Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.

Le protocole est constitué de trois étapes principales: la première étape comprend la préparation de l&#39;extrait composite dans un milieu de culture; le second concerne le primaire humaine gingivales fibroblastes (HGF) culture cellulaire, le contact des cellules avec des extraits composites et coloration des cellules; la troisième étape consiste à imagerie confocale et l&#39;analyse du signal fluorescent. Pour tissus gingivaux prendre, le protocole a été approuvé en conformité avec la législation française, le consentement éclairé et le comité d&#39;éthique local. 1. Extraits composite Préparation Utilisation milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) comme milieu d&#39;élution. Assurez-vous que le rapport entre l&#39;aire de surface des éprouvettes et le volume de milieu d&#39;extraction est au niveau le plus bas de la norme ISO 10993/12 exigences. La procédure est décrite récemment 11 et a brièvement ci-dessous: <ol><li> Former des échantillons sphériques du composite dentaire non durci à l&#39;aide d&#39;une cale sur mesureer. La taille du support est de 2 mm de rayon, qui est conforme à la profondeur de durcissement généralement indiqué dans le traitement clinique par voie orale. </li><li> Préparer des puits de la plaque, contenant chacun 1 ml de milieu de culture (DMEM), avec un mélange de 5% de pénicilline / streptomycine et 1% de l&#39;amphotéricine mais sans sérum de veau fœtal (FBS). </li><li> échantillons de guérison dans le milieu DMEM contenant bien en utilisant une lampe LED avec un 1070 mW cm -2 intensité (λ = 465 à 475 nm) pendant 40 secondes. Assurez-vous que la distance entre la pointe de durcissement et les échantillons est de l&#39;ordre de 0,5 mm. Utilisez ce mode de cuisson pour simuler le contact temporaire entre la dent et le composite dentaire non durci. En situation clinique, le contact se produit lorsque le matériau composite de restauration est placée dans la cavité buccale. </li><li> Incuber les échantillons (composites échantillons dans le milieu DMEM) à 37 ° C sous atmosphère humide à 5% de CO 2 dans l&#39;air. Incuber le milieu DMEM (sans échantillons composites) pour les cellules de contrôle dans les mêmes conditions. </li></ol> 2. HGF culture cellulaire, Composite Extraits d&#39;essais et cellules colorées <ol><li> La croissance et le maintien de cultures de cellules Isoler les fibroblastes gingivaux humains provenant de biopsies de tissus gingivaux sains de patients pris pendant extractions orthodontiques routine. <ol><li> Cultiver les fibroblastes gingivaux humains dans du DMEM en présence de 10% de FBS, 5% de pénicilline / streptomycine et 1% de l&#39;amphotéricine B. maintenir les cellules à 37 ° C dans un incubateur sous atmosphère humide à 5% de CO 2 dans l&#39;air. </li><li> Moyennes changés tous les 3 jours, et passage des cellules tous les 5 jours. Après avoir atteint la confluence, les cellules de récolte par traitement à la trypsine. </li><li> Centrifuger les cellules à 90 g pendant 5 min et remettre en suspension les dans le milieu de culture. Comptez cellule avec un compteur de cellules automatisé sceptre de poche. </li><li> Graine suspension de cellules à une densité cellulaire de 2,5 x 10 4 cellules / ml dans un système de chambre de coulissement. Laisser l&#39;incubation des cellules pendant une nuit à 37 ° C dans une atmosphère à 5%. </li></ol></li><li> L&#39;addition de composés extraits de cellules en culture <ol><li> Remplacer le support de deux puits de la glissière de la chambre par 1 ml de l&#39;extrait composites testés (après 24 h d&#39;incubation). </li><li> Maintenir les deux autres puits (cellules témoins) dans les mêmes conditions. </li><li> Incuber la lame de la chambre contenant les quatre puits à 37 ° C dans un incubateur sous atmosphère humide à 5% de CO 2 dans l&#39;air. </li></ol></li><li> Coloration fluorescente Utilisez Live cytotoxicité Morte tache / pour les cellules eucaryotes selon les instructions du fabricant. REMARQUE: le kit fournit un rapide Fluorescent Assay deux couleurs pour déterminer la viabilité des cellules dans une population basée sur l&#39;intégrité de la membrane plasmique et de l&#39;activité de l&#39;estérase. Le colorant direct de distinguer les cellules endommagées par marquage simultanément avec vert fluorescent, la calcéine-AM pour indiquer une activité estérase intracellulaire et d&#39;éthidium homodimère fluorescent rouge-1 (EthD-1) pour indiquer la perte de membranl&#39;intégrité