Une. Préparation des électrodes et la solution saline <ol><li> Préparer une solution saline physiologique et des électrodes avant que l&#39;animal est disséqué. La solution de Ringer Leech se compose de ce qui suit: 115,3 mM de NaCl, 1,8 mM de CaCl2, 4,0 mM de KCl, 10 mM de Tris / acide maléique ou l&#39;HEPES. Ajuster le pH à 7,4. </li><li> Préparer un fil Ag-Cl par trempage d&#39;un fil d&#39;argent nettoyé dans une petite quantité d&#39;eau de Javel pour 20 min ou jusqu&#39;à ce que le fil a une finition gris foncé lisse. Laver le fil avec de l&#39;eau distillée avant utilisation. Ensuite, placez le fil dans un porte micropipette qui se branche sur l&#39;amplificateur. </li><li> Préparer une électrode de verre pointu de verre borosilicate aide d&#39;un extracteur de pipette. La résistance de l&#39;électrode devrait être de l&#39;ordre de 20 M. </li><li> Remblayer la pipette avec une solution d&#39;acétate de potassium 3 M et l&#39;insérer dans le support dans la micropipette. </li><li> Pour une électrode extracellulaire préparer une pipette en verre pointu tel que décrit ci-dessus, casser la pointe arrière parfrottant une autre pipette forte près du bord pointu. Puis tirer polir la pointe de sorte qu&#39;il ne se déchire pas les connecteurs. Électrodes extracellulaires plastique seront également travailler aussi longtemps que il ya un bon contact entre l&#39;électrode et le nerf. </li><li> Insérer l&#39;électrode extracellulaire d&#39;enregistrement dans un support de micropipette (avec fil d&#39;Ag-Cl) qui est équipé d&#39;un tube de caoutchouc et d&#39;une seringue pour aspiration. Utiliser la seringue pour aspirer une solution saline dans l&#39;électrode, au moins au niveau du fil d&#39;argent. </li><li> Configurez le matériel (amplificateur et relance isolateur) et les paramètres d&#39;enregistrement de logiciel en suivant le manuel de votre appareil d&#39;enregistrement de signal spécifique. Voir Leksrisawat et al. 22 pour voir les détails sur les équipements utilisés dans les expériences décrites ci-dessous. </li></ol> 2. Ventral Ganglion Dissection <ol><li> Disséquer la sangsue dans un grand plat en élastomère bordée silicone avec une solution de Ringer sangsue. Si l&#39;animal est étiré longitudinalement à elleplus facile d&#39;enlever la corde nerveuse ventrale (voir la figure 1A). </li><li> Avec # 10 ou # 11 taille scalpel, une incision longitudinale avec des coupes très peu profonds dans la ligne médiane ventrale. Vers le milieu 2/3rd de la coupe ventrale est représenté sur la figure 1B. Essayez de ne pas couper le bas noir (le sinus de sang ventrale) jusqu&#39;à ce que l&#39;animal est complètement ouvert et le sinus de sang est tendue sans plis. Cette sinus sanguin sur toute la longueur de l&#39;animal le long de la ligne médiane ventrale. La VNC est contenue à l&#39;intérieur de ce vaisseau sanguin. </li><li> Après que la peau a été coupée sur toute la longueur de l&#39;animal utiliser les ciseaux de l&#39;iris fines à entailler le sinus de sang (figure 2). Glissez une lame des ciseaux fins iris dans le cadre du sinus et soulever légèrement la lame pour le séparer du tissu nerveux. Couper le sinus de la longueur de la VNC tout en évitant les racines nerveuses, les nerfs segmentaires ou les connecteurs entre ganglions. </li><li> Ensuite, enlever une partie de la corde nerveuse ventrale parcouper les racines distales à l&#39;endroit où le vaisseau sanguin se joint à la racine. Répétez ce processus pour chaque ganglion le long de la longueur de la corde nerveuse ventrale. </li><li> Transférer un segment d&#39;un ou de deux noyaux à une petite boîte de Pétri. Les ganglions ou le seul ganglion doit être épinglé tendue avec un peu de mou. </li><li> Broche les connecteurs et les racines de sorte que la gaine ganglion gliale est légèrement étirée pour empêcher les corps cellulaires des neurones de se déplacer lorsque empalant à travers la gaine et gliales dans le neurone d&#39;intérêt. Les repères doivent être placées à travers le sinus noir pour les racines et dans le milieu des deux connecteurs pour minimiser les dommages des axones (figure 3). </li><li> Placez la boîte de Pétri avec la préparation sous le microscope et le fixer avec de la cire au fond de la boîte pour empêcher le mouvement. </li><li> Concentrer soigneusement le faisceau de lumière en utilisant un miroir et d&#39;un condenseur de lumière pour voir les neurones comme dans la figure 4A (schématiquement représenté sur la figure 4B </strong&gt;). Remarquez les deux grandes cellules Retzius dans le centre du ganglion. </li><li> Pour effectuer un enregistrement intracellulaire du Rz, T, P, et N neurones, placer soigneusement la pointe de l&#39;électrode sur la cellule d&#39;intérêt et abaisser doucement jusqu&#39;à ce que la pointe d&#39;une fossette se voit dans la gaine gliale. </li><li> Appuyez sur le support ou manipulateur électrode (très attentivement) de sorte que la pointe de l&#39;électrode &quot;pops&quot; dans la cellule d&#39;intérêt. </li><li> Injecter des impulsions de courte durée (30 à 40 msec) de courant positif (1 à 10 nA) dans la cellule pour évoquer des potentiels d&#39;action. </li></ol> 3. La culture de neurones du ganglion Préparation ventrale <ol><li> Epingler la face ventrale de ganglions dans un plat propre contenant de la L-15 avec