Ce protocole permet au chercheur de surveiller l’activité et la réponse de neurones sensoriels uniques à une stimulation contrôlée dans une vertèbres se comportant intactes. Cette électrophysiologie patch est un moyen rapide et direct d’enregistrer à partir de l’activité de spiking des neurones individuels en temps réel. Et cela offre une meilleure résolution temporelle et une meilleure sensibilité à un coût inférieur à celui de la plupart des techniques d’imagerie optique.
Les cellules ciliées de la ligne latérale sont homologues à celles de l’oreille interne humaine. Cette technique est donc sur le point de révéler les propriétés des circuits de cellules ciliées qui s’appliquent à la surdité humaine et aux troubles de l’audition. L’électrophysiologie est un métier utilisant la motricité fine qui doit être vu et imité physiquement.
Les instructions textuelles ne laissent trop de place qu’à une mauvaise interprétation. Pour commencer, distribuez une fine couche d’élastomère de silicone auto-mélangeur tel que Sylgard dans un plat de culture de tissu à fond de verre de couverture pour faire un plat d’enregistrement de fond en élastomère de silicone. Pour fabriquer des broches de dissection, fournissez une charge négative de cinq volts à un bécher de 100 millilitres d’Etchant à l’aide d’une alimentation CC et fixez un fil de tungstène à la sortie chargée positivement.
Plongez à plusieurs reprises la pointe du fil dans le bain Etchant jusqu’à ce que la pointe se rétrécisse à un point pointu. Sous un stéréomicroscope, coupez le fil à environ un millimètre de la pointe avec une lame de rasoir à bord droit. Répétez cela trois fois, puis insérez des broches dans le plat d’enregistrement durci à l’aide d’une pince fine.
Pour préparer les électrodes d’enregistrement, tirez les tubes capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un tireur à micropipette avec filament de boîte. L’électrode doit avoir une pointe de 30 micromètres de diamètre avec un cône qui sera utilisé pour enregistrer les neurones afférents de la ligne latérale postérieure. Tirez un tube capillaire en verre borosilicate supplémentaire dans une paire d’électrodes avec des diamètres de pointe plus petits d’un à cinq micromètres.
Tenant une électrode dans chaque main, passez doucement les pointes les unes sur les autres pour casser les pointes. À l’aide d’un microforge, polir la pointe biseautée jusqu’à consistance lisse. Le diamètre final de la pointe doit être compris entre 30 et 50 micromètres.
Immobilisez les larves de poissons zèbres et transférez-les dans une boîte de Pétri de 35 millimètres à l’aide d’une grande pointe pour transférer la pipette. Retirez autant que possible la solution environnante. Plongez les larves dans 10 microlitres d’alpha-Bungarotoxine à 0,1% pendant environ cinq minutes.
Laver la larve paralysée avec une solution extracellulaire pendant 10 minutes. Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour déplacer la larve du bain de solution extracellulaire vers le plat d’enregistrement à fond de silicone. Sous un stéréomicroscope, positionnez doucement les larves avec une pince à pointe fine au-dessus du centre de ce tapis de silicone, côté latéral vers le haut avec les extrémités antérieures et postérieures du corps allant de gauche à droite.
À l’aide d’une pince à pointe fine, insérez orthogonalement la goupille de bord dans le silicone à travers la notochord dorsale des larves directement dorsale à l’anus. Insérez la deuxième goupille à travers le notochord près de l’extrémité de la queue et insérez la troisième broche à travers le notochord dorsal de la vessie gazeuse. Insérez la quatrième broche à travers la vésicule otique tout en assurant une légère rotation lorsque la broche s’insère dans l’encapsulant.
Comme une légère rotation est appliquée, surveillez le tissu entre le cleithrum et la vésicule otique pour révéler l’amas de somata afférente. Placez la larve de goupille sous l’objectif 10 fois sur un étage fixe du microscope DIC et orientez les fentes mioceptales des blocs musculaires parallèlement au vecteur de stade de tête gauche. Placez le fil de terre dans la solution de bain et assurez-vous qu’il est connecté à l’étage de tête gauche.
Remplissez l’électrode d’enregistrement VR avec 30 microlitres de solution extracellulaire à l’aide d’une pointe de pipette flexible à chargement de gel et insérez-la dans le support de pipette de l’étage de tête gauche. Augmentez le grossissement à 40 fois et abaissez la pipette d’enregistrement dans la solution de la parabole tout en appliquant une pression positive produite par un transducteur pneumatique. Amenez la pointe de l’électrode sur un myoseptum entre les deux myomères ventraux à la ligne latérale jusqu’à ce que la fente soit centrée dans l’ouverture de la pointe de l’électrode VR Abaissez la pipette jusqu’à ce que le bord en retard de l’ouverture de la pointe entre doucement en contact avec l’épithélium.