des e. <ol><li> Préparer une solution de travail des deux réactifs de coloration contenant 2 uM de calcéine AM et 4 uM de EthD-1 (concentration finale rapportée comme étant approprié pour la coloration des fibroblastes). Ajouter le colorant aux cellules adhérentes cultivées en présence ou en absence des composés extraits sélectionnés. </li><li> Respecter les populations directement et rapidement des cellules colorées au moins 15 min après coloration et par l&#39;imagerie time-lapse. Ne pas centrifuger et ne fixe les cellules colorées. </li></ol></li></ol> 3. confocale Accéléré imagerie et d&#39;analyse du signal Le système utilisé est équipé de quatre unités d&#39;un laser à diode et d&#39;une image multi-colorées pendant un maximum de quatre colorants fluorescents pour chaque échantillon. Le système peut effectuer une image de la cartographie (10X de grossissement) qui donne un aperçu de l&#39;échantillon d&#39;essai sur lequel on peut se déplacer pour observer une région d&#39;intérêt (600X grossissement). <ol><li> Time lapse imagerie <ol><li> Placez les specimens (la lame de la chambre contenant les échantillons colorés) sur la chambre noire de l&#39;incubateur intégré confocal (37 ° C, 5% de CO 2 et l&#39;atmosphère humide). </li><li> Sélectionnez les lasers correspondants. Utilisez les deux sources laser 473 nm (15 mW) et 559 nm (18 mW) pour exciter la calcéine et EthD-1. </li><li> Utilisez un mode deux séquentielle d&#39;acquérir des images à travers des séquences de ligne sans diaphonie en imagerie avec les deux colorants fluorescents usagés. </li><li> Utilisation d&#39;un détecteur avec un spectre nouvellement mis au point pour régler automatiquement les conditions en conformité avec le colorant fluorescent dans l&#39;unité de balayage. </li><li> Optimiser la largeur de bande de la fluorescence détectée pour chaque canal au maximum. Enregistrer toutes les acquisitions de manière séquentielle pour éviter croisée potentielle parler. </li><li> Sélectionner les conditions de formation d&#39;image les plus appropriées sur la base de la sélection d&#39;un colorant fluorescent à l&#39;aide du logiciel d&#39;acquisition. </li><li> Acquérir une image de la carte qui est automatiquement créé à partir du centre dans un motif en spirale,avec la zone d&#39;intérêt étant facilement sélectionné pour un examen plus approfondi. </li><li> Sélectionnez le mode d&#39;observation. Sélectionnez jusqu&#39;à cinq types de modes d&#39;observation, y compris time-lapse, Z-stack, et multi-zone si nécessaire. Utilisez une combinaison de Z-stack et modes time-lapse dans la présente étude et compléter rapidement la capture d&#39;image, </li><li> Changer et passer le colorant fluorescent. En variante, la fluorescence et superposer les images de contraste de lumière entre eux. Observez l&#39;image en direct en utilisant le point sélectionné sur l&#39;écran en bas à gauche de la carte. </li><li> Déterminer la zone d&#39;imagerie en utilisant l&#39;encadrement et les fonctions de zoom. Eventuellement, commuter entre les affichages pour chaque type de colorant fluorescent. REMARQUE: Le microscope utilisé dans ce protocole a la même fonctionnalité que confocal classique haut dans un design compact. Le microscope est équipé d&#39;objectifs immersion dans l&#39;eau inversées qui sont parfaitement adaptés pour stable imagerie time-lapse de cellules vivantes avec un incubateur intégré simplifié. </li&gt; </ol></li><li> l&#39;analyse et la quantification du signal <ol><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie pour quantifier le signal de fluorescence. Obtenir cinq images de carte avec l&#39;objectif 10X pour l&#39;échantillon et la cellule de contrôle testé. </li><li> Obtenu 1024 × 1024 pixels images régulières, avec une taille 0,231 um x 0,231 um de pixel. Stocker des images au format d&#39;image Olympus (OIF) pour l&#39;analyse du signal. Ce format permet de stocker différents paramètres et images. Utilisez des outils d&#39;analyse (mesure de profil d&#39;intensité, rapport d&#39;intensité entre les deux canaux utilisés). </li><li> Stocker les images de projection maximale des fichiers TIFF 12 bits / pixel. </li><li> Préforme analyses statistiques en utilisant le logiciel de commandant R. Analyser les différences en utilisant une analyse de variance (Anova) avec un test de répétition. Rapport résulte écart-type moyen (± SD) et la signification statistique à p &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests, they have nothing to disclose.

