Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthieu Hsu, Jehangir Mistry et Michele Hatler de soutien lors du développement de ces projets et protocoles.

Préparation des cellules: <ol><li> Avant de semer la cellule pour le dosage, la culture des neurones / astrocytes dans les milieux de croissance jusqu&#39;en ~ confluentes à 70-80% (sauf si la cellule de semis directement à partir de dégel ou d&#39;isolement). </li><li> Détachez les cellules de flacons de culture / plaques par la méthode appropriée pour le type de cellule d&#39;intérêt. Si nécessaire, des puits d&#39;essai manteau de la plaque avec les protéines de la matrice poly-D-lysine ou extracellulaire pour améliorer l&#39;adhérence cellulaire. Co-cultures astrocytes et les neurones de l&#39;peuvent être ensemencées simultanément ou successivement. Pour ensemencements séquentielle, le placage des astrocytes abord comme un «basale» couche est recommandée, suivie par l&#39;ensemencement et la différenciation neuronale, si nécessaire. Ajuster la densité des cellules en fonction de type cellulaire, le temps de la culture subséquente, les paramètres d&#39;intérêt, etc Selon l&#39;âge de la culture, source de cellules et de la densité de semis, les cultures primaires peuvent varier considérablement en raison de la prolifération, l&#39;expression de la GFAP ou neurites - il est important de caractériser et d&#39;optimiser votre système de pile à fournir la meilleure pertinence biologique pour votre modèle expérimental, ainsi que pour fournir de l&#39;imagerie efficace, la segmentation et l&#39;analyse en utilisant HCS (voir Figure 1). Après l&#39;ajout de cellules à l&#39;assiette (les cellules peuvent être ensemencées dans 90 uL des médias, afin de faciliter le traitement de toxine telle que décrite à l&#39;étape 3 ci-dessous), permettent la plaque de s&#39;asseoir sur une surface plane à la température ambiante pendant 15-30 min, permettant la distribution, même cellule. Après cette période, les cellules incuber dans un milieu de croissance (37 ° C / 5% CO 2) pendant au moins 24 heures, puis passer à une différenciation des conditions de culture (par exemple, peu de sérum / NGF cellules PC12), le cas échéant. Poursuivre la culture jusqu&#39;au niveau souhaité cellules atteignent la confluence ou de la différenciation, l&#39;évolution des médias, à intervalles appropriés pour le type de cellule. </li><li> Traitements par les cellules (composés de contrôle, composés d&#39;essai, etc) peuvent être introduites à tout moment pendant cette période de culture, comme il convient pour le temps-durée du traitement de l&#39;intérêt. L&#39;acrylamide, le peroxyde d&#39;hydrogène et le K-252a sont fournis sous forme de composés de contrôle neurotoxiques. Réactifs suffisants soient dégagés pour reproduire en 12 points des courbes dose-réponse (y compris un dH 2 O ou le DMSO-contrôle mis dans la dose-réponse) pour tous les cinq plaques de 96 puits. Les composés sont fournis à une concentration 250X (pour le K-252a, en supposant un traitement maximal de 1 uM) ou 10X (pour l&#39;acrylamide et le peroxyde d&#39;hydrogène, en supposant que les traitements maximum de 100 mM et 10 mM, respectivement). Le traitement recommandé consiste à préparer un demi-log (1: √ 10) de dilution en série du composé dans le DMSO 250X, suivi par dilution en tampon de dilution composé 10X (10X composés de contrôle originaires de dH 2 O peut être dilués en série directement dans stériles dH 2 O Tampon de dilution ou composé). 10 uL de chaque traitement peut alors être ajouté à la 90 uL de milieu de culture déjà présente dans chaque puits, pour une concentration finale 1X (0,4% de DMSO ou 10% dH 2 O). Exemple de données est prévue pour 24 ou 96 heures de traitement composé à 37 ° C avant la fixation. </li></ol> Fixation des cellules et coloration par immunofluorescence: Remarque: le temps de coloration est ~ 2,5 heures après la fixation. Ne laissez pas les puits de sécher entre les étapes de coloration. L&#39;aspiration et la dispensation des réactifs doit être effectuée à faible débit pour réduire toute perte cellulaire due au cisaillement de fluides. Tous les recommandés »par puits« volumes se référer à un seul puits d&#39;une microplaque de 96 puits. Tous les recommandés »par plaque de 96 puits&quot; volumes comprennent l&#39;excès de 25% pour la perte de volume de liquide de traitement. Toutes les étapes de coloration sont réalisées à température ambiante (RT). Tous les tampons et les solutions d&#39;anticorps sont stables pendant au moins 24 heures à TA. <ol start="4"><li> À la fin de la période de culture, préchauffer solution de fixation HCS (2X) à température ambiante (RT) ou 37 º C si désiré (12 