Ce travail a été soutenu par le Ministère de la Science et de la Technologie de Taiwan sous le numéro 101-2221 Grant-E-002-064-MY3.

1. La fabrication de dispositif microfluidique <ol><li> Utilisez un logiciel de mise en page graphique (par exemple, AutoCAD) pour dessiner le contour d&#39;un T-microcanaux. Pour la T-microcanal, les deux canaux d&#39;alimentation sont de 90 um de large et 2500 um de long, et le canal de confluence est de 180 um de large et 3000 um de long. Connectez l&#39;autre extrémité de chaque canal à un cercle individuel avec un diamètre de 1,100 um. </li><li> Mark «claire» et «sombre» pour l&#39;exposition et les zones couvertes, respectivement. Pour une résine photosensible négative (par exemple, SU-8), la forme de la T-microcanaux est «clair» et de ses environs est «sombre». </li><li> Utiliser un générateur de motifs laser avec une longueur d&#39;onde de 442 nm et une taille de caractéristique minimum de 2 um à transférer le motif de la T-microcanal sur un masque photographique en chrome sur verre. </li><li> Utilisez le photomasque, un substrat (par exemple, un seul côté poli tranche de silicium) et une résine photosensible époxy permanente (par exemple., SU-8) pour faire un moule à travers un processus de lithographie standard. La couche de résine photosensible est de 55,2 um d&#39;épaisseur. En général, l&#39;épaisseur de la résine photosensible doit être plus mince que la profondeur de corrélation de la lentille d&#39;objectif 17 à 19. </li><li> Utilisation du moule et un matériau transparent tel que le polydiméthylsiloxane (PDMS) pour fabriquer le microcanal T-20. </li><li> Pour le raccordement fluidique, utiliser un tube de 2 mm en acier inoxydable de diamètre extérieur pour percer des trous traversants alignés sur les motifs circulaires sur les PDMS. </li><li> Traiter les surfaces des PDMS et d&#39;une lame de verre avec un plasma d&#39;oxygène à 60 W pendant 30 s. Fixez les PDMS à la lame de verre. Les surfaces oxydées des deux matériaux créent un lien fort. Placez la structure PDMS lié sur une plaque chauffante pendant 5 min à 120 ° C. </li><li> Insérez tubes en téflon dans les trous percés pour connexion fluidique. </li></ol> 2. Installation expérimentale <ol><li> Construire le système de schlieren microscopique d&#39;un Hoffman modulation microscope à contraste en retirant la plaque à fente dans le plan focal avant du condenseur et le remplacement du modulateur avec un couteau dans le plan focal arrière de l&#39;objectif 5X 3. La profondeur de corrélation, qui dépend de l&#39;ouverture numérique de l&#39;objectif 17 à 19, devrait être suffisante pour couvrir toute la profondeur du dispositif microfluidique. La surface de la lame de couteau est noirci par l&#39;oxyde d&#39;aluminium anodique pour réduire sa réflectivité. </li><li> Montez la caméra haute vitesse au tube trinoculaire du microscope via un adaptateur de monture C. Ayant l&#39;appareil face au chemin optique du microscope à travers un séparateur de faisceau. Branchez l&#39;appareil photo à un ordinateur de bureau via un câble Ethernet. Réglez la correction de gamma à 1 pour la caméra de telle sorte que son affichage en échelle de gris est proportionnelle à la luminance d&#39;entrée. </li><li> Allumez la source de lumière. Afin d&#39;éviter l&#39;excès de chaleur, utiliser LED (diode électroluminescente). </li><li> Utilisez un logiciel de traitement d&#39;image (par exemple, &lt;/ Em&gt; fonction imread dans MATLAB) pour obtenir les valeurs de gris d&#39;une image acquise. Retirez le couteau, régler l&#39;éclairage, l&#39;ouverture