le comportement des matériaux de biocompatibilité est le paramètre le plus préalable être évalués avant usage médical. Les normes internationales couvrent dispositifs médicaux ISO 10993 33 et plus particulièrement les matériaux dentaires ISO 7405 34. L&#39;absence des effets toxiques sur les cellules environnantes est la norme clé dans l&#39;évaluation de la biocompatibilité de ces matériaux. Cela est la raison pour laquelle l&#39;essai de cytotoxicité a une telle importance dans l&#39;évaluation de la biocompatibilité d&#39;un matériau dentaire 35-37. L&#39;ISO a suggéré des méthodes d&#39;essai pourraient être basés sur l&#39;activité métabolique ou à l&#39;intégrité de la membrane. Critères d&#39;évaluation retenus doivent respecter certaines conditions particulières de classement des effets néfastes induits par un matériau d&#39;essai afin de réduire le temps et le coût des tests d&#39;évaluation. La méthode actuelle de l&#39;enquête (3D temps confocale lapse d&#39;imagerie) est l&#39;intégrité de la membrane à base. L&#39;évaluation de la cytotoxicité par l&#39;intermédiaire de ce point d&#39;extrémité semble être un marqueur utile de la cellule de biocompatibilité avec des matériaux testés et il est également certifiée ISO extrémité. Les tests in vitro sont conçus pour déterminer comment un échantillon de matériau affecte un type cellulaire particulier. Le test colorimétrique au MTT a été décrite à l&#39;origine par Mossman (1983) comme une méthode utile pour la mesure de la cytotoxicité in vitro et la prolifération cellulaire. Le test MTT est basé sur la conversion du sel de tétrazolium en cristaux de formazan par les cellules actives, qui détermine l&#39;activité mitochondriale. Cela peut se traduire par le taux de viabilité 38. Gupta et ses collaborateurs ont indiqué que le test MTT est la méthode la plus largement utilisée pour mesurer la cytotoxicité des résines composites. Succinique déshydrogénase et les réponses de la phosphatase alcaline ont également été utilisés dans le même but 39. Cependant, les cellules du devenir ne peuvent pas être suivi, depuis le test MTT nécessite tuer les cellules à chaque point de mesure du temps. Afin de suivre de plus près le comportement des cellules colorées dans la présente étude, direct observation de cellules vivantes a été réalisée grâce à laps de temps CLSM imagerie combinée avec une coloration de protocole court, l&#39;analyse automatique d&#39;images et fluorescent signal de quantification. Composites dentaires sont en contact étroit avec les tissus buccaux, en particulier les cellules gingivales et la pulpe. Fibroblastes seraient la cible de composants libérés de ces composites de restauration 40 - 41. De plus, plusieurs études ont rapporté que les cellules immortalisées et les cellules primaires peuvent avoir différentes réponses cellulaires en contact avec des biomatériaux. Les cellules primaires ont été trouvés à être plus approprié pour évaluer les effets des biomatériaux 42. Ceci explique l&#39;utilisation de cellules de fibroblastes gingivaux humains primaires comme modèle cellulaire pour l&#39;évaluation de la cytotoxicité du composite dentaire testée dans la présente étude. Le potentiel de toxicité des substances rejetées par composite dentaire a été largement étudiée 43-44. Afin d&#39;évaluer til cytotoxique potentiel des matériaux, deux cellules modèles de contact pourraient être effectuées. Dans le système de modèle de contact direct du matériau est placé directement avec les cellules cibles alors que dans le système à contact indirect, ciblent les cellules sont en contact avec élue de milieux biologiques. Dans les applications cliniques et les procédures de restauration, composite dentaire sont mis en contact indirect avec des tissus gingivaux. Pour cette raison, le protocole expérimental actuel est centré sur le système de contact indirect avec des fibroblastes gingivaux humains (cellules en présence des extraits composites testés). Comme indiqué précédemment par Dahl et collaborateurs, les réponses de cytotoxicité ont été classés comme sévère (&lt;30%), modérée (30-60%), faible (60-90%) ou non-cytotoxique (&gt; 90%) sur la base de l&#39;activité par rapport à Les valeurs obtenues pour les contrôles 45. Par conséquent, selon ce classement et à la lumière des résultats obtenus (tableau 1), composite ELS supplémentaire faible retrait pourrait être classé comme very légèrement cytotoxique et présente un comportement comparable aux cellules témoins pendant toute la période laps de temps. Utilisation de la précision même méthode d&#39;enquête, les résultats de cette étude pourraient être comparés à ceux d&#39;une étude récemment publiée. L&#39;ELS supplémentaire faible retrait composite démontré la biocompatibilité supérieure par rapport aux deux composites testés précédemment utilisés pour la même application clinique qui est la restauration directe 11. D&#39;autres études sont encore nécessaires pour établir une comparaison plus complète. Au moment de décider qui essai de cytotoxicité à approuver une évaluation spécifique de point final, il est important de comprendre les avantages et les limites de chaque méthode. Le but principal de l&#39;imagerie confocale est de réaliser une architecture 3-D de cellules et d&#39;organes. La technique est en mesure de révéler non seulement la surface de un spécimen, mais aussi son sous-sol. Le protocole décrit ici souligne l&#39;utilisation de la 3D CLSM laps de temps imagerie confocale, comme une sensiProcédé tive pour évaluer le comportement de biocompatibilité in vitro d&#39;un composite dentaire. Toutefois, afin d&#39;éviter les limitations rencontrées dans ce travail, les postes de travail anti-vibrations pourraient être utilisés afin de permettre laps imagerie en temps plus stable et plus; la table peut isoler le système confocal utilisé contre les effets néfastes que les vibrations dans le laboratoire peuvent causer. En outre, les matériaux utilisés dans la cavité buccale devrait idéalement être sans danger pour les tissus gingivaux et ne doit pas contenir de substances qui pourraient causer une toxicité systémique. Conformément à la méthodologie utilisée et les résultats obtenus dans la présente étude, on peut conclure que le composé testé (ELS très basse de retrait) est non cytotoxique dans les conditions expérimentales présentes. Comme la méthode de CLSM peut sensibilité donner le taux initial de cellules viables, d&#39;autres possibilités pourraient être envisagées pour évaluer plus de point final. En particulier, comme il a été récemment rapporté que des monomères composés affectent les cellules thrOugh espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) 46- 48, une enquête plus approfondie est nécessaire pour évaluer les corrélations entre le cas échéant cytotoxicité réseaux et la production de ROS signalisation. Le futur protocole pourrait être conçu pour évaluer simultanément la production de ROS (H 2 O 2 et / ou O 2 - coloration) et le taux de cytotoxicité (Live de coloration / mort) à l&#39;aide laps de temps CLSM imagerie.