plaques mL/96-well). Dans une hotte, ajouter 100 ul / puits directement aux milieux de culture et de permettre de fixer pendant 30 min à température ambiante. Retirer fixateur / toxines contenant des médias et les éliminer dans le respect de la réglementation pour les déchets dangereux (voir fiche). Si procéder immédiatement à la coloration, rincer chaque puits deux fois avec 200 pi de tampon d&#39;immunofluorescence HCS. Alternativement, si les plaques doivent être colorées à un moment plus tard, rincer deux fois avec 200 pi de tampon de lavage, puis laissez second rinçage de volume dans les puits et les plaques magasin hermétiquement fermés à 4 º C jusqu&#39;à coloration. </li><li> Si les échantillons fixés ont été stockés à 4 º C avant la coloration, rincer deux fois avec 200 pi de tampon d&#39;immunofluorescence HCS avant de procéder à protocole de coloration. </li><li> Préparer la solution de travail de lapin anti-tubuline βIII / Souris Anticorps anti-GFAP HCS primaire (6 plaques mL/96-well) comme suit: Ajouter 60 uL de chaque anticorps primaires décongelés à 5,88 ml de tampon d&#39;immunofluorescence HCS. Mélangez bien. Retirer précédente tampon d&#39;immunofluorescence rincer. Ajouter 50 ul de solution d&#39;anticorps primaire dans chaque puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Éliminer l&#39;anticorps primairesolution. Rincer trois fois avec 200 pi de tampon d&#39;immunofluorescence HCS. </li><li> Préparer la solution de travail de HCS Anticorps secondaire / Hoechst nucléaire HCS Stain (6 plaques mL/96-well) comme suit: Ajouter 30 uL de chaque anticorps décongelés secondaire et 30 uL d&#39;décongelés nucléaire Hoechst Stain HCS à 5,91 ml de tampon d&#39;immunofluorescence HCS. Mélangez bien, la protection de solution à partir de la lumière. Retirer précédente HCS immunofluorescence Tampon rincer. Ajouter 50 uL de HCS Anticorps secondaire / Hoechst HCS solution de colorant nucléaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante, protégé de la lumière. </li><li> Retirer HCS secondaire Antibody / Hoechst HCS solution de colorant nucléaire. Rincer deux fois avec 200 pi de tampon d&#39;immunofluorescence HCS. </li><li> Retirer précédente HCS immunofluorescence Tampon rincer. Rincer deux fois avec 200 uL de tampon de lavage HCS, laissant second rinçage de volume dans les puits. </li><li> Plaque de plaque d&#39;étanchéité et de l&#39;image immédiatement, ou conserver à 4 º C protégé de la lumière jusqu&#39;au moment de l&#39;imagerie. </li></ol> Acquisition et analyse des images: <ol start="12"><li> Imagerie et l&#39;analyse des plaques colorées peuvent être effectués sur une variété de plates-formes HCS disponibles, y compris l&#39;EN analyseur de cellules (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Scientific) ou Opera (Perkin Elmer). Certaines lignes directrices pour l&#39;imagerie et l&#39;analyse sont présentés au tableau 1: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 Directives Image Acquisition </td></tr><tr><td> Réactif de détection </td><td> Objectif Objectif </td><td> Gamme filtre d&#39;excitation [pic / bande passante (nm)] </td><td> Filtre d&#39;émission Range [pic / bande passante (nm)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS colorant nucléaire </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (535/50 ou, si nécessaire) </td></tr><tr><td> HCS anticorps secondaire, FITC-Donkey IgG anti-lapin </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS anticorps secondaire, Cy3-Donkey IgG anti-souris </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 directives d&#39;analyse d&#39;images </td></tr><tr><td> Paramètre de maille </td><td> Détection </td><td> Segmentation / Mesure </td><td> Justification </td></tr><tr><td> Nombre de cellules, caractéristiques nucléaires </td><td> Hoechst HCS colorant nucléaire </td><td> La région nucléaire (460 nm canal d&#39;émission). Compter le nombre de noyaux. Le contenu en ADN (intensité nucléaire) ou d&#39;analyses domaine nucléaire sont également possibles. </td><td> Utilisez le numéro de cellulaire, caractéristiques nucléaires afin de déterminer la perte de cellules, les phénotypes de toxicité, etc Pouvez «filtre» des noyaux à ceux associés à βIII-tubuline ou expression GFAP pour obtenir séparée numération des cellules neuronales et astrocytaires / caractérisations (fortement recommandé). </td></tr><tr><td> βIII-tubuline expression, la croissance des neurites </td><td> HCS anticorps secondaire, conjuguée au FITC </td><td> Région cytoplasmique (535 nm d&#39;émission de canal). Signaux FITC peuvent être utilisés pour distinguer les corps cellulaires neuronaux de neurites (par exemple, via minimum / moyenne des zones