du sérum de veau foetal (SVF) (figure 3). Epingler les racines de sorte que les noyaux sont légèrement étiré comme ci-dessus pour les enregistrements intracellulaires. Avec des ciseaux fins, entaille la capsule gliale à une extrémité, glisser une lame de ciseaux sous la capsule, puis couper à travers la capsule glialecomme représenté sur la figure 5A. </li><li> Ajouter 100 ul aliquote de collagénase / Dispase le plat et le placer sur un agitateur pendant 15 min. Examiner les cellules en déplaçant le milieu de culture autour des corps cellulaires exposées. Remettre les cellules à l&#39;agitateur pendant 15 minutes, ou plus longtemps jusqu&#39;à ce que les cellules sortent avec aspiration minimal. </li><li> Utiliser une pipette fixée à une seringue pour extraire en douceur les cellules du ganglion. Feu polir l&#39;extrémité de la pipette de sorte qu&#39;il est légèrement plus grand que le diamètre du corps de la cellule. Pour les cellules Rz dans une sangsue de l&#39;adulte, le diamètre doit être d&#39;environ 50 um. </li><li> Préparer une série de pipettes de différents diamètres sans un filament comme cela diminue les risques de collage des cellules à l&#39;intérieur de la pipette. Conserver les pipettes dans une bouteille contenant 80% d&#39;éthanol (EtOH) en utilisant une boule de coton en bas pour protéger les conseils de l&#39;écaillage. N&#39;oubliez pas de laver la EtOH de la pipette avec le milieu avant d&#39;aspirer les cellules. </li><li> Après le traitement enzymatique, laver l&#39;enzyme milieu contenant de la L-15 (FCS) 2x. Identifier les cellules d&#39;intérêt et les tirer doucement dans la pipette en tirant la seringue (figure 6A). Remplir les cellules aspirées dans un autre plat qui contient de la L-15 (FCS). </li><li> Jusqu&#39;à présent, toutes les procédures sont non-stérile. Effectuez les étapes suivantes dans une hotte stérile. Placez 3-4 grosses gouttes de L-15 stérile (FCS) dans différents endroits à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Pétri stérile. </li><li> Introduire à la pipette les cellules dans l&#39;une des gouttes avant-mentionnés, les soufflant autour de la goutte pour les laver. Répéter ce en série dans trois ou quatre gouttes de milieu. </li><li> Placez les cellules dans une boîte de Petri propre rempli de L-15 (FCS). </li><li> Incuber les cellules pendant 1 à 24 h à la température ambiante. Ensuite, les cellules propres peuvent être plaqués. En laissant les cellules pendant quelques heures ou toute la nuit de la matrice extracellulaire se détache facilement. Plaquer les cellules immédiatement pour générer processus plus longs. </li><li> Utilisez substrat stérile pour recouvrir un micropuits di<html> sh et laisser sécher complètement (la nuit) avant la mise en culture des expériences. </li><li> Après que le plat a été revêtue, laver le plat doucement avec de l&#39;eau stérile, puis avec une petite quantité du milieu L-15. N&#39;oubliez pas d&#39;utiliser la solution de L-15 sans le FCS ajouté pour permettre aux cellules d&#39;adhérer à l&#39;antenne. Le milieu peut être légèrement modifié pour L-15 avec FCS après que les cellules ont adhéré au substrat. Si les cellules sont utilisés quelques heures après l&#39;étalement, puis de passer le milieu de la L-15 avec FCS n&#39;est pas nécessaire. </li><li> Placer les cellules à côté de l&#39;autre au moment de placage pour induire la synaptogenèse rapide (Figure 6B). Après 24 h mesure l&#39;activité physiologique de paires de neurones. </li><li> Utiliser des techniques électrophysiologiques intracellulaires pour enregistrer RP ou les réponses synaptiques dans les paires de culture de cellules (stimuler 1 neurone par une électrode et d&#39;enregistrement intracellulaire des réponses de la cellule apparié en utilisant une 2ème électrode intracellulaire). </li></ol>titre &quot;&gt; 4. ganglion-corps mur Préparation <ol><li> Epingler la face dorsale de la chute dans un plat en élastomère bordée tel que décrit ci-dessus. </li><li> Epingler la peau d&#39;un côté avec les racines de l&#39;autre côté du ganglion coupée (figure 7A, agrandie à la figure 7B) ou faire une fenêtre sur la face ventrale de la chute sur un ganglion (figure 7C) avec toutes les racines à l&#39;organisme mur intact. </li><li> Après l&#39;obtention d&#39;un enregistrement intracellulaire stable dans l&#39;une des cellules sensorielles (T, P, N) utiliser une petite tige de verre qui a été poli feu de toucher légèrement la peau dans le même segment. Si le neurone en cours d&#39;enregistrement est une cellule à partir de N alors plus de pression devra être appliquée sur la peau. Dans la plupart des cas, la cellule N ne répondra si la peau est pincée avec des pincettes. Pour cette raison, ces cellules devraient être jugés dernier que l&#39;on pourrait endommager la peau ou déplacer le recodage intracellulaire en perturbant la préparation dans une telle manière. </li><li> Il faut êtreen mesure d&#39;esquisser rapidement la peau et ganglion avec des détails assez grande pour que la carte de l&#39;endroit où un touché peut être utilisé pour déterminer le champ récepteur d&#39;un neurone particulier. Après l&#39;enregistrement du plus grand nombre de cellules T et P que possible sur les deux côtés d&#39;un ganglion essayer les N cellules. </li><li> Afin d&#39;examiner si les neurones