Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les perturbations dans les réseaux de signalisation qui peuvent causer la croissance du cancer ou le développement d’une résistance à des thérapies spécifiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut fournir une rétroaction rapide et fiable sur l’état de phosphorylation de plusieurs réseaux qui sont fréquemment déréglementés dans le cancer. L’implication de cette technique s’étend à la thérapie des cancers pharmacorésistants parce que l’identification des changements et des modifications post-translationnelles peut élucider des changements dans l’activité de voie de transduction de signal.
Bien que cette technique soit utilisée sur la phosphorylation, elle peut également être utilisée pour examiner d’autres modifications post-translationnelles telles que la glycosylation et l’ubiquité. Commencez par rincer soigneusement les cellules de culture pendant la nuit trois fois avec 10 millilitres de PBS en prenant soin d’enlever tous les PBS après le dernier lavage. Ensuite, ajoutez le volume approprié de tampon de lyse de la trousse d’analyse des protéines et utilisez un grattoir cellulaire pour détacher les cellules.
Triturer la solution cellulaire résultante environ 10 fois avant de transférer au moins une fois 10 à la septième cellule à un tube de 1,5 millilitre. Incuber les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec des secousses. Chargez ensuite le lysate dans une seringue munie d’une aiguille de calibre 27 et aspirez et distribuez l’échantillon 10 fois pour cisailler les membranes cellulaires.
Lorsque les membranes cellulaires ont été complètement perturbées, centrifugez le lysate et transférez le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre pour une quantification totale ultérieure des protéines selon les protocoles standard. Pour effectuer un test de phosphokinase humaine, utilisez d’abord des pinces à pointe plate pour placer une membrane de tableau dans chaque puits d’un multi-plateau de quatre puits contenant deux millilitres de tampon de tableau fraîchement préparé un par puits avec le nombre de membranes orientées vers le haut. Lors de la submersion, le colorant sur la membrane disparaîtra.
Couvrir le plateau d’un couvercle et incuber les membranes sur un shaker de plate-forme berçante pendant 60 minutes à température ambiante. Pendant cette incubation de blocage, diluer chaque échantillon de lysate à une concentration de 50 à 100 microgrammes de protéines dans un volume maximum de 334 microlitres de tampon de lyse et porter le volume final de l’échantillon de protéines extraites jusqu’à 1,5 millilitres avec tampon de tableau frais. Ensuite, aspirez soigneusement le tampon de tableau de chaque puits du multi-plateau et incuber les membranes avec 1,5 millilitres d’échantillon de protéines par puits pendant la nuit à deux à huit degrés Celsius sur un shaker plate-forme à bascule.
Le lendemain matin, transférez soigneusement chaque tableau dans des contenants en plastique individuels contenant 20 millilitres de tampon de lavage pour trois lavages de 10 minutes sur une plate-forme de basculement à température ambiante. Après le dernier lavage, ajouter 20 microlitres du cocktail d’anticorps reconstitué approprié à deux millilitres de tampon réseau, deux par puits, et éponger soigneusement le bord inférieur de chaque membrane sur une serviette en papier pour enlever tout tampon de lavage excédentaire. Ensuite, placez chaque tableau dans le puits approprié du plateau d’anticorps et couvrez le plateau pour une incubation de deux heures à température ambiante sur une plate-forme de basculement.
À la fin de l’incubation, transférez soigneusement chaque tableau dans un nouveau contenant en plastique de huit par 11 centimètres contenant 20 millilitres de tampon de lavage pour trois lavages de 10 minutes comme nous venons de le démontrer. Après le dernier lavage, ajouter un millilitre d’une solution appropriée de peroxyde de radis streptavidine à chaque puits du plateau multi-puits et remettre les membranes à leurs puits appropriés pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, placez chaque membrane entre deux morceaux de papier filtre de cinq millimètres pour éliminer tout excès de tampon et incuber les membranes séchées avec une solution appropriée de détection du radis de cheval pendant trois minutes.
Placez ensuite les membranes dans des protecteurs individuels de feuilles de plastique transparents pour une imagerie ultérieure. Pour évaluer l’expression de kinase tyrosine récepteur dans chaque échantillon, ouvrez les images dans un programme approprié de traitement d’image tel que l’image J et sélectionnez Modifier et inverser à partir des menus de dropdown appropriés pour inverser les taches noires sur le fond blanc de l’image à des taches blanches sur un fond noir. Ensuite, utilisez l’outil Ovale pour encercler une paire de points blancs sur la tache de point et sélectionnez Analyser et mesurer pour ouvrir automatiquement une nouvelle fenêtre affichant les valeurs pour la zone sélectionnée.
Placez ensuite le point de la flèche de la souris au centre de l’ovale et faites glisser la zone circulaire autour de la zone de point suivante jusqu’à ce que tous les points d’intérêt aient été mesurés. Dans cette expérience représentative, les effets de la résistance d’inhibiteur de kinase de tyrosine sur des voies de transduction de signal ont été analysés dans un contrôle dans trois lignes résistantes d’inhibiteur de kinase de tyrosine. Six protéines de phospho avec l’activité différentielle ont été choisies et l’intensité relative a été déterminée pour plusieurs protéines candidates dans chaque ligne cellulaire.
Comme le démontre la carte thermique, une lecture semi-quantitative sur les changements dans la phosphorylation protéique d’importantes protéines de transduction du signal pourrait alors être générée. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de commencer avec des cellules saines et activement diviser que les facteurs de stress peuvent induire des changements dans l’activité de la voie de transduction du signal. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le PCR numérique et l’immunoblotting peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les changements dans la phosphorylation conduisent-ils à l’activation des facteurs de transcription?
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs en biologie du cancer pour explorer les changements fondamentaux dans la modification post-translationnelle des protéines conduisant à l’avènement de la médecine personnalisée pour les patients atteints de cancer. N’oubliez pas que travailler avec des lignées de cellules cancéreuses est extrêmement dangereux alors assurez-vous d’utiliser des techniques aseptiques, la prudence lors de l’élimination des objets tranchants et porter un manteau de laboratoire en tout temps.
