The authors would like to acknowledge the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO, grant 17.106.329)

Les expérimentations animales ont été approuvés par le comité de protection des animaux du Centre médical universitaire de Leiden (LUMC). 1. Préparation de cellules, Instruments et souris <ol><li> Un jour avant l&#39;opération, le raser / SCID gamma (NSG) souris NOD à partir du quatrième mamelon de la ligne médiane et peser les souris pour vérifier que toutes les souris ont un poids à peu près comparables. </li><li> Autoclave une paire de ciseaux, deux pinces et deux pinces de moustiques droites (figure 1A). </li><li> Le jour de l&#39;opération, laver le adénocarcinome de sein humain (MDA-MB-231) des cellules qui sera injecté une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 et les cellules trypsiniser. Stopper la trypsine par addition de 10 ml de DMEM contenant du sérum support au-dessus des cellules. Centrifuger les cellules à 1200 rpm pendant 7 min à température ambiante pour éliminer le sérum en remettant en suspension les cellules dans du PBS ou l&#39;autre ou dans des milieux sans sérum. Centrifuger à nouveau pour enlever les traces de sérum complètement. Remettre en suspension les cellules dans du PBS oumédias. </li><li> Compter les cellules avec un hémocytomètre et calculer la quantité de cellules. Utilisez 500 000 cellules / souris dans pas plus de 150 pi. Facultatif à PBS ou médias, remettre en suspension les cellules dans matrigel. NOTE: Déterminer la quantité de cellules en fonction du type de cellule utilisée. </li><li> Placez cellules dans un microtubes stériles et de les garder sur la glace. </li><li> Remplir une 50 ml tube à centrifuger conique de 35 ml de PBS pH 7,4 et un autre tube à centrifuger conique de 50 ml avec 70% d&#39;éthanol. Faire tremper des cotons-tiges dans chaque tube. </li></ol> 2. injection orthotopique <ol><li> Effectuer l&#39;opération dans une hotte stérile à maintenir une atmosphère stérile. Anesthésier la souris par voie sous-cutanée injection xylazine / kétamine mélange à une dose de 10 mg / kg, 100 mg / kg de poids corporel, respectivement. Fixer la souris sur un coussin chauffant. Confirmer le succès de l&#39;anesthésie par le manque de réaction à pincement de l&#39;orteil. REMARQUE: Si on ne est pas très familier avec les procédures chirurgicales, la chirurgie peut prendre plus de temps. Organiserles anesthésie dose en conséquence. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux de souris, pour éviter les yeux de sécher. </li><li> Nettoyez la zone rasée en utilisant le coton-tige trempé dans l&#39;éthanol préparé à l&#39;étape 1.6. Alternant les produits avec de la bétadine et de l&#39;alcool trois fois de façon circulaire tournante loin du site d&#39;incision prévue devrait être effectuée. Vous pouvez également utiliser ionophore comme désinfectant. </li><li> Faire une petite incision entre le quatrième mamelon et la ligne médiane avec une paire de ciseaux et un fourreau en insérant le coton-tige humidifié avec du PBS pH 7,4. </li><li> Utilisez une pince pour exposer le coussinet adipeux mammaire. Observez le coussinet adipeux par sa couleur blanche. </li><li> Pressez le coussinet adipeux avec l&#39;autre pince de sa base; ce faisant, d&#39;exposer pleinement le coussinet adipeux (Figure 1B) pour effectuer facilement des injections. </li><li> Homogénéiser le mélange de cellules par pipetage de haut en bas. Aspirer doucement 50 pi de suspension cellulaire dans une seringue à insuline et les injecter danscoussinet adipeux mammaire en maintenant l&#39;aiguille horizontalement. Confirmez injection réussie en vérifiant gonflement du coussinet adipeux. </li><li> Relâchez le coussinet adipeux doucement. </li><li> Suturer l&#39;incision en utilisant un pilote de l&#39;aiguille. Faire trois jets en tournant la suture autour du conducteur d&#39;aiguille dans le sens horaire, dans le sens horaire et anti-sens horaire. Deux noeuds par suture doivent être utilisés. NOTE: Assurez-vous que les nœuds sont serrés contraire souris peuvent ouvrir les sutures. </li><li> Après la chirurgie, injecter un analgésique, comme Temgesic à 0,05-0,1 mg / kg de poids corporel, voie sous-cutanée afin de soulager la douleur. </li><li> Ne pas laisser les animaux sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient conscience et maintiennent décubitus sternale. Placez tous les animaux dans différentes cages jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient complètement rétablis. </li><li> Pour maintenir la stérilité, utiliser des cages autoclaves et de l&#39;eau. Modifiez les cages tous les trois jours pour garder l&#39;atmosphère propre. </li></ol> 3. prélèvements d&#39;organes pour l&#39;analyse <ol><li> A lajour de la récolte, 8 semaines après l&#39;implantation des cellules, 15 ml de remplir des tubes à centrifuger coniques avec 3 ml de solution de Bouin pour chaque souris. En outre, utiliser deux 15 ml tubes remplis de 5 ml de solution de formol par souris. </li><li> Anesthésier les animaux par injection de xylazine / kétamine, à une dose de 10 mg / kg 100 mg / kg par voie sous cutanée de poids corporel. Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;animal perd pied retrait de pincement réflexe. </li><li> Fixer l&#39;animal avec des aiguilles sur une base. Faire une longue incision verticale de la ligne médiane avec des ciseaux. Faire deux incisions horizontales juste en dessous de la jambe avant et au-dessus la jambe arrière. Exposer la tumeur en épinglant la peau à la base. Mesurer le volume de la tumeur en utilisant un pied à coulisse. </li><li> Dissocier la tumeur de la peau avec des ciseaux. Aligner congeler une partie de la tumeur dans de l&#39;azote liquide pour l&#39;isolement d&#39;ARN. Placez l&#39;autre partie, dans le tube de centrifugeuse conique rempli avec du formol pour effectuer immunohistochimie suivant la paraffine. </li><li> Doucement prendre les poumons. Placez lepoumon gauche dans la solution de Bouin. Conserver le poumon en solution pendant 3 jours. Observez foyers métastatiques superficielle clairement à l&#39;oeil nu. En option, placez le poumon droit dans le formol de vérifier micrométastase utilisant l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E) coloration. REMARQUE: Bien, métastases pulmonaires fréquemment observé dans le cancer du sein, on peut aussi vouloir recueillir des os, le foie, le cerveau et la rate d&#39;analyser les métastases. Les cellules à la surface métastatique sont plus denses et morphologiquement différentes et peuvent donc être facilement distinguées de tissu pulmonaire. </li><li> Un jour après la récolte, aspirer la solution de formaline à partir de tubes de 15 ml et le remplacer par 70% d&#39;éthanol. Incluez les tissus en paraffine et effectuer des études d&#39;immunohistochimie. </li><li> Pour l&#39;analyse de sang, ouvrir la cavité de la poitrine avec des ciseaux. Retirer 450 ul de sang par ponction cardiaque. Placer l&#39;échantillon de sang dans un tube de microcentrifugation contenant 50 ul de citrate de sodium à 3,2%. Après le sang est collecté, le tourner à 2000 g pendant 10 kmn. Stocker les échantillons de plasma à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. NOTE: Il existe plusieurs autres techniques de collecte de sang couramment utilisés dans la pratique 20 et la technique qui doit être utilisé dépend de la configuration expérimentale et le choix de scientifique. Si l&#39;échantillon de sang ne est pas nécessaire, euthanasier l&#39;animal selon le protocole animale ou selon les directives de l&#39;institution. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Injection orthotopique de cellules de cancer du sein est un excellent modèle pour l&#39;étude de tous les aspects de la croissance du cancer. L&#39;implantation de ces cellules dans le coussinet adipeux mammaire de la souris doit être réalisé avec soin afin d&#39;éviter une variation dans la croissance tumorale. Plus important encore, l&#39;injection de la même quantité de cellules de chaque souris est cruciale. Pour ce faire, il faut trypsiniser les cellules rigoureusement sans affecter la viabilité des cellul...

