Nous remercions Laurie Destroismaisons et Sarah Peyrard pour le support technique exceptionnelle et Dr.Alexandre Prat pour l&#39;accès au cytomètre de flux. Nous tenons également à remercier le Dr Timothy Miller pour sa contribution en ce qui concerne la suppression de la myéline des préparations. Ce travail a été financé par les Instituts canadiens de recherche (IRSC) partenariat pour la santé de recherche neuromusculaire, la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, Société de la SLA du Canada, la Fondation Frick recherche sur la SLA, Fondation du CHUM et le Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV). Les deux CVV et NA sont Chercheurs-boursiers du Fonds de la Recherche en Santé du Québec et nouveaux chercheurs des IRSC. SP est soutenu par Tim Noël de stagiaire de la Société canadienne de la SLA.

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traitées en stricte conformité à un protocole (N08001CVsr) approuvé par le du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal (CRCHUM) Commission institutionnelle du Centre de Recherche pour la protection des animaux qui est conforme aux normes nationales telles que définies par le Canadien Conseil de protection des animaux (CCPA). Préparer tous les réactifs nécessaires pour effectuer ce protocole (tableau 1). Tous les autres détails concernant l&#39;équipement, les fournitures et fournisseurs peuvent être trouvés dans la liste des matériaux. <img alt="Tableau 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> Tableau 1 Compositions tampons. 1 Collection de Rat moelle épinière <ol><li> Profondément anesthésier le rat (Sprague Dawley) avec 4% isoflorane. Vérifiez anesthésie par un manque de réflexe sur le pincement de ee patte. Euthanasier le rat par décapitation par guillotine. Cette méthode d&#39;euthanasie est préférée à d&#39;autres, ce qui pourrait fausser la moelle épinière. </li><li> Couper la peau du dos pour exposer la colonne vertébrale. Couper la colonne vertébrale avec des ciseaux d&#39;os juste au-dessus de l&#39;os iliaque. Visualiser l&#39;ouverture de la colonne vertébrale. </li><li> Insérer une seringue de 10 ml, avec une pointe de 200 ul de pipette (lié par l&#39;intermédiaire de fusion légèrement supérieur à la flamme), rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), dans la colonne vertébrale. </li><li> Rincer la moelle épinière par l&#39;application d&#39;une quantité moyenne de pression sur le piston. </li><li> Si du sang est présent sur la moelle épinière, rincer avec du PBS avant de passer à l&#39;étape suivante. NOTE: Cette méthode a également été validé pour le cerveau et le foie. Si y compris ces tissus, de recueillir la moitié du cerveau de rat euthanasié et un morceau de foie poids égal à la moelle épinière. Toutes les autres étapes restent identiques. </li></ol> 2 Isolement de la moelle épinière Mitochondria (Adapté de Vande Velde et al. 4) <ol><li> Recueillir l&#39;ensemble de la moelle épinière et le lieu intact dans 5 ml homogénéiseur en verre avec 5 volumes (~ 3,25 ml) Homogénéisation tampons (HB). Pour une récupération optimale des mitochondries isolées, effectuer toutes les étapes sur la glace ou dans une chambre froide. Homogénéiser le tissu à la main jusqu&#39;à ce que plus de gros morceaux de tissu restent, à environ huit coups. Placez homogénat en deux (2 ml) ou trois (1,7 ml) microtubes. Centrifugeuse de 1300 xg pendant 10 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse de paillasse. </li><li> Récupérer le surnageant et le placer dans un tube d&#39;ultracentrifugation de 5 ml. Ajouter 750 pi (~ 0,5 volumes) HB au microtube contenant des pastilles et remettre en suspension le culot doucement. Répéter les étapes centrifugation et remise en suspension deux fois de plus. Piscine tous les surnageants (S1a et S1b) dans le même tube d&#39;ultracentrifugation 5 ml ci-dessus. Cette étape sert à éliminer les petits débris. </li><li> Centrifugeuse regroupé S1 en utilisant une ultracentrifugation équipé d&#39;une pourriture à godets oscillantsou et centrifuger à 17 000 g pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Gardez surnageant (S2) pour un traitement ultérieur si la fraction cytosolique est d&#39;intérêt (par exemple pour l&#39;analyse Western blot). Remettre en suspension le culot (P2), la fraction mitochondriale brute, dans 4 ml de HB + 50 mM de KCl. Centrifuger 17 000 xg pendant 15 min à 4 ° C dans un rotor à godets oscillants. Jeter le surnageant et remettre délicatement le culot (P3) dans 800 ul HB. REMARQUE: Les mitochondries sont lavées avec mM KCl + HB 50 pour éliminer tous les contaminants associés mitochondries non spécifiques. </li><li> Dans un nouveau tube de 5 ml ultracentrifugation, ajouter exactement 800 ul d&#39;extrait concentré (P3). </li><li> Pour ajouter ce tube, 200 pl d&#39;iodixanol (milieu à gradient de densité), créant de ce fait une concentration finale de 12% iodixanol. Mélanger le contenu du tube en douceur, mais en profondeur par pipetage avec un P1000. L&#39;addition d&#39;iodixanol première, et pastille, puis remis en suspension (P3) peut être préférable pour faciliter un mélange complet. Centrifuger dans un ultracentrifuge équipé d&#39;un godet rotor oscillant à 17 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> REMARQUE: foie ne contient pas de myéline et donc cette étape n&#39;est pas nécessaire si ce n&#39;est que le foie est en cours de traitement. Cependant, si le foie est en cours en même temps que les mitochondries du système nerveux central, il est recommandé de traiter tous les tissus également. </li><li> Aspirer la couche de myéline dans la partie supérieure du tube et retirez soigneusement et jeter le surnageant. Pellet peut être lâche. Reprendre le culot dans 4 ml HB. Centrifugeuse à nouveau à 17 000 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 4 ml HB. Répétez la centrifugation et éliminer le surnageant. </li><li> Reprendre le culot final (P7) à 100-200 pi HB et transférer dans un tube de 1,7 ml à centrifuger. Cet échantillon contient des mitochondries isolées. </li><li> Passez à la quantification des protéines. Diluer les échantillons et la courbe standard dans 2% de dodécyl sulfate de sodium (SDS) pour assurer une solubilisation suffisante des mitochondries during protéine quantification. </li></ol> 3 immunomarquage des mitochondries isolées de cytométrie en flux <ol><li> Pour chaque mélange de coloration à tester, une pipette 25 pg de mitochondries isolées dans un tube à centrifuger de 1,7 ml. Inclure un échantillon non coloré dans chaque expérience; et pour chaque anticorps, n&#39;oubliez pas d&#39;inclure un échantillon pour le contrôle isotypique approprié. </li><li> Centrifuger à 17 000 g pendant 2 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse de paillasse. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension les mitochondries isolées dans 50 ul de tampon de mitochondries (M Buffer) additionné de 10% de BSA acide gras libre pendant 15 min à 4 ° C (étape de blocage). REMARQUE: Lors de l&#39;étiquetage, effectuer des incubations dans un réfrigérateur à 4 ° C. </li><li> Ajouter anticorps primaire (de lapin anti-Mfn2, 20 ug par ml) au tube et incuber pendant 30 min à 4 ° C. NOTE: Déterminer la concentration optimale de chaque anticorps empiriquement par titrage. En raison de la variabilité de la concentration et / ou la purity, différents lots d&#39;un même anticorps à partir du même fabricant, peuvent conduire à des résultats différents; donc titrage est nécessaire pour chaque nouveau lot d&#39;anticorps. </li><li> Laver anticorps primaire non lié: Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre délicatement le culot dans 200 ul de tampon M. Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 50 ul M tampon. </li><li> Ajouter l&#39;anticorps secondaire (anti-lapin d&#39;âne IgG phycoérythrine (PE), 0,5 pg par ml) à tube et incuber les échantillons pendant 30 min à 4 ° C, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Laver anticorps secondaire non lié: Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Enlever le surnageant et remettre le culot dans 200 pi M tampon. Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul M tampon. </li><li> Pour assurer événements sont en fait des mitochondries, taches isolé mitochondries avec unemitochondries colorant fluorescent spécifique pendant 15 min à température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. Si une coloration d&#39;autres paramètres fonctionnels (potentiel transmembranaire mitochondrial ou de production de superoxyde) est souhaitée, passez à l&#39;étape 4 Si non, passez à l&#39;étape 5 pour l&#39;acquisition. NOTE: Il est important de vérifier que le spectre d&#39;émission de l&#39;anticorps secondaire est compatible avec celle des colorants fonctionnels. Par exemple, si la vérification de la pureté mitochondrial avec un colorant commercial avec des propriétés spectrales similaires à potentiel transmembranaire avec FITC et tétraméthylrhodamine ester méthylique (TMRM), un anticorps secondaire serait viable allophycocyanine (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Ajouter des contrôles de compensations, à savoir, un échantillon immuno-ou teinté avec un fluorophore unique, le cas échéant. </li><li> Transférer dans un tube approprié pour le débit de chargement cytomètre. (Pour faciliter la petite taille de l&#39;échantillon, un tube de microtitration est placé à l&#39;intérieur 3 ml cytomètre en flux tube.) Conserver les échantillons sur la glace et procéder immédiatement àcytomètre en flux pour l&#39;acquisition. </li></ol> 4 Dosage mitochondrial potentiel transmembranaire mitochondrial et production de superoxyde par cytométrie en flux <ol><li> Vérifiez que les mitochondries isolées ont un potentiel transmembranaire intacte par coloration avec 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, à l&#39;étape 3.8, pendant 15 min à température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. Pour comparaison du potentiel transmembranaire entre les échantillons et les populations, l&#39;utilisation des concentrations inférieures / non-extinction de TMRM (1 à 30 nM), peut être plus approprié 6. <ol><li> En tant que témoin pour TMRM coloration, teinture mitochondries isolées avec 100 nM TMRM en présence de 100 uM carbonyl cyanide m-chloro phényl hydrazine (CCCP), un découpleur mitochondrial qui dépolariser les mitochondries. La concentration de CCCP nécessaire pour dépolariser les mitochondries peut être moindre si des concentrations plus faibles de colorant sont utilisés. </li></ol></li><li> Vérifiez que les mitochondries isolées produisent dismutase mitochondriale par staining avec un indicateur approprié de la superoxyde mitochondriale 7, également à l&#39;étape 3.8, pour 15 minutes à température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. <ol><li> En tant que contrôle pour la production de superoxyde mitochondriale, de la teinture des mitochondries isolées de colorant en présence de 10 pM antimycine A, un inhibiteur de complexe III de la chaîne respiratoire qui va augmenter la production de superoxyde mitochondriale. </li></ol></li></ol> 5 Acquisition et analyse de immunomarquées mitochondries isolées par cytométrie en flux <ol><li> Instrument mis en place: des tensions de commutation de linéaire en mode Connectez-vous pour faciliter l&#39;analyse des mitochondries isolées et les tensions prévues (FSC: 450; SSC: 250). Veiller à ce que les événements sont collectés dans des FSC mode A (zone), ainsi que FSC-W (largeur) et FSC-H (hauteur), pour être en mesure d&#39;exclure doublets (c&#39;est à dire, deux événements, en passant par le détecteur en même temps ) dans la collecte de post-analyse des données. Définissez le nombre d&#39;événements à collecter à 100.000. Acquérir des contrôles de compensation, Le cas échéant. </li><li> L&#39;acquisition des données: Avant l&#39;acquisition des données, éviter vortex échantillons. Au lieu de mélanger en tapotant doucement tube. Initialement, les événements à collecter une faible pression, au cours de déclenchement. Porte sur la population totale. Ajuster les tensions d&#39;histogrammes en conséquence, habituellement au sommet de l&#39;échantillon non coloré correspond à la deuxième décennie (10 2). Une fois les portes sont établis, et les échantillons sont en cours de traitement, la pression peut être réglé à sa grande. </li><li> Analyse: Visualisez doublets en traçant FSC-W en fonction de FSC. Identifier les maillots et les doublets. Porte sur maillots. Sélectionnez la population mitochondriale par gating sur les événements qui sont colorées positivement avec un colorant mitochondrial sélectif. </li><li> Déterminer l&#39;étiquetage de fond du contrôle isotypique. Utilisation de l&#39;échantillon témoin d&#39;isotype, déterminer le pourcentage de la population mitochondriale marquage des anticorps dirigés contre Mfn2. </li></ol>