du corps cellulaire, les longueurs des neurites minimum / maximum et largeurs). Déterminer les paramètres comme la longueur des neurites total, compte neurites / cellulaire, etc </td><td> Mesures excroissance des neurites peut être modulée lors de la différenciation neuronale ou à la suite d&#39;une blessure chimique, états de maladie, etc Pouvez «filtrer» les corps cellulaires pour ceux associés à βIII-tubuline l&#39;expression pour obtenir la caractérisation distincts neuronale (fortement recommandé). </td></tr><tr><td> Expression GFAP, Zone astrocytes </td><td> HCS anticorps secondaire, Cy3-conjugués </td><td> Région cytoplasmique (600 nm canal d&#39;émission). Signal en Cy3 peut être utilisé pour définir la segmentation astrocytaire cytoplasmique. Déterminer les paramètres tels que l&#39;intensité moyenne du signal cytoplasmique, la zone de cellules, etc </td><td> L&#39;expression la GFAP et de la zone de cellules astrocytaires peuvent être modulés au cours du développement des astrocytes ou en raison d&#39;une blessure chimique, états de maladie, etc Pouvez «filtrer» les corps cellulaires pour ceux associés à une expression GFAP pour obtenir la caractérisation distincts astrocytaires (fortement recommandé). </td></tr></tbody></table> . Tableau 1 Image Directives acquisition et d&#39;analyse - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (co-culture) Assay Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="Figure 3" /> Figure 1. βIII-tubuline et de la GFAP immunofluorescence des cultures mixtes de cellules neurales chez le rat. Co-cultures d&#39;astrocytes primaires de rat hippocampe soit avec les neurones primaires de rat hippocampe de rat ou cellules PC12 ont été générés par les astrocytes plaquage pendant plusieurs jours dans la culture, suivie par l&#39;ensemencement des neurones. Neurones primaires ont été cultivées pendant 11 autres jours, tandis que PC12 ont été cultivées pendant 2 jours dans des conditions de différenciation (faible taux sérique / NGF). La manipulation des cellules, la fixation et immunomarquage ont été effectués selon les protocoles HCS222 dosage. Les cellules ont été imagées sur les GE en cellule d&#39;analyse 1000 (3.3) à 20X (neurones primaires) ou 10X grossissement de l&#39;objectif (PC12) et analysées à l&#39;aide de la GE en cellule d&#39;analyse 1000 Workstation (3,4) neurites et Multi algorithmes d&#39;analyse de la cible panneau supérieur.: Les images fusionnées de Hoechst HCS Stain nucléaire (bleu), βIII-tubuline (vert) et GFAP (en rouge) par fluorescence. Une analyse distincte du canal de fluorescence βIII-tubuline permet une segmentation neurites (panneau du milieu: les corps cellulaires en bleu (les neurones primaires) ou jaune (PC12), neurites en vert (neurones primaires) ou bleu clair (PC12)). Analyse de la chaîne GFAP permet une segmentation des astrocytes (panneau du bas: noyaux en bleu, le cytoplasme en vert). La segmentation de la GFAP primaires d&#39;hippocampe de rat neurone / astrocytes de co-culture démontre la capacité de distinguer entre les noyaux / cellules des organismes qui sont GFAP (+) (vert contours) et ceux qui sont GFAP (-) (rouge), permettant à nombre de cellules séparées pour neurones et les astrocytes dans un paramètre de culture mixte. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="Figure 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="Figure4 part2" /> Figure 2. Réponses à la dose de rat primaires hippocampiques neurone / co-cultures astrocytes aux stress toxiques. Astrocytes primaires de rat hippocampique (P6) ont été déposées sur les plaques 96 puits dans les milieux de croissance et cultivées pendant 6 jours. Neurones hippocampiques primaires de rat (direct de dégel) ont ensuite été ensemencées sur le dessus de la pré-plaqués astrocytes et cultivées dans un milieu de croissance pendant 11 jours. Les cellules ont été traitées avec des dilutions successives de peroxyde d&#39;hydrogène ou de l&#39;acrylamide (max. concentrations = 100mm et 10mm, respectivement) pour les 24 dernières heures de culture. La manipulation des cellules, la fixation et immunomarquage ont été effectués selon les protocoles HCS222 dosage. Les cellules ont été imagées sur les GE en cellule d&#39;analyse 1000 (3.3) à 20X (10 champs / puits) et analysés (nucléaire / cytoplasmique / neurites segmentation) en utilisant les GE en cellule d&#39;analyse 1000 Workstation (3,4) neurites et Multi algorithmes d&#39;analyse cible. Les données présentées sont des moyennes ± SEM, n = 3. Plusieurs paramètres (neurites, l&#39;intensité GFAP, la zone des astrocytes et des numérations cellulaires neuronales ou astrocytaires) ont été étudiés pour dose-dépendante des tendances.