sensoriels ont des processus qui voyagent à travers les connecteurs de façon rostrale ou caudale, puis sur les racines dans le segment adjacent de la peau, les connecteurs entre ganglions peuvent être coupés et les champs récepteurs réexaminées en ce qui concerne la propagation de détection. Fondamentalement un examine s&#39;il ya eu des pertes dans le domaine réceptif. </li></ol> 5. L&#39;injection de colorants fluorescents <ol><li> Préparer un ganglion de sangsue tel que décrit ci-dessus. </li><li> Remplir une micro-électrode avec une solution de Lucifer jaune-CH (3,0%) et du chlorure de lithium (300 mM). </li><li> Empaler une des cellules sensorielles ou cellules Rz sur la face ventrale du ganglion comme décritci-dessus. </li><li> Injecter un colorant dans la cellule par passage d&#39;un courant négatif (3NA) à travers l&#39;électrode pendant 15 min. Régler la durée d&#39;impulsion de 100 ms et la fréquence de 2 Hz. </li><li> Visualiser les neurones de teinture remplis par l&#39;excitation du colorant avec une lampe au mercure et un jeu de filtres FITC / GFP. </li></ol>

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	<li>Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+and+selective+connexions+of+identified+leech+neurones+in+culture.">Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture.</a> J Physiol. 316, 203-223 (1981).</li><li>Ready, D. F., Nicholls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+neurones+isolated+from+leech+CNS+make+selective+connections+in+culture.">Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture.</a> Nature. 281, 67-69 (1979).</li><li>Blackshaw, S. E., Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurobiology of the Leech. , 51-78 (1981).</li><li>Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+and+selection+of+the+responses+to+serotonin+during+reinnervation+of+an+identified+leech+neuron.">Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron.</a> J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).</li><li>Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Na++and+K++currents+in+soma,+axons,+and+growth+cones+of+leech+Retzius+neurones+in+culture.">Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture.</a> J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).</li><li>Cooper, R. L., Miguel Fernandez, d. e., Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+inhibits+expression+of+calcium+currents+in+purely+postsynaptic+cells.">Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).</li><li>Liu, Y., Nicholls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steps+in+the+development+of+chemical+and+electrical+synapses+by+pairs+of+identified+leech+neurons+in+culture.">Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).</li><li>Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+and+calcium+current+distribution+in+cultured+leech+neurons.">Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+pattern-generating+circuits.">Multifunctional pattern-generating circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).</li><li>Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+axons+and+synaptic+connections+by+touch+sensory+neurons+in+the+leech+central+nercoys+system.">Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system.</a> J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).</li><li>Becker, T., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+control+of+a+critical+period+for+peripheral+induction+of+central+neurons+in+the+leech.">CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech.</a> Development. 116, 427-434 (1992).</li><li>Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Synapses+to+behavior:+Development+of+a+sensory-motor+circuit+in+the+leech.">From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech.</a> Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).</li><li>Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurobiology+of+Swimming+in+the+leech.">The Neurobiology of Swimming in the leech.</a> Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).</li><li>Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stimulation+to+undulation:+a+neuronal+pathway+for+the+control+of+swimming+in+the+leech.">From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech.</a> Science. 234, 1002-1004 (1986).</li><li>Arbas, E. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+membrane+potential+in+interneurons+that+control+heartbeat+in+the+medicinal+leech.">Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech.</a> J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).</li><li>Ching, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synaptogenesis between identified neurons. , (1995).</li><li>Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+neuronal+circuits+and+behaviors+in+the+medicinal+leech.">Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech.</a> Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).</li><li>French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+expression+is+required+for+normal+chemical+synapse+formation.">Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation.</a> J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).</li><li>Li, Q., Burrell, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+long-term+depression+in+a+polysynaptic+pathway+in+the+leech+CNS:+one+NMDA+receptor-dependent+and+the+other+cannabinoid-dependent.">Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).