<ol>
	<li>Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+in+neurodegeneration.">Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.</a> Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).</li><li>Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+intracellular+organelle+function+using+fluorescent+probes:+from+animalcules+to+quantum+dots.">Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots.</a> Circ Res. 95, 239-252 (2004).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+five+dimensions:+time-dependent+membrane+potentials+in+individual+mitochondria.">Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria.</a> Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50, 98-115 (2011).</li><li>Xu, X., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+determination+of+superoxide+release+at+both+sides+of+the+mitochondrial+inner+membrane+by+capillary+electrophoretic+analysis+of+the+oxidation+products+of+triphenylphosphonium+hydroethidine.">Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine.</a> Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).</li><li>Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+function+and+regulation+of+mitochondrial+fission.">New insights into the function and regulation of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).</li><li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria.">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li><li>Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+mitochondrial+heterogeneity+tell+us+about+mitochondrial+dynamics+and+autophagy.">What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).</li><li>Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Il est de plus en plus évident que les mitochondries sont des acteurs clés dans les deux physiologie normale et la maladie. Bien immuno peut déterminer quelles protéines se trouvent dans les mitochondries ou à la surface des mitochondries dans un certain état, cette méthode des rapports sur la moyenne de l&#39;ensemble de la population. Cette méthode ne peut pas donner d&#39;informations sur l&#39;abondance relative des sous-populations ou sous-ensembles mitochondriales. Bien qu&#39;il ait été supposé précé...