<ol>
	<li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro:+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth.">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li><li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening.">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li><li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta(1-42)+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons:+A+quantitative+analysis.">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li><li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. 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J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems.">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li><li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allegory+of+a+mountain:+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology.">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li><li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+neurotoxicity+test-system,+using+human+post-mitotic,+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture.">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li><li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol,+trimethyltin+chloride+and+acrylamide.">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li><li>R&#246;hl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures.">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li><li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein:+GFAP-thirty-one+years+(1969-2000).">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li><li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK/c-Jun+signaling+pathway.">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li><li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity.">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li><li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes,+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells:+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity?.">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?.</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li><li>Balls, M., Walum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11:+towards+the+acceptance+of+in+vitro+neurotoxicity+tests.">Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests.</a> Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).</li><li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias.">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li><li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord:+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes.">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li><li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+(SH-SY5Y)+in+vitro.">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li><li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species.">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li><li>Crist&#242;fol, R. 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Les auteurs sont tous des salariés de Millipore Corporation.

À ce jour, dans des expériences in vitro destiné à étudier l&#39;évaluation du risque de neurotoxicité utilisant des cultures mixtes de neurones et les astrocytes ont été limitées. Il est bien admis que les cellules gliales sont partie intégrante de fournir un soutien spatiale et métabolique pour les neurones, et jouent un rôle essentiel dans la modulation de plusieurs fonctions neuronales, y compris la migration neuronale, la différenciation et l&#39;activité synaptique. Astrocytes gliales libèrent également des cytokines et d&#39;autres facteurs solubles qui sont capables de tant de tolérance induisant des réactions indésirables dans les tissus environnants neuronale, ainsi que la promotion neuronale de nombreuses toxines. Démontrer la profondeur de neurones-glie interactions, en co-culture des études, les astrocytes ont été montré à protéger les neurones contre la toxicité du stress oxydatif, alors que le déficit des fonctions astrocytaires, comme l&#39;entretien des défenses antioxydantes et les niveaux d&#39;énergie cellulaire, a été démontré que influence déterminante sur la survie neuronale. Des études récentes ont suggéré que l&#39;utilisation des astrocytes dans une neurotoxicité in vitro dans des systèmes de test peut s&#39;avérer plus pertinentes pour la structure humaine du système nerveux central et la fonction que les cellules neuronales seul. Malgré la sensibilisation croissante de l&#39;importance physiologique de neurones-astrocytes interactions, il a déjà été difficile d&#39;effectuer des analyses quantitatives de ces interactions dans des cellules intactes. L&#39;avènement du dépistage du contenu haute permet le développement de puissants nouveaux tests pour y remédier. Dans cette étude, nous avons démontré que des analyses quantitatives de multiples phénotypes neuronaux et astrocytaire dans un dosage unique est rendue possible par la CHA. Dans les neurones primaires, nous avons effectué des mesures quantitatives des marqueurs de neurotoxicité tels que le nombre de neurones, comptent neurites et la longueur des neurites. Dans les astrocytes, gliose réactive est un biomarqueur de neurotoxicité connue, caractérisée par des altérations de l&#39;expression GFAP, le nombre et la morphologie des astrocytes astrocytes. Nous avons démontré que chacun de ces paramètres peut être facilement évaluée par HCA. Ces études soutiennent l&#39;idée que le HCA des neurones spécifiques biomarqueurs pourraient être utilisés comme partie d&#39;une batterie de tests in vitro pour cribler rapidement un grand nombre de produits chimiques pour les terminaux neurotoxiques. Millipore HCS222 kit Haute analyse du contenu pour la co-culture de neurones et les astrocytes est composée de réactifs de détection de haute qualité et des protocoles pour simultanément profilage βIII-tubuline et de protéines fibrillaire gliale acide (GFAP) dans une grande variété de modèles cellulaires de neurotoxicité. Les réactifs hautement validés fourni avec ce kit permettent à l&#39;utilisateur de standardiser des tests, de minimiser test-à-test variabilité, et de façon reproductible générer des images avec un rapport signal sur bruit.