et le temps d&#39;exposition afin que la lecture en niveaux de gris moyen de l&#39;image est d&#39;environ 10% inférieure à la valeur maximale. Cela dénote l&#39;intensité de fond pour un seuil de 0% et nous utilisons une valeur de 230 pour une image de 8-bit. </li><li> Insérez le couteau pour bloquer la lumière incidente complètement. Notez la lecture de niveaux de gris moyen de l&#39;image. Ceci représente l&#39;intensité d&#39;arrière-plan pour une coupure à 100% et la valeur est d&#39;environ 15 pour une image de 8 bits. </li><li> Ajustez la position du couteau de sorte que la lecture en niveaux de gris moyen de l&#39;image acquise se trouve au milieu des valeurs pour 0% et 100% coupure. Maintenant, le degré de la fréquence de coupure est réglée sur 50%. </li><li> Préparer deux fluides transparents avec des indices de réfraction connus 21 qui sont complètement miscible avec l&#39;autre que les électeurs. Pour évaluer la dépendance des ind réfractionex sur la concentration du mélange, vérifiez la littérature 21 ou utilisez l&#39;équation Gladstone-Dale 22. Si la courbe est non linéaire sur toute la plage, choisissez d&#39;autres composants fluides. Ensuite, pour choisir une composition désignée ci-après dont l&#39;indice de réfraction de la solution varie de façon linéaire avec la concentration. Par exemple, utiliser diluer l&#39;éthanol aqueux avec une fraction de masse de 0,05 et de l&#39;eau que les fluides de travail. </li><li> Mettez le T-microcanaux sur la scène de l&#39;échantillon. Disposer le T-microcanaux sorte avec le canal parallèle à la confluence couteau (Figure 1). </li><li> Préparer deux seringues identiques: Une seringue est remplie avec le fluide de travail qui sert de fluide de référence (l&#39;eau) et B seringue est remplie avec l&#39;autre fluide de travail (diluer l&#39;éthanol aqueux). La taille de la seringue dépend de la Q de débit souhaité et la spécification de la pompe à seringue: nD = Q 2 V / 4, d étant le diamètre intérieur de la syringe et V est la vitesse du piston. Flux de pulsation peut habituellement être évité en choisissant une petite seringue 23 V à augmenter. </li><li> Recueillir le fluide de sortie à partir de la T-microcanal dans un bêcher. Assurer le tube de sortie est fixé en Téflon sur le mur de la bêcher et son extrémité est en dessous du niveau de liquide dans le récipient afin d&#39;éviter des vibrations qui pourraient être causés par des gouttelettes sécable. </li></ol> 3. Calibration <ol><li> Acquérir les images des deux fluides de mélange et les images de référence. <ol><li> A un nombre de Reynolds donné Re, fixer le taux des pompes à seringues de débit, Q. Q est calculée à partir de Q = μ (W + D) Re / 4ρ, où μ et ρ sont la viscosité et la densité du fluide de travail, et W et D est la largeur et la profondeur du canal de confluence de la T-microcanal, respectivement. </li><li> Chargez une pompe avec seringue A et l&#39;autre pompe avec syRinge B. Connectez les deux entrées de la T-microcanaux à seringue A et B via seringue Teflon tube. Démarrer les pompes à seringue à délivrer des fluides de travail dans le T-microcanal identiques à des débits en volume. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce flux constant établit. L&#39;état de flux constant est défini par l&#39;émergence d&#39;un modèle schlieren stationnaire. </li><li> Utilisez le logiciel de la caméra contrôlée pour enregistrer vingt cadres de mélange fluide à une vitesse de 30 ips. </li><li> Arrêter la pompe qui est chargé avec une seringue B. Seulement pomper le fluide de référence (de l&#39;eau) par une entrée dans le canal de confluence de la T-microcanaux à taux constant. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;état de flux constant est atteint et aucun modèle schlieren est observée. </li><li> Utilisez le logiciel de la caméra contrôlée à prendre l&#39;image de référence, en l&#39;absence de non-homogénéité optique est présent dans le T-microcanaux. Enregistrez vingt images à une vitesse de 30 ips. </li><li> Répétez 3.1.1 à 3.1.7 au différent nombre de Reynolds: Re = 1, 5, 10, 20 et 50 de sorte que pas de structure complexe d&#39;écoulement débouche dans la zone de confluence de la T-24 microcanal. </li></ol></li><li> Utilisez un logiciel de traitement d&#39;image pour diviser l&#39;image acquise I (i, j) par l&#39;image de référence I 0 (i, j) 25, où i et j sont les indices de pixels. </li><li> Employer un paquet CFD (Computational Fluid Dynamics) pour simuler le mélange des fluides désignés dans le T-microcanaux. <ol><li> Construire le modèle en trois dimensions de la géométrie de la T-microcanal. Discrétiser le domaine de l&#39;écoulement dans les réseaux structurés. Pour augmenter la précision, employer maille plus fine dans la confluence et la région centrale du T-microcanal. </li><li> Affecter les propriétés physiques des fluides et d&#39;établir les conditions aux limites du domaine d&#39;écoulement. Au cours du processus de résolution, déterminer le coefficient de diffusion dépendant de la concentration de la concentration obtenue lors de la dernièreitération 26 afin de mettre à jour la concentration locale. </li><li> Examiner les sensibilités des résultats calculés en effectuant l&#39;étude de la grille 27. </li></ol></li><li> Pour chaque nœud (x i, y i) sur la Plane xy, emploie l&#39;outil de post-traitement CFD à prendre les valeurs moyennes du champ de concentration à travers la profondeur du canal par la règle du trapèze: w (x i, y j) = {Σ k [w (x i, y j, k z) + w (x i, y j, z k +1)] ∙ (z k 1 - k z) / 2} / D 28, où D est la profondeur du canal. Utilisez le schéma de différenciation centrale pour calculer la derivative de la concentration par rapport à la direction transversale de flux: (∂ w / ∂ y) i, j = [w (x i, y j +1) - w (x i, y j -1)] / (y j 1 - y j -1). </li><li> Pour les deux gradients positifs et négatifs, extraire le rapport des valeurs d&#39;échelle de gris I / I 0 (obtenu en 3.2) et le gradient de fraction massique w ∂ / ∂ y (obtenu dans 3,4) à des emplacements spécifiés, tels que y = 0 (ligne centrale, par fractions direction) ou diverses x donné (direction transversale de flux). </li><li> Tracer les résultats et de déterminer la relation entre I / 0 et ∂ w / ∂ y, I / 0 </sub&gt; = C 1 ∂ w / ∂ y + C 2 (C 1 et C 2 sont des constantes), avec une régression linéaire. </li></ol> 4. Quantification <ol><li> Répétez les étapes 03.01 à 03.02 pour le mélange dans le dispositif microfluidique cible. La profondeur du dispositif microfluidique de la cible doit être identique ou proche de celle de la T-microcanal. Si phénomène instable est prévu, d&#39;acquérir un clip vidéo (séquence d&#39;images) à l&#39;étape 3.1.4 à la place. Le taux de trame devrait être suffisant pour résoudre la dynamique de l&#39;écoulement transitoire clairement élevé, tandis que le temps d&#39;exposition doit être identique à la valeur utilisée dans 2.4, 2.5, 3.1.4 et 3.1.7. </li><li> Utilisation de la relation obtenue à l&#39;étape 3.6 pour convertir le rapport des valeurs de niveaux de gris au gradient de fraction de masse dans le dispositif microfluidique cible. </li></ol>