</li><li>Nicholls, J. G., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+modalities+and+receptive+fields+of+sensory+neurons+in+CNS+of+the+leech.">Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech.</a> J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).</li><li>Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+fields,+geometry+and+conduction+block+of+sensory+neurones+in+the+central+nervous+system+of+the+leech.">Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech.</a> J. Physiol. 263, 513-538 (1976).</li><li>Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+receptor+organs+in+the+crayfish+abdomen:+a+student+laboratory+exercise+in+proprioception.">Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception.</a> J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).</li><li>Crisp, K. M., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+central+pattern+generator:+amine+modulation+of+decision-making+neural+pathways+descending+from+the+brain+of+the+medicinal+leech.">Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech.</a> J. Exp. Biol. 209, (2006).</li><li>Puhl, J. G., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+activates+the+motor+pattern+for+crawling+in+the+medicinal+leech.">Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech.</a> J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).</li><li>Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+dopamine+induction+of+crawl-like+bursting+in+leech+motoneurons.">Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons.</a> J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).</li><li>Macagno, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+medicinal+leech+transcriptome+database+and+its+application+to+the+identification+of+leech+homologs+of+neural+and+innate+immune+genes.">Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes.</a> BMC Genomics. 11, 407 (2010).</li><li>Kandarian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medicinal+leech+genome+encodes+21+innexin+genes:+different+combinations+are+expressed+by+identified+central+neurons.">The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons.</a> Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).</li><li>Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+RNAi+and+ectopic+gene+expression+in+the+medicinal+leech.">Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech.</a> J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).</li><li>Firme, C. P., Natan, R. G., Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+select+innexins+in+individual+central+neurons+couples+them+to+pre-existing+neuronal+or+glial+networks+that+express+the+same+innexin.">Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin.</a> J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).</li><li>Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+molecular+data+demonstrate+that+commercially+available+medicinal+leeches+are+not+Hirudo+medicinalis.">Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis.</a> Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le but de cette série d&#39;expériences était de 1) pour enseigner et exposer les principes fondamentaux d&#39;enregistrements intracellulaires de neurones identifiables et 2) de reconnaître les formes caractéristiques des signaux électriques qui peuvent découler de ces types de neurones particuliers à l&#39;aide de sangsues pour adultes. Il ya une riche histoire des enquêtes en utilisant la chute des enquêtes neurophysiologiques et de la recherche est en cours dans le traitement des questions de circuits neuronaux et la régulation des gènes au cours du développement ainsi que lors de la réparation synaptique et la régénération 10. Neuromodulation, notamment par des voies d&#39;amines biogènes, a également été une direction de recherche fructueuse dans la chute. En ajoutant de la dopamine et d&#39;autres agents pharmacologiques sur le système nerveux à travers la solution saline, il a été montré que la dopamine module réseaux neuronaux impliqués dans 23 les schémas moteurs et pour l&#39;analyse du comportement de prise de décision 24,25. Cette approche expérimentale est un simple (et peu coûteux) façon d&#39;intégrer la modulation dans le laboratoire d&#39;enseignement, et en ajustant la composition ionique de la solution saline est un moyen efficace d&#39;enseigner les équations de Nernst et Goldman-Hodgkin-Katz. Pour avoir du succès avec les préparations ganglionnaires il est important d&#39;avoir le ganglion tendu avant de tenter de percer un soma avec une électrode intracellulaire. Sinon, le soma se déplace lorsque l&#39;on pousse sur le paquet gliales. En outre, lorsque le ganglion dégainage pour enlever les neurones de la culture, d&#39;éviter la région d&#39;intérêt lors de la coupe à travers le ganglion si somas ne sont pas endommagés, ils sont supprimés. En outre, l&#39;incubation excessive dans les enzymes peut entraîner les neurones étant trop fragiles pour être enlevé. Il nécessite quelques essais et erreurs pour atteindre un temps d&#39;incubation idéal parce que chaque série d&#39;enzymes est légèrement différent dans leurs actions. Une enquête plus poussée pour optimiser les milieux de culture