L&#39;une des principales normes citées dans les recommandations de l&#39;ISO pour définir la biocompatibilité est l&#39;absence de toxicité matière de cellules. Composites dentaires à base de résine peuvent libérer des composants de la matrice résineuse, qui pourraient être d&#39;abord dû à la polymérisation partielle, et / ou plus tard en raison de processus de dégradation au fil du temps 1-4. Ces composants libérés entrer en contact avec les tissus buccaux et peuvent avoir différents inconvénients comme des réactions urticariennes et des muqueuses 5, le développement de l&#39;allergie et des réactions d&#39;hypersensibilité chez les patients 6, les modifications de fibroblastes gingivaux morphologie et la réduction de collagène de type I protéines 7, immunosuppression ou immuno-stimulation sur mitogène axées sur l prolifération des lymphocytes T purifiés et les cellules de la rate 8 et dommages à l&#39;ADN dans les fibroblastes gingivaux humains primaires, ce qui souligne leur potentiel génotoxique 9. De nombreux paramètres peuvent influer sur la toxicité composite dentaire comme l&#39;ombre de la che de la dentine, la photopolymérisation, la composition chimique du monomère de la résine, la charge et le degré de conversion de 10 13. Depuis potentiel toxique in vitro de matériaux peut prédire dans des situations in vivo et pourrait être comparé à des situations cliniques de l&#39;étude de certains paramètres pertinents. La cytotoxicité des composites dentaires et de leurs composants ont été largement évaluée en utilisant des systèmes de culture cellulaire 14- 16. Ces systèmes in vitro ont été élaborés pour évaluer les composites dentaires biocompatibilité en terme de: la croissance cellulaire et l&#39;apoptose cellulaire en utilisant THP-1monocytes comme les cellules 17, la cytotoxicité dans les fibroblastes gingivaux humains 18, le potentiel inflammatoire dans HaCaT kératinocytes comme les cellules 2, fonctionnalité des cellules odontoblast- comme MDPC-23 cellules 19, la réduction des niveaux d&#39;ARN totaux, et une augmentation significative de l&#39;induction de l&#39;apoptose sur gingival kératinocytes humains 20 etlésions de l&#39;ADN sur la gencive et pulpe fibroblastes cellules 21. Différentes méthodes sont proposées pour étudier la biocompatibilité des composites dentaires. Les dosages colorimétriques, qui impliquent des colorants spécifiques et des mesures d&#39;adsorption de lumière, restent le plus communément utilisé, en raison de leur relative simplicité et son faible coût 22- 26. analyse de microscopie par contraste lumineux consomme souvent plus de temps et entraîne des coûts plus élevés. Cependant, ces techniques de microscopie présentent certains avantages importants. L&#39;observation de la structure cellulaire donne des informations étendues sur les effets toxiques expérimentés, fournissant ainsi des données plus pertinentes et sensibles. En particulier, l&#39;introduction de la microscopie confocale 27 a permis l&#39;observation de structures biologiques à l&#39;amélioration de la résolution axiale par rapport à l&#39;ensemble du champ des microscopes traditionnels de fluorescence d&#39;imagerie. Par conséquent, l&#39;imagerie confocale est devenu un puissant outil d&#39;enquête dans différents domaines de larecherches médicales et scientifiques. Contrairement aux techniques de microscopie électronique, microscopie confocale à balayage offre la possibilité de visualiser des composants distincts de cellules par incorporation de marqueurs fluorescents spécifiques. La plupart de ces traceurs spécifiques sont stables dans un environnement aqueux, sensiblement mesurable, peu coûteuse et non toxique 28, ce qui permet leur utilisation en clinique ainsi que des études de recherche en laboratoire. En outre, le séchage et la fixation de l&#39;échantillon utilisé pour l&#39;analyse par microscopie électronique conventionnelle ne sont pas nécessaires pour l&#39;imagerie confocale laps de temps, donc acquisition en fonction du temps est également possible sur des échantillons. Par rapport à l&#39;imagerie bidimensionnelle, le principe de l&#39;imagerie confocale permet une visualisation sous la surface de l&#39;échantillon et la reconstruction de la structure tridimensionnelle à partir des différentes images de profondeur obtenues; détails qui se traduisent par, plus précises et plus structurels 29, 30 L&#39;étude de la vidéo. présent est un exemple de l&#39;utilisation des trois dimensions Time-Lapse Confocal à balayage laser (CLSM 3D) associé à un étiquetage Vivant / Mort fluorescent et le signal quantification comme une méthode innovante. La technique présentée dans ce document a l&#39;avantage de permettre l&#39;évaluation sensible et imagerie time-lapse de cellules vivantes sans modifier la structure de la cellule évalué. Aucun étapes de préparation sont nécessaires avant l&#39;analyse confocale. Auparavant, la même coloration a été utilisé pour évaluer la viabilité de culture des carottes de 31 os spongieux mais sans confocale time-lapse suivant. De même, la même procédure time-lapse confocale a été utilisé pour évaluer l&#39;activité érythromycine temps-kill dans les bactéries des boues activées en fonction de leur type Gram 32 en utilisant une bactérie spécifique Live / coloration mort. Ces méthodes ont été récemment utilisée et adapté pour comparer la toxicité des composites dentaires à base de monomères de méthacrylate 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Olympus Fluoview FV10i&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O2/Co2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Pnasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO 5M</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Live/Dead&#174; Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MP 03224</td>
			<td>Stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ELS extra low shrinkage&#174;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Saremco&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Dental composite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D 6046</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1426</td>
			<td>harvesting cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chamber slide system&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">14220040X</td>
			<td>Culture chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">A11-101</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">00110230TP1</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal time lapse imaging as an efficient method for the cytocompatibility evaluation of dental composites