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Les auteurs ont rien à révéler.

Pour un mélange fluide dans un dispositif microfluidique, la technique schlieren microscopique est capable de mesurer l&#39;ampleur du gradient de concentration à travers la quantification du changement de l&#39;intensité lumineuse. Étant donné que le principe de cette technique repose sur la détection de l&#39;alternance de propagation de la lumière, les fluides de travail et le dispositif microfluidique doivent être transparentes à la lumière incidente. En outre, le protocole nécessite une relation linéair...

Mélange de fluides est une question importante qui se trouve dans de nombreux processus industriels et les systèmes biologiques. Avec l&#39;émergence de la microfluidique, mélange dans microscopique a apporté beaucoup d&#39;attention en raison de son défi dans la domination de diffusion parmi les mécanismes de transport de masse. Depuis la conception d&#39;une validation quantitative Micromélangeur efficace requise, plusieurs méthodes de mesure ont été développés 5-7. Néanmoins, la structure en trois dimensions, on trouve couramment dans micromélangeurs efficaces 5, exige une représentation plus précise du champ de concentration que les techniques courantes de mesure ne parviennent pas à délivrer. En raison de la limite d&#39;angle de vision 8 ou cinétique de réaction 6, les méthodes mentionnées ci-dessus peuvent produire des résultats trompeurs qui ne représentent pas correctement pour l&#39;homogénéité du mélange. Pour les fluides optiquement transparents mélange dans optiquement transparents microstructures, micro-technique schlieren 3,9-14 </sup&gt; fournit une alternative intéressante à analyser le mélange inhomogénéité. Dans le passé, la technique schlieren microscopique a été principalement utilisé pour visualiser les écoulements compressibles 9-13, 15 ou phase de gradient 16. Microscale technique schlieren bénéficie à la fois une mise en page simple et optique haute sensibilité et permet non seulement l&#39;enquête non-invasive de fonctionnalité de flux spécifique qui provoque une perturbation optique, mais est bien adapté pour une utilisation dans l&#39;évaluation de mélange. Dans cet article, nous construisons le système schlieren microscopique en insérant un couteau dans le plan focal arrière de l&#39;objectif d&#39;un microscope, décrire une procédure d&#39;étalonnage pour réaliser l&#39;analyse quantitative, et de signaler une mesure de validation dans un oscillateur microfluidique 4. Pour mettre en œuvre les mesures, les fluides de travail sont correctement choisies de manière que l&#39;indice de réfraction des fluides mélangés varie linéairement avec la composition et l&#39;épaisseur du dispositif microfluidique cible est identique à la sure lors de l&#39;étalonnage. En outre la concentration de l&#39;espèce, de la technique strioscopique microscopique peut être étendue à mesurer la pente de l&#39;autre quantité scalaire qui est linéairement corrélée à l&#39;indice de réfraction, tels que la température ou la salinité.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Permanent Epoxy Negative Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single side polished silicon wafer</td>
			<td>Light Technology</td>
			<td>S4W1PP5SABUP1</td>
			<td>p-type, diameter: 100&#177;0.5 mm, thickness: 525 &#177;25 mm, orientation: (1 0 0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>kds210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe, i.e. 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10L2138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoffman modulation contrast microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N PLAN</td>
			<td>NA = 0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife-edge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom made part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera, i.e. high speed</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>NX7-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter HC 0.63x</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>541537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera operating software</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>MotionPro X Studio 2.02.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard-184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tubing, i.e. O.D. x I.D. 1/16 in. x 0.031 in.</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>58700-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro glass slide</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>S2215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate</td>
			<td>Yeong-Shin</td>
			<td>HP-303DN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled water, i.e. HPLC grade</td>
			<td>Alps Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl alcohol, i.e. reagent grade</td>
			<td>Nihon Shiyaku Reagent</td>
			<td>EA448652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image processing software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB R2009a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>computational fluid dynamics package</td>
			<td>ESI group</td>
			<td>CFD-ACE+ 2008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mixing inhomogeneity in a microfluidic device by microscale schlieren technique