pourrait améliorer cette technique. VariUO facteurs, tels que la présence d&#39;insuline, de sucres, ou des facteurs de croissance pourraient être examinés pour l&#39;entretien des cultures plus. Pour déterminer si les cellules conservent leur capacité à synthétiser des transmetteurs, tels que la synthèse de la sérotonine dans les cellules Rz, coloration au rouge neutre peut être appliquée à étiqueter processus sérotoninergiques. Invasion aussi la microglie à tissu lésé et la régénération peut être quantifiée par des taches nucléaires jours après une blessure. Bien que cette préparation a de nombreux avantages à offrir en examinant la régénération et la réparation, ainsi que les circuits neuronaux, l&#39;identification pharmacologique et moléculaire des différents sous-types de récepteurs au niveau des synapses n&#39;ont pas été pleinement caractérisé. Une bibliothèque de marqueur de séquence exprimée est disponible 26, et le génome de la sangsue médicinale est actuellement en cours d&#39;assemblage 27, mais la principale limitation à la sangsue par rapport à certaines préparations à base de modèle est la capacité de modifier le génome de gènes sélectifs dans des types cellulaires spécifiques. En embryons tsa restriction a été revue par l&#39;injection d&#39;ADN ou ARN double brin pour réguler l&#39;expression de gènes 28. La technique de canon à gènes a été récemment utilisée pour exprimer la connexine invertébrés (de innexin) de protéines dans les neurones de sangsue. Expression d&#39;un innexin de Hirudo verbana (HVE inx6) est suffisante pour la formation de jonctions lacunaires ectopiques dans la sangsue médicinale 29. La sangsue médicinale ou H. verveine que c&#39;était 30 est sûr de faire progresser notre compréhension de la physiologie et de l&#39;évolution des synapses électriques au cours des prochaines années.

La préparation de la chute est utile pour étudier la fonction des identifiable (sensoriel, moteur et inter-neurones dans le système nerveux central de l&#39;animal (SNC). L&#39;propriété utile de neurones de sangsue est que la forme de leurs potentiels d&#39;action et les propriétés biophysiques sont caractéristiques d&#39;un étant donné le type de cellule (par exemple P, N, T, Rz). outre neurones peuvent être retirés de l&#39;animal et on les cultive dans un milieu approprié dans lequel les cellules conservent leurs caractéristiques électriques aussi longtemps que 45 jours 1,2. Un net avantage du ganglion de sangsue pour apprendre à faire des enregistrements électrophysiologiques est que les cellules sont disposées de manière fiable et caractéristique dans le ganglion dans un modèle qui permet l&#39;identification des types cellulaires distincts de ganglion à ganglion et de l&#39;animal à animal. L&#39;emplacement unique et la morphologie des neurones dans sangsue ganglions ont été notées par Retzius dès 1891 3. Connaissance des el&#39;identité et la fonction d&#39;un neurone e est avantageux pour l&#39;étude des circuits neuronaux et pour faire des expériences avec un type cellulaire donné. En raison de la relativement grande soma des neurones dans un ganglion qu&#39;ils sont visibles avec un microscope à dissection, et les corps cellulaires peuvent être empalées sélectivement avec des microélectrodes pour l&#39;enregistrement de leurs propriétés électriques. Des colorants et des grosses molécules peuvent être injectés dans les cellules individuelles et les propriétés de canal étudié par patch-clamp. Courants ioniques qui donnent naissance aux différentes formes des potentiels d&#39;action des neurones dans les différentes caractéristiques ont été identifiées 4-7. Des enquêtes dans le modèle de l&#39;innervation et la ramification des neurones individuels dans le système nerveux central, les connexions synaptiques ont été reproduits dans la culture de neurones identifiés 2,8. Les études dans les ganglions de la chute ont permis de mieux comprendre le développement de circuits fonctionnels qui peut être mesurée avec électrophysiologie ainsi qu&#39;avec grose comportement animal des études. La sangsue CNS a aussi été une préparation précieuse pour les mécanismes impliqués dans la réparation et la régénération neuronale chez l&#39;animal entier et dans la culture 4-6,9-12 enquête. Dans le cerveau des mammifères est une tâche ardue pour expliquer le comportement en termes de propriétés et les connexions de neurones identifiés individuels. En principe, on peut espérer que l&#39;étude des systèmes moins complexes tels que la chute pourrait aider à définir des mécanismes de base utilisés chez les animaux supérieurs. Les connexions qui sont utilisées qui sous-tendent un modèle de natation 13,14 et la rythmicité du cœur 15 ont été bien caractérisés dans la chute. La capacité de certains neurones de sangsue à former à la fois la communication électrique et chimique est intrigante. Certaines connexions sont bidirectionnelles tandis que d&#39;autres sont unidirectionnels chimiquement mais bidirectionnel électriquement 7. Comprendre les connexions synaptiques dans l&#39;animal ainsi que de recréer la même type de connexions dans une boîte de culture sont des outils puissants pour enquêter sur la synaptogenèse 16-18 ainsi que le profilage pharmacologique de synapses 19. Les techniques d&#39;enregistrement et de stimulation intracellulaires décrites ici constituent une base pour les essais pharmacologiques et la recherche dans neuroéthologie et le développement. En outre, le segment chaîne nerveuse ventrale peut être disséqué avec un morceau de peau innervée. Avec la possibilité de garder un morceau de peau et les neurones en vie, les champs récepteurs sensoriels peuvent être sondés par l&#39;enregistrement de signaux électriques du corps cellulaire (c.