<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Rabbit Anti-&#x03B2;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201672</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L 
Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201649</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201671</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200437</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200438</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200434</td>
<td>1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200435</td>
<td>1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Wash Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. 2007643</td>
<td>1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201679</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201730</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>K-252a (Control Compound), 250X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201741</td>
<td>1 vial containing 100 &micro;L of 250 &micro;M K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO for Compound Serial Dilution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200441</td>
<td>1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Compound Dilution Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200442</td>
<td>1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate Sealers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200443</td>
<td>10 each Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCS imaging/analysis system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

Analyse à haute teneur (HCA) des dosages de combiner des cellules et des réactifs de détection par imagerie automatisée et de puissants algorithmes d&#39;analyse d&#39;image, permettant la mesure de plusieurs phénotypes cellulaires au sein d&#39;un seul test. Dans cette étude, nous avons utilisé HCA pour développer un nouveau test de neurotoxicité. Neurotoxicité évaluation représente une partie importante de l&#39;évaluation d&#39;innocuité des médicaments, ainsi que l&#39;accent étant importante des efforts de protection de l&#39;environnement. Par ailleurs, la neurotoxicité est aussi un bien acceptée<em&gt; In vitro</emMarqueurs&gt; du développement de maladies neurodégénératives comme l&#39;Alzheimer et les maladies de Parkinson. Récemment, l&#39;application de HCA au dépistage neuronale n&#39;a été rapporté. En qualifiant les cellules neuronales avec βIII-tubuline, des dosages HCA peut fournir à haut débit, non subjective, des mesures quantitatives des paramètres comme le nombre de neurones, comptent neurites et la longueur des neurites, qui peuvent indiquer des effets neurotoxiques. Cependant, le rôle des astrocytes reste inexplorée dans ces modèles. Les astrocytes ont un rôle essentiel dans le maintien du système nerveux central (SNC) l&#39;homéostasie, et sont associées à la fois la neuroprotection et neurodegradation quand elles sont activées en réponse à des substances toxiques ou les états pathologiques. GFAP est une protéine de filament intermédiaire exprimé principalement dans les astrocytes du SNC. Activation astrocytaire (gliose) conduit à l&#39;activation de la GFAP, souvent accompagnée d&#39;une prolifération astrocytaire et une hypertrophie. Ce processus de gliose réactive a été proposée comme un marqueur précoce de dommages au système nerveux. La méthode traditionnelle pour la quantification GFAP est par dosage immunologique. Cette approche est limitée par une incapacité à fournir des informations sur la localisation cellulaire, la morphologie et le nombre de cellules. Nous avons déterminé que le HCA pourrait être utilisé pour surmonter ces limitations et de mesurer simultanément plusieurs caractéristiques associées à une gliose - changements dans l&#39;expression GFAP, l&#39;hypertrophie astrocytaire, et la prolifération des astrocytes - au sein d&#39;un seul test. Dans les études de co-culture, les astrocytes ont été montré à protéger les neurones contre plusieurs types d&#39;insulte toxiques et de façon critique l&#39;influence la survie neuronale. Des études récentes ont suggéré que l&#39;utilisation des astrocytes dans une<em&gt; In vitro</em&gt; Système de test de neurotoxicité peut s&#39;avérer plus pertinentes pour la structure et la fonction du SNC humain que les cellules neuronales