Le cancer est une maladie très complexe qui a fait l&#39;objet d&#39;études pour les cours des siècles. Le cancer du sein est le type de cancer le plus fréquent; il se produit principalement chez les femmes, mais peut également se produire sporadiquement chez les hommes 27. La maladie est principalement causée par la perte de mécanisme de contrôle de la division cellulaire de direction qui à son tour conduit à une croissance infinie de cellules dans le corps. Ces dysfonctionnements peuvent être causés par plusieurs mécanismes: d&#39;abord, les cellules saines ont besoin de signaux provenant des cellules voisines de croissance afin de proliférer tandis que les cellules cancéreuses de faire leurs propres facteurs de croissance et d&#39;augmenter l&#39;expression de récepteurs de facteurs de croissance permet d&#39;obtenir un taux de prolifération plus élevé 1; d&#39;autre part, les cellules cancéreuses sont moins sensibles à des signaux anti-prolifératifs 8; troisièmement, pour équilibrer le nombre de cellules dans la mort des cellules du corps est également nécessaire; cependant, les cellules cancéreuses se échappent de la mort cellulaire programmée, appelées apoptose 14; quatrième, cellules adhèrent à des matrices extracellulairespour survivre, mais les cellules tumorales peuvent se développer sans la nécessité de l&#39;attachement et de montrer une résistance à anoïkis 19; cinquième, l&#39;activation de la télomérase contourne le raccourcissement des telomeres et empêche la sénescence réplicative 21; last but not least, en sautant du contrôle de la qualité de l&#39;ADN suite aux résultats de la mitose dans le contenu génétique altérée 15,16. Afin d&#39;identifier les oncogènes ou suppresseurs de tumeurs qui jouent un rôle dans cette prolifération dérégulée, des expériences de croissance tumorale chez la souris sont cruciales. La croissance de la tumeur primaire ne est généralement pas la principale cause de décès. La migration des cellules cancéreuses à partir du site primaire à un site secondaire, appelé métastase, est la principale cause de décès dans la plupart des 22 patients atteints de cancer. Metastasis implique invasion des cellules tumorales, intravasation, transitant par la circulation, en évitant une attaque immunitaire, extravasation et la croissance au niveau du site secondaire. À la transition épithéliale mésenchymateuses (EMT) est un processus clé dansmétastases et implique un interrupteur dans les profils d&#39;expression génique des cellules produisant de la motilité supérieur et envahissant, qui sont des pré-requis pour la cellule de métastases 12. Comme le processus cancéreux est la résultante d&#39;une combinaison de différentes actions, y compris les interactions réciproques entre les cellules cancéreuses, les cellules stromales et les cellules pro- et anti-inflammatoires, une approche in vitro pour le cancer souvent ne fournit pas un aperçu complet dans le processus cancéreux. De même, les traitements anticancéreux impact de la vascularisation de la tumeur ne peuvent souvent pas être étudiés in vitro, ainsi l&#39;utilisation de in vivo approche est inévitable. Pour étudier la progression du cancer du sein, différentes méthodes expérimentales ont été développées. Le modèle le plus largement utilisé est l&#39;injection sous-cutanée de cellules de cancer du sein chez des souris 5. Dans ce dispositif expérimental, le chercheur peut présenter une large gamme de modifications à une lignée cellulaire de choix in vitro (à savoirla régulation positive, la régulation négative des protéines) et injecter les cellules sous la peau. Bien que ce procédé est simple et le procédé d&#39;injection est simple sans qu&#39;il soit nécessaire d&#39;effectuer une chirurgie sur la souris, le site où la tumeur est injecté ne représente pas l&#39;environnement de la tumeur mammaire locale et l&#39;absence de cet environnement peuvent entraîner le développement du cancer du sein qui diffère de celle observée en pathologie humaine. En second lieu, des souris génétiquement modifiées sont fréquemment utilisés comme un outil pour étudier in vivo la progression du cancer du sein. Dans ce modèle, l&#39;oncogène (par exemple PyMT, Neu) expression est entraînée par un promoteur spécifique de tissu mammaire conduisant à la formation de l&#39;art de la tumeur mammaire spontané. Ce dispositif expérimental est utile d&#39;étudier l&#39;aspect de traitement de la maladie par l&#39;injection de drogues ou d&#39;anticorps tout en vérifiant la taille de la tumeur dans le temps 3. Toutefois, la reproduction de ces souris avec d&#39;autres souches de souris déficientes ou mutés dans un gène d&#39;intérêt pourrait aussi donner insroits sur le rôle des protéines différentes de la croissance de tumeur du sein 24. L&#39;inconvénient de ce modèle est qu&#39;il est sujet à des