Après le contact initial, manœuvrez la pipette en diagonale pour vous assurer que le bord d’attaque entre en contact et peut générer un joint. Appliquez une pression négative avec le transducteur pneumatique et maintenez-le. Dans le logiciel de pince de patch, cliquez sur le bouton Lecture de la barre d’outils pour surveiller le signal VR.
Assurez-vous que l’enregistrement VR est réalisé une fois que l’activité des motoneurones avec la dynamique stéréotypée du signal de rafale de Wells est observée. Remplissez l’électrode d’enregistrement afférente avec 30 microlitres de solution extracellulaire et insérez-la dans le support de pipette de l’étage de tête droit. Abaissez-le ensuite dans la solution de la parabole tout en appliquant une pression positive produite par un transducteur pneumatique.
Localisez l’électrode et apportez la pointe de l’électrode sur l’échantillon. À l’aide d’un micromanipulateur, abaissez la pointe de l’électrode afférente jusqu’à ce qu’elle tienne la position au-dessus du cleithrum. Augmenter le grossissement à 40 fois l’immersion et localiser l’intersection du nerf de la ligne latérale postérieure et du cleithrum.
Amenez la pointe de l’électrode sur le ganglion afférent et abaissez la pipette jusqu’à ce que la pointe entre en contact avec l’épithélium. Manœuvrez doucement l’électrode de sorte que toute la circonférence de la pointe entre en contact avec le ganglion afférent. Appliquez une pression négative avec le transducteur pneumatique et maintenez-le.
Après avoir cliqué sur Jouer dans le logiciel de pince de patch, assurez-vous que l’enregistrement de patch lâche de cellule entière des neurones afférents est réalisé quand les pointes se produisent spontanément approximativement tous les 100 à 200 millisecondes. Une fois que l’activité du neurone afférent et du motoneurone est détectée, cliquez sur le bouton Enregistrer dans la barre d’outils de la pince de crête 10 pour capturer des enregistrements simultanés sans espace dans les deux canaux. Effectuer le prétraitement des données comme décrit dans le manuscrit de texte.
En utilisant ce protocole d’enregistrement sans espace, l’activité en temps réel des neurones afférents et VR peut être mesurée simultanément. Les scripts de prétraitement écrits sur mesure génèrent des tracés pour aider à la visualisation de la détection des pics à l’aide de paramètres tels que le seuil, la durée minimale et l’intervalle interspike minimal. Des signaux isolés ont été obtenus en ajustant les variables de détection de limite inférieure et de limite supérieure dans le script de prétraitement.
La détection des pointes de racines ventrales suit des paramètres identiques avec des entrées supplémentaires. Les rafales dans une commande de moteur sont définies par un minimum de deux pointes dans un délai de 0,1 milliseconde d’une durée de cinq millisecondes au moins et délimitées par un minimum de trois rafales avec des intervalles d’interburst de moins de 200 millisecondes Les scripts de prétraitement superposeront des sections d’activité afférente entrées sur une période d’intérêt bien définie. Dans ce cas, l’activité spontanée moyenne montre des changements spectaculaires en réponse au début de l’activité motrice représentée sur l’axe des X comme temps égal à zéro.
Des différences significatives ont été détectées dans les taux de pointes afférentes entre les taux de pointes avant la baignade et les taux de pointes des périodes de nage et de post-baignade. Des taux afférents de pointe ont été négativement corrélés avec la durée de natation. Aucune corrélation n’est détectée entre le taux de pic relatif et la fréquence de nage.
La santé animale est la chose la plus importante lorsque vous essayez de tenter cette procédure. Il est crucial de surveiller le flux sanguin rapide non seulement pour assurer le bien-être des animaux, mais aussi augmenter les chances de succès de l’enregistrement neuronal. En tirant parti des outils génétiques disponibles dans le poisson zèbre, ce protocole d’électrophysiologie peut être complété par des lignées transgéniques pour étudier puissamment la connectivité des circuits anatomiques et fonctionnels dans les systèmes de cellules ciliées et au-delà.
Cette modification simplifiée de la technique de pince patch nous permet de surveiller le fonctionnement in vivo des systèmes sensoriels.
