste Pentose-fermentation pour la bioconversion de lignocellulose en éthanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both cleansing agents and daily variations in ambient moisture; both of which can alter the water content of the tissue. Reductions in water content from severe barrier dysfunction or low humidity environments can alter SC stiffness and cause a build-up of drying stresses. In extreme conditions, these factors can cause mechanical rupture of the tissue. We have established a high throughput method of quantifying dynamic changes in the mechanical properties of SC upon drying. This technique can be employed to quantify changes in the drying behavior and mechanical properties of SC with cosmetic cleanser and moisturizer treatments. This is achieved by measuring dynamic variations in spatially resolved in-plane drying displacements of circular tissue samples adhered to an elastomer substrate. In-plane radial displacements acquired during drying are azimuthally averaged and fitted with a profile based on a linear elastic contractility model. Dynamic changes in drying stress and SC elastic modulus can then be extracted from the fitted model profiles.

This article describes a method of quantifying the dynamic drying behavior and mechanical properties of stratum corneum by measuring spatially resolved in-plane drying displacements of circular tissue samples adhered to an elastomer substrate. This technique can be used to measure how different chemical treatments alter drying and tissue mechanical properties.

Mesure et modélisation contractile séchage dans Human stratum corneum

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is catheter-directed thrombolytics (CDT). To mitigate caustic side effects and the long treatment time associated with CDT, adjuvant and alternative approaches are under development. One such approach is histotripsy, a focused ultrasound therapy to ablate tissue via bubble cloud nucleation. Pre-clinical studies have demonstrated strong synergy between histotripsy and thrombolytics for clot degradation. This report outlines a benchtop method to assess the efficacy of histotripsy-aided thrombolytic therapy, or lysotripsy.
Clots manufactured from fresh human venous blood were introduced into a flow channel whose dimensions and acousto-mechanical properties mimic an iliofemoral vein. The channel was perfused with plasma and the lytic&#160;recombinant tissue-type plasminogen activator. Bubble clouds were generated in the clot with a focused ultrasound source designed for the treatment of femoral venous clots. Motorized positioners were used to translate the source focus along the clot length. At each insonation location, acoustic emissions from the bubble cloud were passively recorded, and beamformed to generate passive cavitation images. Metrics to gauge treatment efficacy included clot mass loss (overall treatment efficacy), and the concentrations of D-dimer (fibrinolysis) and hemoglobin (hemolysis) in the perfusate. There are limitations to this in vitro design, including lack of means to assess in vivo side effects or dynamic changes in flow rate as the clot lyses. Overall, the setup provides an effective method to assess the efficacy of histotripsy-based strategies to treat DVT.

Histotripsy-aided lytic delivery or lysotripsy is under development for the treatment of deep vein thrombosis. An in vitro procedure is presented here to assess the efficacy of this combination therapy. Key protocols for the clot model, image guidance, and assessment of treatment efficacy are discussed.