variations dans la taille de la tumeur et le nombre. En outre, le niveau d&#39;expression du transgène dépend du site d&#39;intégration dans le génome et peut changer d&#39;une souche de souris à l&#39;autre 4. Dans ce modèle, l&#39;expression du transgène peut être réalisée par toutes les cellules à l&#39;origine épithéliale alors que dans les maladies humaines, seule une sous-population de cellules expriment l&#39;oncogène ou réguler à la baisse des niveaux de 26 suppresseurs de tumeurs. Pour étudier la métastase des cellules de cancer du sein peuvent également être injectés par voie intraveineuse (appelé métastase un modèle expérimental) 25. Cependant, cette approche ne récapitule le processus métastatique partiellement; il contourne la nécessité pour les cellules tumorales à envahir et intravasate, et commence à partir du moment où les cellules tumorales sont facilement présents dans la circulation. Dans notre travail, nous utilisons une injection orthotopiqueion modèle pour étudier l&#39;implication de gènes d&#39;intérêt dans la progression du cancer du sein 13. Nous surexpriment la protéine dans les cellules cancéreuses du sein humain et de les injecter dans le coussinet adipeux mammaire de souris NOD / SCID gamma (NSG) souris. Ce procédé est avantageux à bien des égards: il permet des modifications génétiques très rapides et diversifiés dans la lignée cellulaire injecté, il couvre l&#39;ensemble du processus de la progression du cancer du sein de la croissance de la tumeur primaire à des métastases dans les sites pathologiquement pertinentes, et il fournit également un bon modèle expérimental pour étudier l&#39;impact des traitements thérapeutiques à des stades précoces ou avancés de la maladie. En outre, l&#39;utilisation de ce modèle ne peut étudier le rôle de stroma par rapport à des protéines dérivées de cellules cancéreuses dans la progression de la maladie en utilisant des souris ou des cellules génétiquement modifiées. Bien que les injections sous-cutanées sont plus faciles à réaliser, des modèles orthotopiques donnent naissance à une population de cellules cancéreuses plus tumorigène et métastatique plus. Ainsi, les résultats obtenus au moyen de l&#39;injection sous-cutanées pourrait être soit de faux négatifs ou de faux positifs 6,17 encourager l&#39;utilisation de modèles orthotopiques pour étudier la croissance de la tumeur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1093">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:185px;">Name of material/equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:95px;">Catalog number</td>
			<td style="width:641px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT10132</td>
			<td>Used for investigating the metastasis on lungs</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>Used to fix the tissues</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Cells can be resuspended in matrigel for injection</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mosquito forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>Used for stiching</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Angled forceps</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>72991-4c</td>
			<td>These make the exposure of mammary fat pad easier</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scissors</td>
			<td>B Braun Medicals</td>
			<td>BC056R</td>
			<td>Used to cut open the mice</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Straight forceps</td>
			<td>B Braun Medicals</td>
			<td>BD025R</td>
			<td>This is used to open up the skin to expose mammary fat pad</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NOD scid gamma mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>005557</td>
			<td>Experimental animal used for experiment</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MDA-MB-231</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92020424</td>
			<td>Experimental cells used for injections</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Oculentum simplex</td>
			<td>Teva Pharmachemie</td>
			<td></td>
			<td>Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Betadine</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>19-898-859</td>
			<td>Ionophore, used to disinfect the surgical area</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Xylazin/Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251, K2753</td>
			<td>Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Temgesic</td>
			<td>Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td>Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Life sciences</td>
			<td>11995</td>
			<td>For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Buffered sodium citrate</td>
			<td>Aniara</td>
			<td>A12-8480-10</td>
			<td>Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.