Il est généralement admis que l&#39;interaction in vitro de la matière dans la cellule est un critère utile pour l&#39;évaluation de la biocompatibilité d&#39;un matériau dentaire. L&#39;objectif de cette étude était d&#39;utiliser 3D CLSM laps de temps imagerie confocale pour évaluer la biocompatibilité in vitro des composites dentaires. Cette méthode fournit une indication précise et sensible de taux de cellules viables en contact avec des extraits de composites dentaires. L&#39;ELS supplémentaire faible retrait, une composite dentaire utilisé pour la restauration directe, a été pris comme exemple. Évaluation in vitro a été réalisée sur des cellules en culture primaire de fibroblastes gingivaux humains en utilisant en direct coloration / Dead. Les images ont été obtenues avec le système biologique confocal inversé FV10i et analysés avec le logiciel FV10 3,1-ASW. L&#39;analyse des images a montré une très légère cytotoxicité en présence du composite testé après 5 heures de laps de temps. Une légère diminution de la viabilité cellulaire a été montré en contact avec le composite extraits compar testéed à contrôler les cellules. Les résultats ont mis en évidence l&#39;utilisation de 3D CLSM laps de temps d&#39;imagerie comme une méthode sensible pour évaluer qualitativement et quantitativement le comportement de la biocompatibilité des matériaux composites dentaires.