Dans cet article, nous introduisons l&#39;utilisation de la technique de micro-schlieren pour mesurer le mélange inhomogénéité dans un dispositif microfluidique. Le système schlieren microscopique est construit à partir d&#39;un Hoffman contraste de modulation microscope, qui offre un accès facile à l&#39;arrière plan focal de l&#39;objectif, en retirant la plaque à fente et le remplacement du modulateur avec un couteau. Le principe de fonctionnement de la technique strioscopique microscopique repose sur la détection de déviation de la lumière provoquée par une variation d&#39;indice de réfraction de 1 à 3. La lumière déviée soit échappe ou est obstrué par le couteau pour produire un brillant ou une bande sombre, respectivement. Si l&#39;indice de réfraction du mélange varie linéairement avec la composition, la variation locale de l&#39;intensité lumineuse dans le plan d&#39;image est proportionnelle au gradient de concentration normale à l&#39;axe optique. L&#39;image de la micro-schlieren donne une projection en deux dimensions de la lumière produite par inhomogénéité perturbé tridimensionnel. Pour réaliser une analyse quantitative, on décrit une procédure d&#39;étalonnage qui mélange deux fluides dans un microcanal-T. Nous réalisons une simulation numérique pour obtenir le gradient de concentration dans le T-microcanaux qui est étroitement corrélée avec l&#39;image de micro-schlieren correspondante. Par comparaison, une relation entre les lectures d&#39;échelle de gris de l&#39;image de la micro-Schlieren et les gradients de concentration présentées dans un dispositif microfluidique est établie. En utilisant cette relation, nous sommes en mesure d&#39;analyser l&#39;hétérogénéité de mélange de l&#39;image de micro-Schlieren associé et de démontrer la capacité de la technique de schlieren microscopique avec des mesures dans un oscillateur microfluidique 4. Pour les fluides optiquement transparents, technique schlieren microscopique est un outil de diagnostic attrayant pour fournir de l&#39;information instantanée plein champ qui conserve les caractéristiques tridimensionnelles du processus de mélange.

Le rapport en niveaux de gris I / 0 nombre de Reynolds sous différents pour les deux gradients positifs et négatifs de la fraction de masse est représenté (Figure 2) avec une bande symétriques apparaissant dans le milieu de la T-microcanaux. A faible nombre de Reynolds, la queue de la bande schlieren agrandi et floue en raison de la dispersion à travers l&#39;interface de mélange. Comme le nombre de Reynolds augmente, la longueur de diffusion raccourcit menant à une bande plu...

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Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse Inhomogénéité mélange dans un dispositif microfluidique par Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K vues.  National Taiwan University. Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image. 

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Un dispositif microfluidique pour l&#39;étude de plusieurs souches distinctes

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Une technique microfluidique à la sonde cellulaire Déformabilité

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Couche par couche dépôt de collagène dans les dispositifs microfluidiques pour Microbroyeur stabilisation

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Irrigables réseau vasculaire avec un modèle de tissu dans un dispositif microfluidique

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as acute respiratory distress syndrome (ARDS) and ventilator-induced lung injury (VILI). However, studies in microfluidic channels with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung currently face several challenges, especially due to difficulties in establishing appropriate cell culture conditions, including media flow rates, within a given culture environment. The presented protocol describes an image-based approach to evaluate the structure of NCI-H441 human lung epithelial cells cultured in an oxygen-impermeable microfluidic channel with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung. Using phalloidin-based filamentous-actin staining, the cytoskeletal structures of the cells are revealed by confocal laser scanning microscopy, allowing for the visualization of individual as well as layered cells. Subsequent quantification determines whether the cell culture conditions being employed are producing uniform monolayers suitable for further experimentation. The protocol describes cell culture and layer evaluation methods in microfluidic channels and traditional fixed-well environments. This includes channel construction, cell culture and requisite conditions, fixation, permeabilization and staining, confocal microscopic imaging, image processing, and data analysis.

The presented protocol describes the development and use of a phalloidin-based filamentous-actin staining technique with confocal laser scanning microscopy (CLSM) to visualize adherent cell layer structure in microfluidic dynamic-culture channels and traditional fixed-well static-culture chambers. This approach aids in evaluating cell layer confluency, monolayer formation, and layer-thickness uniformity.

Préparation et évaluation structurale de monocouches de cellules épithéliales dans un dispositif de culture microfluidique de taille physiologique

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...