<html> la croissance du cancer du sein peut être étudiée chez la souris en utilisant une grande variété de modèles. La manipulation génétique des cellules de cancer du sein peut fournir des indications sur les fonctions des protéines oncogènes impliqués dans la progression ou de l&#39;aide à découvrir de nouveaux gènes suppresseurs de tumeur. En outre, l&#39;injection des cellules cancéreuses dans des souris avec différents génotypes peut fournir une meilleure compréhension de l&#39;importance du compartiment stromal. De nombreux modèles peuvent être utiles pour enquêter sur certains aspects de la progression de la maladie, mais ne ont pas récapituler l&#39;ensemble du processus cancéreux. En revanche, les cellules de cancer du sein pour la prise de greffe du coussinet adipeux mammaire de souris meilleures récapitule l&#39;emplacement de la maladie et la présence du compartiment stromal approprié et donc de meilleurs imite maladie cancéreuse humaine. Dans cet article, nous décrivons comment implanter des cellules de cancer du sein chez des souris orthotopique et expliquer comment collecter les tissus pour analyser la: 14px; line-height:. 28px; &quot;&gt; milieu de la tumeur et des métastases aux organes distants utilisant ce modèle, de nombreux aspects (la croissance, l&#39;angiogenèse et les métastases de cancer) peuvent être étudiés tout simplement en fournissant un environnement approprié pour les cellules tumorales de croître.