Figure 1 montre une vue d&#39;ensemble des cellules colorées vivants / morts dans des images de cartographie obtenus (objectif 10x) à la fois pour le contrôle et les cellules exposées aux extraits composites testés (ELS très basse de retrait). La structure tridimensionnelle de cellules peut être visualisée au grossissement 600X. La visualisation des cellules prélevées dans la chambre de commande et des cellules prélevées dans la chambre en présence des extraits composites testés est présentée en figure 2. La projection maximale (60X objectif) montre le sort des populations de cellules sélectionnées au début de l&#39;intervalle de temps (à 15 min) et à la fin de la période d&#39;intervalle de temps (à 5 h). Cinquante-sept piles d&#39;images (xyzt de balayage mod, 39 images par piles, voxel-profondeur 1,00 um) ont été obtenus au cours de cette période. Une légère diminution du signal fluorescent vert et très légère variation dans la fluorescence rouge ont été obtenus dans les cellules exposées. Aucune variation significative n&#39;a été observée pour le contrôlecellules. Cellules exposées extraits composites supposés morphologie de la broche similaire aux cellules témoins; morphologie n&#39;a pas été altérée dans ces conditions expérimentales (en dépit de la diminution du signal vert et le rouge augmentation du signal en présence du composé testé). L&#39;analyse d&#39;image a été effectuée sur cinq sélectionnées différentes piles d&#39;image correspondant à des populations à partir des images obtenues pour le composite testé de cellules par rapport aux cellules témoins négatifs pour les deux signaux vert et rouge. Le profil d&#39;intensité de cellules colorées est illustré sur la figure 3; le vert et le rouge évolution du signal des cellules en contact avec le composite testée était comparable à celles des cellules témoins. Calcéine et EthD-1 intensités d&#39;émission de fluorescence ont été mesurées sur des cellules de contrôle et sur les cellules exposées composites. La mesure a été effectuée à intervalles d&#39;une heure pour un maximum de cinq heures. Le ratio vert / rouge fluorescence (sur la base des intensités intégrées de la verte 495-515 nm et rouges signaux nm 620-650) A été calculée au cours de la période time-lapse. Les ratios de viabilité pour le contrôle et les cellules exposées à ELS extraits très basse de retrait sont présentés dans le T mesure 1. En présence du composite testé, le pourcentage de cellules vivantes a été trouvé à diminuer légèrement de 100% à 93,9% après 1 heure de contact. Différence significative n&#39;a été observée entre le composite testé et le contrôle négatif (cellules sans extraits composites) après 5 h de la période time-lapse indiqué. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg" /> Figure 1: Vue d&#39;ensemble image de cartographie de révélé des cellules à l&#39;objectif 10X, (a) des cellules de contrôle et (b) des cellules colorées en présence d&#39;extraits composites (ELS très basse de retrait) au début de la période de laps de temps (t = 15 min). Les espaces verts sont des cellules vivantes et les zones rouges sont les cellules endommagées. Dans ceconditions de l&#39;expérience, aucune variation (à la fois pour la fluorescence verte et rouge) a été observée pour les composites ont exposé des cellules par rapport aux cellules témoins négatifs. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg" /> Figure 2: images CLSM à objectif 60X d&#39;une population de cellules de (A) chambre de commande et (B) chambre des extraits composites dans le début et la fin de la période d&#39;exposition time-lapse (I: 15 min et II: 5 h, respectivement ). Les espaces verts sont des cellules vivantes et les zones rouges sont les cellules endommagées. Le panneau des images démontré léger changement dans le signal d&#39;intensité (légère diminution du signal vert et très légère augmentation dans le rouge). Aucune altération de la morphologie cellulaire ont été observées en présence d&#39;extraits composites; exposer les cellules conservé leur morphologie en forme de fuseau et de fibroblastes que les cellules témoins. Figure 3: profil de la ligne de cellules observées en microscopie time-lapse cellules (A) de contrôle (B) des cellules extraits composites exposés: (i) à 15 min et (II) à 5 h.. Aucune variation visible dans l&#39;évolution du signal vert en présence de composé testé quel que soit le temps de contact. Cependant, on a observé une légère augmentation du signal rouge en présence de composite après 5 h de contact. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Le temps de contact (heures) </td><td colspan="5"> La viabilité cellulaire (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Les cellules témoins </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; <td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS supplémentaire faible retrait ® </td><td> 93,9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89,5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Taux de HGF direct cellules évolution après 1, 2, 3, 4 et 5 heures de contact avec les extraits composites La viabilité des cellules a été analysé par coloration à l&#39;aide du kit de la cytotoxicité Vivant / Mort. Les données montrent des valeurs moyennes ± SD de cinq images empile analyse. Les valeurs sont significativement différentes de cellules de contrôle à p &lt;0,05.