Les mitochondries sont des organites très dynamiques qui subissent de multiples séries de fission et de fusion, sont transportés vers les sites de forte demande d&#39;énergie et répondre rapidement aux stimuli physiologiques 1. Comme il est de plus en plus reconnu que les mitochondries dans différents tissus, même différents compartiments cellulaires, ont des profils fonctionnels distincts, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour identifier ces sous-ensembles mitochondriales distinctes. Microscopie fournit un moyen par lequel les mitochondries individuels peuvent être visualisés et la présence d&#39;une protéine ou à des mitochondries peut être déterminée par immunofluorescence 2. Cependant, l&#39;analyse quantitative par cette méthode demande beaucoup de travail et est plus appropriée pour des expériences utilisant des lignées cellulaires immortalisées ou primaires. L&#39;étude des mitochondries individu provenant de tissus est beaucoup plus difficile et la plupart des méthodes ne permettent pas d&#39;identifier facilement les sous-ensembles mitochondriales en même temps que l&#39;évaation de la fonction mitochondriale 3. Afin de remédier à cet obstacle, une nouvelle méthode pour immunolabel mitochondries isolées de tissus de rongeurs et par la suite analysées par cytométrie de flux a été développé. Ceci permet la détection rapide et la quantification des protéines localisées sur la membrane externe des mitochondries, ce qui par rapport à l&#39;analyse par microscopie, est beaucoup moins de travail et permet l&#39;analyse de milliers de mitochondries dans un seul échantillon. Cet essai peut être appliqué pour contrôler le sort et la quantité relative des mitochondries des protéines de la membrane externe qui sont censés être constitutivement présent à la mitochondrie, le recrutement de protéines de la surface mitochondriale, ou la détection de protéines mislocalized vers les mitochondries dans des conditions pathologiques. En outre, l&#39;incorporation de colorants indicateurs fluorescents conventionnels permet l&#39;évaluation simultanée de certains aspects de la fonction mitochondriale dans des mitochondries distinctesous-populations.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:349px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:543px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Rats</td>
			<td style="width:349px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain code 400</td>
			<td style="width:543px;">Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:349px;">Kontes Glass Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">885450-0022</td>
			<td>Duall 22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:349px;">Beckman Coultier</td>
			<td style="width:119px;">344057</td>
			<td>Transparent, thin walled&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sorvall Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall WX UltraSeries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">AH-650 rotor and buckets&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:267px;">Opti-prep</td>
			<td style="width:349px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:119px;">1114542</td>
			<td>Iodixanol, density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8806</td>
			<td>Must be fatty acid free for mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sodium succinate dibasic hexahydrate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:267px;">Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:267px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:349px;">Jackson Immuno Research&#160;</td>
			<td style="width:119px;">011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Anti-Rabbit IgG PE</td>
			<td style="width:349px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">12-4739-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Micro titer tube</td>
			<td style="width:349px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">223-9391</td>
			<td>For sample acquisition by flow cytometry&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoTrackerGreen (MTG)</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td>100 nM: Ex490 nm/Em516 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">TMRM</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T668</td>
			<td>100 nM: Ex548 nm/Em574 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CCCP</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoSOX Red</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M36008</td>
			<td>5 &#181;M: Ex540 nm/Em600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BS FACSDiva Software</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FlowJo</td>
			<td style="width:349px;">TreeStar Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software used for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">BCA protein assay kit&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td style="width:543px;">Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