L&#39;application réussie du «modèle de cancer du sein orthotopique&quot; est basé sur une bonne injection de cellules dans le coussinet de graisse mammaire. Erreurs expérimentales telles que inoculation imprécis de cellules ou de fuite peuvent conduire à des variations de la taille tumorale, ou même l&#39;absence d&#39;une tumeur qui conduit à la formation d&#39;une structure en regardant semblable à un coussinet adipeux mammaire injecté avec un tampon de contrôle (figure 2A). Le taux de cr...

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Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Le cancer est une maladie complexe qui est influencé par les tissus entourant la tumeur ainsi que locale pro- et anti-inflammatoires des médiateurs. Par conséquent, les modèles d&#39;injection orthotropes, plutôt que sous-cutanées modèles peuvent être utiles pour étudier la progression du cancer d&#39;une manière qui imite mieux de pathologie humaine.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

78.3K vues.  Leiden University Medical Center.  Le cancer est une maladie complexe qui est influencé par les tissus entourant la tumeur ainsi que locale pro- et anti-inflammatoires des médiateurs. Par conséquent, les modèles d'injection orthotropes, plutôt que sous-cutanées modèles peuvent être utiles pour étudier la progression du cancer d'une manière qui imite mieux de pathologie humaine. 

Vidéo: Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

Exécution et traitement des FNA coussinet adipeux antérieure de l&#39;amyloïde

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Recherche

Médecine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Une In Vitro Système d&#39;étude dormance tumorale et le commutateur à la croissance métastatique

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Un modèle de la vessie orthotopique tumorale et l&#39;évaluation de Sarna traitement intravésicale

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Transplantation orthotopique aortique chez la souris pour l&#39;étude des maladies vasculaires

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Trois Cultures dimensionnelles: un outil pour étudier l&#39;architecture normale Acinaire vs transformation maligne des cellules mammaires

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of life and survival of breast cancer patients. In this paper a new approach for the detection of breast cancer is described, based on tracking the mammary architectural elements using diffusion tensor imaging (DTI). 
The paper focuses on the scanning protocols and image processing algorithms and software that were designed to fit the diffusion properties of the mammary fibroglandular tissue and its changes during malignant transformation. The final output yields pixel by pixel vector maps that track the architecture of the entire mammary ductal glandular trees and parametric maps of the diffusion tensor coefficients and anisotropy indices. 
The efficiency of the method to detect breast cancer was tested by scanning women volunteers including 68 patients with breast cancer confirmed by histopathology findings. Regions with cancer cells exhibited a marked reduction in the diffusion coefficients and in the maximal anisotropy index as compared to the normal breast tissue, providing an intrinsic contrast for delineating the boundaries of malignant growth. Overall, the sensitivity of the DTI parameters to detect breast cancer was found to be high, particularly in dense breasts, and comparable to the current standard breast MRI method that requires injection of a contrast agent. Thus, this method offers a completely non-invasive, safe and sensitive tool for breast cancer detection.

We describe how to obtain parametric and vector maps of the diffusion tensor of the breast using magnetic resonance imaging. The protocol and final output following imaging processing are tailored for tracking breast architectural features and detecting breast malignancy.

Suivi Les caractéristiques architecturales mammaires et la détection de cancer du sein avec résonance magnétique Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Évaluation de la viabilité de la graisse humaine injection dans des souris nude avec Micro-tomodensitométrie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...