seul. En conséquence, nous avons développé un essai HCA pour la co-culture de neurones et les astrocytes, composé de protocoles et validés, les réactifs spécifiques de la cible de détection pour le profilage βIII-tubuline et de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP). Ce test permet l&#39;analyse simultanée de la neurotoxicité, la croissance des neurites, gliose, la morphologie neuronale et astrocytaire et le développement neuronal et astrocytaire dans une grande variété de modèles cellulaires, ce qui représente un roman, non subjective, à haut débit de dosage pour l&#39;évaluation de la neurotoxicité. Le test détient un grand potentiel pour une meilleure détection de la neurotoxicité et la productivité améliorée dans la recherche en neurosciences et de la découverte de médicaments.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Cet article décrit un nouveau protocole et de réactif mis conçu pour la mesure sensibles des effets neurotoxiques de composés et de traitements sur les co-cultures de neurones et les astrocytes en utilisant l&#39;analyse à haute teneur. Les résultats démontrent que l&#39;analyse de contenu de haute technologie représente un roman passionnant pour l&#39;évaluation de la neurotoxicité.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Vidéo: A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Cultures de cellules neuronales de l&#39;aplysie pour l&#39;imagerie haute résolution des cônes de croissance

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Recherche

Biologie

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

Un compartiment Multi-SNC neurone-glie co-culture de la plate-forme microfluidique

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d&#39;enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse de Schwann-astrocytes interactions à l&#39;aide In Vitro Tests

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantification des ADNdb utilisant le Hitachi F-7000 Spectrophotomètre de fluorescence et de PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absolute mesure du rendement quantique des échantillons de poudre

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un workflow d&#39;imagerie à haute teneur pour étudier Grb2 complexes de signalisation par clonage d&#39;expression

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l&#39;analyse quantitative du peptide épitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it is challenging to assess the contributions of individual constituents to its overall toxicity. Toxicological profiles of individual constituents as well as mixtures can be however established in vitro, by applying high through-put screening tools, which enable the profiling of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHCs) of tobacco smoke, as defined by the U.S. Food and Drug Administration (FDA).2
For an initial assessment, an impedance-based instrument was used for a real-time, label-free assessment of the compound&#39;s toxicity. The instrument readout relies on cell adhesion, viability and morphology that all together provide an overview of the cell status. A dimensionless parameter, named cell index, is used for quantification. A set of different staining protocols was developed for a fluorescence imaging-based investigation and a HCS platform was used to gain more in-depth information on the kind of cytotoxicity elicited by each HPHC.
Of the 15 constituents tested, only five were selected for HCS-based analysis as they registered a computable LD50 (&#60; 20 mM). These included 1-aminonaphtalene, Arsenic (V), Chromium (VI), Crotonaldehyde and Phenol. Based on their effect in the HCS, 1-aminonaphtalene and Phenol could be identified to induce mitochondrial dysfunction, and, together with Chromium (VI) as genotoxic based on the increased histone H2AX phosphorylation. Crotonaldehyde was identified as an oxidative stress inducer and Arsenic as a stress kinase pathway activator.
This study demonstrates that a combination of impedance-based and HCS technologies provides a robust tool for in vitro assessment of CS constituents.

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

Haut Analyse de dépistage du contenu pour évaluer les effets toxicologiques des composants nocifs et potentiellement dangereux (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...