Les méthodes de détection et de surveiller mitochondriales composants extérieurs de protéines membranaires dans les tissus animaux sont essentiels pour étudier la physiologie mitochondriale et la physiopathologie. Ce protocole décrit une technique où les mitochondries isolées à partir de tissus de rongeurs sont immunomarquées et analysées par cytométrie en flux. Les mitochondries sont isolées à partir de moelle épinière de rongeurs et soumis à une étape d&#39;enrichissement rapide de manière à éliminer la myéline, un contaminant majeur des fractions mitochondriales préparés à partir de tissu nerveux. Mitochondries isolées sont ensuite marquées avec un anticorps de choix et un anticorps secondaire conjugué à fluorescence. Analyse par cytométrie en flux vérifie la pureté relative de préparations mitochondriales par coloration avec un colorant spécifique des mitochondries, suivie de la détection et la quantification de la protéine immuno-. Cette technique est rapide, quantifiable et à haut débit, ce qui permet l&#39;analyse de centaines de milliers de mitochondries par échantillon. Il est applicable à évaluer roman proteins à la surface mitochondriale dans des conditions physiologiques normales, ainsi que les protéines qui peuvent devenir mislocalized à cet organite pendant pathologie. Fait important, cette méthode peut être couplé à des colorants fluorescents indicateurs de rendre compte de certaines activités de sous-populations mitochondriales et pour les mitochondries est possible à partir du système nerveux central (cerveau et moelle épinière), ainsi que le foie.

Les mitochondries dérivées de la moelle épinière chez le rat peuvent être immunomarquées avec un anticorps cible à Mitofusin2 (Mfn2), une protéine impliquée dans la fusion de la membrane externe des mitochondries 8. Suite à l&#39;isolation et l&#39;étiquetage avec un anticorps spécifique Mfn2 et un anticorps secondaire conjugué à fluorescence, les mitochondries sont traitées par cytométrie de flux (figure 1). Suite à l&#39;acquisition de données, les échantillons sont analy...

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Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Décrit ici est un procédé pour détecter et quantifier les protéines de la membrane externe des mitochondries par immunomarquage des mitochondries isolées à partir de tissus et l&#39;analyse par cytométrie en flux rongeur. Cette méthode peut être étendue à évaluer les aspects fonctionnels des sous-populations mitochondriales.

Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K vues.  Université de Montréal, CRCHUM.  Décrit ici est un procédé pour détecter et quantifier les protéines de la membrane externe des mitochondries par immunomarquage des mitochondries isolées à partir de tissus et l'analyse par cytométrie en flux rongeur. Cette méthode peut être étendue à évaluer les aspects fonctionnels des sous-populations mitochondriales. 

Vidéo: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Recherche

Biologie

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.

MitoCeption: Transfert humain isolé MSC mitochondries à glioblastome cellules souches

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...