-à-soma) des neurones sensoriels dans ganglion abdominal respective dans le SNC. Ainsi, on peut évaluer la sensibilité des terminaisons sensorielles en appliquant différents degrés de force sur la peau et la carte des champs récepteurs: légèreté, la pression et nuisible (douloureuse) stimuli 20,21. Un avantage de cette sangsue préparation ganglion-peau, c&#39;est un can dessiner anatomiquement la carte de champ récepteur et tracer les processus neuronaux au neurone identifié une fois que les réponses électriques sont enregistrées. Les trois expériences de sangsues décrites ci-dessous peuvent tous être remplis plusieurs fois avec un seul spécimen, ce qui en fait un module d&#39;enseignement rentable pour les laboratoires universitaires.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="256">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td style="width:64px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:64px;">&#160;182 silicone kit</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C5670&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris/maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bleach&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>To chloride silver wire</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;221465&#160;</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">CULTURING MATERIALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Boehringer Mannheim&#160;</td>
			<td>&#160;269-638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leibovitz L-15 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>041-01415H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Ready Systems Ag&#160;</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">04-001</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:102px;">D-Glucose-Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gentamycin sulfate&#160;</td>
			<td>any&#160; supplier</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>043-0503H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3375</td>
			<td>Free acid, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Concanavalin A Type IV</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P 7890</td>
			<td>MW 15-30,000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;Microwell plate, 60 x 10 &#956;l</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3034</td>
			<td>Flat bottom, 10 in a bag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Intracellular electrode probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>&#160;26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting microscope (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fiber optic lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Small adjustable mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To direct light beam toward the preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, Suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;MD4-M3-R</td>
			<td>&#160;Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Raised preparation stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>&#160;782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>&#160;27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass tools&#160;</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pipettes with bulbs&#160;</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Plastic tip for suction electrode</td>
			<td rowspan="2">local hardware store (Watt&#8217;s brand)</td>
			<td rowspan="2">&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis

La chute d&#39;eau douce, Hirudo medicinalis, est un organisme modèle polyvalent qui a été utilisé pour traiter des questions scientifiques dans les domaines de la neurophysiologie, neuroéthologie, et la biologie du développement. Le but de ce rapport est de consolider les techniques expérimentales du système de chute en un seul article qui sera utile pour les physiologistes de l&#39;expertise dans d&#39;autres préparations du système nerveux, ou pour les étudiants en biologie avec peu ou pas d&#39;expérience de l&#39;électrophysiologie. Nous démontrons comment disséquer la chute d&#39;enregistrement intracellulaire de circuits neuronaux identifiés dans le ganglion. Ensuite, on montre comment les cellules individuelles de fonction connue peuvent être retirés à partir du ganglion être cultivées dans une boîte de Pétri, et la façon d&#39;enregistrer à partir de ces neurones en culture. Ensuite, nous montrons comment préparer un patch de peau innervée être utilisé pour mapper les champs sensoriels ou moteurs. Ces préparations de sangsues sont encore largement utilisés pour traiter les propriétés électriques de base de networ de neuronesks, le comportement, la synaptogenèse et le développement. Ils sont également un module de formation approprié pour les neurosciences ou la physiologie laboratoires d&#39;enseignement.