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Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

L&#39;aspect le plus étudié de la biocompatibilité des matériaux composites dentaires est leur cytotoxicité 3D CLSM laps de temps imagerie combiné avec le signal fluorescent quantification permet une évaluation sensible du destin cellulaire au cours du temps. En utilisant cette méthode pourrait être un outil efficace pour évaluer la cytocompatibilité des composites dentaires.

Confocale Accéléré Imaging comme une méthode efficace pour l&#39;évaluation cytocompatibilité de composites dentaires

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

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Research

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Medicine

13.4K vues.  UMR CNRS 5615, Université Lyon1.  L'aspect le plus étudié de la biocompatibilité des matériaux composites dentaires est leur cytotoxicité 3D CLSM laps de temps imagerie combiné avec le signal fluorescent quantification permet une évaluation sensible du destin cellulaire au cours du temps. En utilisant cette méthode pourrait être un outil efficace pour évaluer la cytocompatibilité des composites dentaires. 

Vidéo: Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Recherche

Médecine

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

La<em&gt; En Ovo</em&gt; Chick chorioallantoïque membrane (CAM) Assay comme un modèle de xénogreffe efficace de carcinome hépatocellulaire

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Une méthode améliorée pour Rapid intubation de la trachée chez la souris

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

Une méthode d&#39;anesthésie, de chirurgie et de récolte pour l&#39;évaluation des vis transpediculaires en utilisant un<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de la colonne lombaire porcine

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

Deuxième génération d’harmoniques signaux dans la sclérotique de lapin comme un outil pour l’évaluation des thérapeutiques tissulaires réticulation (TXL) pour la myopie

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful compared to other more aggressive methods such as retro-orbital plexus sample collection. However, this blood collection method is sometimes limited by an unsatisfactory success rate. Here, we introduce a method for blood collection through the subclavian vein puncture. The subclavian vein is located just under the clavicle and this vein is large enough to fulfill the volume requirements of blood collection. Our results show that this method is safe and applicable for blood collection sampling with the required blood volume. Blood collection through the subclavian vein puncture could serve as an alternative blood collection method in case of failed tail vein blood sampling in rats.

Here, we present a protocol to collect blood samples from the rat subclavian vein.

Ponction de la veine sous-clavière comme méthode Alternative de prélèvement d’échantillons de sang chez les Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Imagerie in vitro de cellules vivantes en accéléré pour explorer la migration cellulaire vers l’organe de Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

Endodontie guidée : planification tridimensionnelle et préparation assistée par gabarit des cavités d’accès endodontiques

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...