Des enregistrements intracellulaires de neurones sensoriels du ganglion de sangsue sont caractérisés par leurs traces distinctes tension-temps représentés sur la figure 4C. Le potentiel de membrane de la cellule au repos dans les cellules ganglionnaires de la sangsue en bonne santé est de -45 à -60 mV. Si potentiels sont plus petites (moins négatif) il faut changer l&#39;électrode de verre, ou si le potentiel est encore faible, passer à un autre segment de la chaîne nerveuse. Les potentiels d&#39;action spontanés avec une faible amplitude peuvent indiquer que l&#39;électrode se trouve dans un neurone moteur. Si cela se produit dans la paroi du corps d&#39;un ganglion injection de courant peut être utilisée pour déterminer si l&#39;une quelconque des neurone innerve les muscles sont encore attachés à la peau. Le neurone moteur anneau de monteur (AE) est sur ​​la face ventrale du ganglion (figure 4B) et il fera les anneaux (crêtes ou segments) à monter en activant le muscle érecteur anneau. Injection de courant dans les cellules sensorielles devrait évoquer potentiel d&#39;actions avec les formes d&#39;onde caractéristiques représentées sur la figure 4C. Si les signaux semblent différentes, il pourrait être dû à un pont asymétrique ou décalage compensation de capacité. Il faut consulter le manuel qui accompagne l&#39;unité d&#39;acquisition de signal pour plus de détails sur la façon d&#39;équilibrer le pont à l&#39;intérieur d&#39;une cellule. Notez que les artefacts de stimulation au début et à la fin des impulsions de courant de la figure 4C. C&#39;est ainsi que les objets semblent lorsque le pont est équilibré. Cultures primaires de neurones du ganglion de sangsue forment les synapses électriques et chimiques dans le plat. Au départ, les propriétés électriques des cellules en culture ne sont pas exactement les mêmes que in vivo. Cependant, après quelques jours, les impulsions sont presque indiscernables de ceux enregistrés dans le ganglion. Cela est illustré sur la figure 6C avec une paire de cellules Rz. Après 7 heures dans la culture de l&#39;amplitude des potentiels synaptiques était 1-2 mV. Après 56 h de culture sypotentiels naptic étaient plus de 10 mV (en haut de traces dans la figure 6C). La forme du potentiel d&#39;action modifie aussi après 56hr en culture. Dans les conditions décrites ces cellules sont viables pendant plusieurs jours. Communication intercellulaire peut être démontrée par la stimulation des racines nerveuses ou les connecteurs et l&#39;enregistrement de neurones dans le ganglion. La stimulation de ces nerfs génère potentiels synaptiques robustes et potentiels d&#39;action dans différentes cellules ganglionnaires. Des traces de la figure 8B ont été enregistrés à partir d&#39;une cellule dans un ganglion Retzius qui avaient été retirés de l&#39;animal et goupillé dans un plat. La trace noire a été évoquée par un stimulus subliminal appliqué avec une électrode extracellulaire au conjonctif. L&#39;augmentation de la tension de stimulation a provoqué la cellule pour déclencher un potentiel d&#39;action (trace rouge). Colorants ou la peroxydase de radis cheval fluorescent peut être injecté dans ces cellules pour étudier leur morphologie. Lucifer jaune a été injecté dans un Rzneurone en faisant passer un courant à travers l&#39;électrode négative. Une alternative consiste à injecter à l&#39;aide du colorant bouffées de pression d&#39;air. Figure 9A montre le colorant a commencé peu de temps après l&#39;injection. Trente minutes plus tard, le colorant avait déjà diffusé dans les racines nerveuses (figure 9B). Le type de colorant dépend de l&#39;application, par exemple les petites colorants de poids moléculaires qui peuvent passer à travers les jonctions communicantes sont utilisés pour identifier les synapses électriques. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. . Ventrale dissection de la chute (A) L&#39;animal est complètement tombé face ventrale dans un plat en élastomère bordée rempli de sangsue saline (B) Une incision peu profonde couvrant la partie antérieure:. Axe postérieur est faite juste en dehors de la ligne médiane pour éviter d&#39;endommager le nerf cordon. Le sinus de sang noir (qui de contains le cordon nerveux ventral) peut facilement être vu. Notez l&#39;un ganglion exposé qui est blanc par rapport à la gaine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> Figure 2. Dissection du sinus noir. Le vaisseau sanguin (flèche) doit être soigneusement coupé sur un côté pour exposer le cordon nerveux ventral (double flèche). Laissez segments de vaisseau sanguin intactes autour des racines segmentaires pour utilisation comme une poignée pour manipuler la corde nerveuse ventrale lors du transfert entre la dissection et des plats d&#39;enregistrement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3"fo: contenu width = &quot;3 pouces&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; width = &quot;400px&quot; /&gt; Figure 3. Section isolée de la corde nerveuse ventrale. Épingler la corde nerveuse ventrale par les fragments des vaisseaux sanguins restants sur les racines segmentaires et les extrémités des connecteurs segmentaires expose les ganglions pour les enregistrements électrophysiologiques. Un tendue étirement des ganglions permet de voir les corps cellulaires identifiables et permettra une pénétration plus facile de la gaine gliale d&#39;une électrode de verre pointu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> Figure 4. Anatomie cellulaire du ganglion de sangsue. (A) Idéalement, les cellules Retzius (R) et d&#39;autres organismes de cellules de grande taille (P-presseure, T-touch, N-nociceptive, AE-anneau monteur) sera clairement visible si le microscope et condenseur de lumière sont mis en place correctement. (B) Représentation schématique des cellules du ganglion. De légères différences dans la localisation des somas auront lieu dans chaque ganglion en raison de la façon dont le ganglion est étiré et épinglé tendu. Potentiels (C) d&#39;action enregistrés à partir du soma de ces neurones ont des formes d&#39;onde caractéristiques. Ces pointes ont été évoqués par injection de courant positif dans la cellule (créneau superposant les traces tension-temps). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> Figure 5. Dégainage du ganglion pour enlever les corps cellulaires individuels. (A) La gaine glialedoivent être soigneusement couper à travers le ganglion pour éviter d&#39;endommager les cellules d&#39;intérêt. La ligne rouge indique une coupe pour éviter de heurter le soma des neurones Rz. Ouverture de la gaine donne les enzymes digestives accéder à la matrice de tissu conjonctif. (B) les corps cellulaires saines exorbités sur le ganglion après la gaine gliale a été ouvert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> Figure 6. La culture de neurones du ganglion de sangsue. (A) Les cellules sont aspirés du ganglion aide d&#39;une micropipette et transférés dans un plat contenant des milieux de culture. (B) Mise en place plusieurs cellules près de l&#39;autre va augmenter le taux de la synaptogenèse entre les neurones identifiables. Voici les étumps de deux neurones ont formé une synapse. (C) Les neurones en culture exposition légèrement différentes des propriétés électriques. Les meilleurs traces montrent potentiels synaptiques évoqués par la stimulation de la cellule adjacente 7 h et 56 h après que les cellules ont été étalées. Les traces de fond ont été évoquées en injectant un courant directement dans l&#39;une des cellules Rz. Notez l&#39;augmentation de l&#39;amplitude du potentiel synaptique et changer dans l&#39;action onde potentiel après 56 h de culture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> Figure 7. Le ganglion-corps préparation du mur de chute pour la cartographie des champs récepteurs. (A) Une approche consiste à éliminer toute une partie de la paroi du corps avec 1-3 ganglions. Ici, les racines d&#39;un côté ont bcoupe een et le ganglion a été épinglé sur le côté. (B) Un épinglé sur ganglion à plus fort grossissement. (C) Une autre approche est de créer une petite fenêtre dans la paroi du corps et enregistrer des ganglions intact tout en traçant un champ récepteur . (DG) Chacun des neurones sensoriels présente une caractéristique de réponse à un stimulus mécanique. (D) Une touche de lumière évoque l&#39;activité dans les cellules T, mais pas en P ou N cellules. (E) La réponse des lymphocytes T s&#39;éteint en réponse à plus forte stimuli, donnant ainsi à l&#39;activation de la cellule de P. Comme le stimulus devient plus fort N cellules devient actif (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figure 8. évoqué activité dans le ganglion de la sangsue. stimulation extracellulaire des connecteurs peut être utilisé pour entraîner la transmission synaptique dans la chaîne nerveuse. (A) Ceci est réalisé par fixation d&#39;une électrode d&#39;aspiration à l&#39;un des connecteurs et l&#39;application d&#39;une faible tension. L&#39;électrode de verre pointu (flèche) peut être vu empaler une cellule Retzius dans le ganglion. (B) des traces de tension-temps montrant l&#39;artefact de stimulation suivie par un synaptique potentiel (noir) et un potentiel d&#39;action (rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> Figure 9. L&#39;injection de colorant dans les neurones de sangsue (A). Jaune Lucifer peut être injecté dans le soma par passage de courant thropouah la microélectrode d&#39;enregistrement. Une lampe au mercure et FITC jeu de filtres peuvent ensuite être utilisés pour visualiser la fluorescence. (B) Dye a diffusé dans le Rz axones environ 30 minutes après l&#39;injection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

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Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Cet article décrit trois préparations du système nerveux à l&#39;aide de sangsues: enregistrement intracellulaire de neurones dans les ganglions ventrale, la culture de neurones de ganglions ventrale, et l&#39;enregistrement d&#39;un morceau de peau innervée de mapper les champs sensoriels.

Intracellulaire enregistrement, le mappage des champs sensorielle, et la culture de neurones identifiés dans le Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

intracellular-recording-sensory-field-mapping-culturing-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

19.5K vues.  University of Kentucky.  Cet article décrit trois préparations du système nerveux à l'aide de sangsues: enregistrement intracellulaire de neurones dans les ganglions ventrale, la culture de neurones de ganglions ventrale, et l'enregistrement d'un morceau de peau innervée de mapper les champs sensoriels. 

Vidéo: Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l&#39;enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Recherche

Neurosciences

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Enregistrement simultané des signaux calciques de neurones identifiés et le comportement alimentaire des Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Enregistrement de l&#39;activité électrique de neurones identifiés dans le cerveau intact des poissons transgéniques

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Un guide pour<em&gt; In vivo</em&gt; Simple unité d&#39;enregistrement de Optogenetically identifié corticale inhibitrice Interneurones

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em